Abstract
בידודו של וירוסים ענקים הוא עניין רב בעידן החדש הזה של וירולוגיה, במיוחד מאז וירוסים הענקים אלה קשורים הפרוטיסטים. וירוסים ענקים עשויים להיות פתוגניים פוטנציאליים עבור מינים רבים של הפרוטיסטים. הם שייכים הסדר המתואר לאחרונה Megavirales. השושלת החדשה Faustovirus כי כבר מבודד דגימות שפכים הוא קרוב רחוק של נגיף קדחת החזירים אפריקה יונקים הפתוגן. וירוס זה הוא גם ספציפי לאותו המחשב שלה amoebal, vermiformis Vermamoeba, לפרוטיסטים נפוצים במערכות מי בריאות. זה חיוני כדי להמשיך לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להגדיל אוסף גנוטיפ שלה וללמוד הפאן הגנום שלו. פתחנו אסטרטגיות חדשות עבור הבידוד של זנים נוספים על ידי שיפור שימוש שילובי אנטיביוטיקה נגד פטריות על מנת למנוע זיהומי חיידקים ופטריות של שיתוף תרבות האמבה ו לטובת כפל הווירוס. גם אנחנו יישמנו starvatio חדשn בינוני לשמור V. vermiformis בתנאים אופטימליים עבור וירוסים שיתוף תרבות. לבסוף, השתמשנו cytometry זרימה במקום תצפית מיקרוסקופית, וזה זמן רב, כדי לזהות את השפעת cytopathogenic. השגנו שני בידודים ממדגמים ביוב, להוכיח את היעילות של שיטה זו, ובכך להרחיב את אוסף Faustoviruses, כדי להבין טוב יותר את סביבתם, סגולי המארח תוכן גנטי.
Introduction
גילוי וירוסים ענקים, במיוחד אלה השייכים לסדר Megavirales, שינה לחלוטין את עולם הווירוסים מבחינת גודל חלקיקים ואת המורכבות הגנום. הווירוסים היו בעבר חשבו להיות ישויות קטנות, ואת Mimivirus הופיע לשבור את כל הכללים. 1 נתוני metagenomic מצביעים על ההמצאות בכל המקום של וירוסים ענקים לא רק בסביבה, 2-5 אלא גם בבני אדם. 6 לכן, יש עדיין צורך לחפש וירוסים אלה בקנה מידה גדול. המגוון של וירוסים הענקים אלה הוערך באמצעות דגימה לא רק במגוון סביבות מימיות ומשקעים הקשורים בם ברחבי העולם, 7-11 אלא גם על ידי הקרנת מגוון של דגימות אנושיות 12,13 ו דגימות סביבתיות. 7,9 mimivirus polyphaga Acanthamoeba היה מבודד על-ידי שיתוף התרבות באמצעות הפרוטיסטים phagocytic, spp Acanthamoeba בעיקר. 14-16 אוסף שלם של וירוסים ענקים היה אז גםשבודד מארח לפרוטיסטים שצוין זה, מה שהפך את הקהילה המדעית להגביל הליך מחקר בידודה עבור spp Acanthamoeba. ברור הסתמכות זו על זן לארח אחת הביאה חלק גדול של וירוסים מתעלמים ממנה. עובדת הווירוס הענק, CroV, היה מבודד עם roenbergensis קפיטריה פרוטוזואה הימי הניע מאוד, 17,18 ממחיש את הצורך להשתמש במגוון רחב יותר של פרוטוזואה על מנת לגלות שושלות חדשות או משפחות של וירוסים ענקים. Reteno et al. הצליח לבחור פרוטוזואה אחר כמארחי תא אשר מעולם לא נעשה בה שימוש בעבר, ומבודד את שושלת אספר הקשורות החדשה של וירוסים ענקים (את Faustovirus בשם החדש). 19
בניסיון לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להרחיב את חברי שושלת ויראלי זה, שינינו נהלי הבידוד שלנו והשתמשנו בם כדי להקרין דגימות סביבתיות מסוגלות קצירת Faustoviruses החדש. לאחר מכן, אנותאר את הפרוטוקול כולו לאפיין את הבידודים החדשים. החוקרים העריכו vermiformis Vermamoeba, את לפרוטיסטים חסרת חיים השכיח ביותר בקרב בסביבות האדם, 20-22 שכבר משמש את בידודה של אבטיפוס Faustovirus הראשון E12. 19 זה לפרוטיסטים כרגע עדיין לארח ספציפי עבור Faustovirus. ידענו שאף אחד הווירוסים הענקים הידועים היה פתוגניים עבור אמבה זה, כי אף ניסיונות לגדל וירוסים ענקים אחרים במעבדה שלנו הראתה תמוגה אמבה או צמיחת ויראלי. מסיבה זו, אנו מאמינים כי V. vermiformis היא התמיכה הסלולרית הטובה ביותר והייחודית ביותר הידועים לבודד Faustoviruses חדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אוסף דוגמאות 1.
- אסוף 70 דגימות מסביבות ואזורים שונים. במקרה זה, השתמש בנוסחה הבאה: 5 דגימות המים המלוכלכים מהכפר סנט פייר דה Meyzoargues (צרפת), 15 דגימות מהאגם Parc Borely במרסיי (צרפת); 15 דגימות מי ים עם משקעים מן המפרצונים הסלעיים ב Samena במרסיי (צרפת), 25 דגימות מי נהר מהרי האלפים (צרפת), ולבסוף, 10 דגימות ביוב לה סיוטה (צרפת).
- דגימות וורטקס עבור המגון לפני יחסנו, למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ללא כל טיפול.
נוהל בידוד 2.
- מארח הכנת נהלי תרבות עיוורת חיסון לדוגמא
- השתמש V. vermiformis (זן CDC19) כתמיכת תא עבור שיתוף התרבות.
- שמירה על אמבות על 28 מעלות צלזיוס, בבקבוק תרבות 75 ס"מ 2 תאים עם 30 מ"ל של מדיום פרוטאז-peptone-תמצית שמרים-גלוקוז (PYG). אנא קרא רכב PYG בטבלת 1.
הערה: לאחר 48 שעות, אמבות הם לכמת ידי מגלשות ספירה באמצעות נורמליות לספור (למשל, Kovaslides). - קציר תאים בריכוז של 5 x 10 5 כדי 10 6 תאים / מ"ל, אמבות גלולה ידי צנטריפוגה ב 720 XG במשך 10 דקות.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה, מחדש להשעות גלולה אמבות ב 30 מ"ל של תמיסת מלח amoebal של עמוד סטרילי (PAS) טבלה 1. חזור על הליך שטיפה זו.
- Re- להשעות אמבות ב 30 מ"ל של מדיום רעב עם תערובת אנטיביוטיקה נגד פטריות בריכוז של כ 10 6 אמבה / מ"ל. המדיום הרעב הוא מדיום הישרדות של האמבה, מה שמאפשר את זה כדי להישאר בחיים ללא יצירת ביצי קיימא או כפל. בדקו רכב בטבלה 1.
הערה: תערובת סוכן מיקרוביאלית הכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ונקומיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל אימיפנם, 20 מיקרוגרם / מ"ל ciprofloxacin, 20 μg / ml דוקסיציקלין, ו -20 מיקרוגרם / מ"ל voriconazole. תמהיל זה שימש כדי להפחית את זיהום חיידקים ופטריות שיכולים להקטין או לשנות כפל ויראלי. - ישירות לחסן 25 μl של כל דגימה על monolayer אמבת 200 μl ב תחתית שטוחת צלחת 96-היטב לטובת דבקות האמבה לדגור על 30 מעלות צלזיוס בסביבה לחה (בסביבת לחה מורכבת הצבת רטייה רטובה בתוך השקית עם הצלחת על מנת למנוע אידוי). זהו-תרבות פרימו. השאר שתי בארות של אמבות ללא כל חיסון מדגם; זה משמש השליטה השלילית. דגירה במשך שלושה ימים פרימו-תרבות זו.
- שלושה ימים לאחר החיסון הראשונה, תת-תרבות צלחת פרימו-התרבות על אמבות טריות כמתוארת לעיל ללא כל תצפית מיקרוסקופית. דגירה את הצלחת החדשה במשך שלושה ימים תחת אותם התנאים כמו-תרבות פרימו.
- בצע את התרבות הסופית לאחר שלושה ימים אלה של דגירה באותו אופן כמו עבור הדואר תת תרבות primo- ו. דגירת התרבות הסופית במשך ימים. ואז להמשיך זיהוי.
- איתור של תמוגה ידי האוטומטית cytometry הזרימה
הערה: התרבות עיוורת בשילוב עם זרימת cytometry שונה ממערכת התקן הקודמת של בידוד. זה הוא רגיש יותר, מדויק אוטומטי. למטרות זיהוי, אנחנו מוחלים טכניקה חדשה שפותחה כדי לזהות תמוגה במהירות הגבוהה ביותר וללא השגחה מיקרוסקופית. טכניקה זו היא יתרון עבור דגימות הקרנה ויש לו רגיש יותר טוב שיטות ישנות. 7-9- השתמש צלחת 96-היטב של שיתוף התרבות הסופית לזהות תמוגה.
- הפעל את cytometer ולהפעיל מחזור נקי לשטוף כדי להשיג רעש רקע נמוך על פי הפרוטוקול של היצרן.
- הפעל את סמפלר התפוקה הגבוה (HTS) בשילוב עם זרימת cytometer לטעון דגימות באופן אוטומטי מהצלחת 96-היטב ולבצע רכישה אוטומטית לחלוטין בתוך 40 דקות Accordinז הפרוטוקול של היצרן.
- הגדרת HTS כדלקמן: נפח דגימה 150 μl, ערבוב נפח 50 μl, ערבוב מהיר 180, מספר תערובות 5, נפח כביסה בין כל μl מדגם 400, קצב זרימת 2.5 μl / sec, מספר האירועים שנרשמו 10,000.
- להעריך את בארות בקרה השליליות של שיתוף תרבות מייקרו-צלחת הגמר ראשון על מנת שער אוכלוסיית האמבה ולקבוע את אחוז צבאות תאים אלה על פי המאפיינים הפיסיים שלהם. הקפד בעלות אוכלוסייה הומוגנית אמבה ואוכלוסייה שנייה של אירועים נמוכים המתאים פסול ורעש.
הערה: הליך gating זו מייחד פסולת subcellular וגושי מתאים יחידים לפי גודל, מוערכים על ידי פיזור קדימה. לכן חשוב לקבוע את האחוז המדויק של כל אוכלוסייה באמצעות הליך gating הטוב ביותר האפשרי. אחוזים אלה עשויים להשתנות, במיוחד אם יש סוגים רבים של פרוטוזואה משמשים, ולכן חשוב תמיד להיות negativשליטה דואר, אשר ניתן להשתמש בהם כמו האוכלוסייה התייחסות שאר הדגימות. - הפעל את gating על ידי לחיצת מדגם רכישה.
- רשום את מספר אירועים לא פחות מ -10,000 אירועים.
- בתרגום אוכלוסיית אמבת עניין באמצעות החץ. זה איך להגדיר את השערים.
- לאחר gating, לתת את המקום HTS או לאתר את הצלחת על ידי לחיצה על 'הבית', ולאחר מכן להפעיל את הצלחת כולה באופן אוטומטי. בצע נתונים הרכישה וניתוח על פי הפרמטרים גודל ומבנה (בהתאמה, FSC (פיזור קדימה) ו SSC (פיזור צד)).
הערה: זיהוי אובדן אוכלוסיית האמבה מגודרת מסמן את הנוכחות של סוכן פתוגניים אחראי תמוגה אמבה. תמוגה פרוטוזואה קשורה לזיהום וירוס מזוהית עם סף תוכנן באופן שרירותי לתמס 50% מאוכלוסיית האמבה המגודרות על ידי המנתח ולעומת האוכלוסייה הלא הנגועה אותה משמשת כביקורת שלילית אמינה.
- מכתים מקדמיות לגלות את נוכחותם של ענק וירוסים
- לאחר זיהוי תמוגה ידי cytometry זרימה, פיפטה שיתוף תרבויות lysed להשעות את האמבות הנותרות. ואז ישירות cytocentrifuge 50 μl של השעיה ב 800 XG במשך 10 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, לתקן את השקופיות עם פתרון מתנול טהור. כתם השקופיות באמצעות מכתים מהיר מסחרי של Eosin / כחול מכתים Azur ו DAPI ולבחון תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 1,000X כדי לבדוק את קיומו של מפעלי וירוס.
- עבור מכתים מהיר, לצלול השקופיות לתוך תמיסת eosin הראשונה (4 שניות חזרו שלוש פעמים) ולאחר מכן לעבור ישירות לצלול מגלשות לתוך תמיסת תיקון הנוספת שהכילה הכחול Azur במשך 6 שניות, ולבסוף לשטוף את השקופיות עבור 45 שניות עם פתרון חיץ פוספט pH 7.2. השאירו את השקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להמשיך observatiעַל.
- עבור מכתים DAPI, פיקדון 15 μl של פתרון המניות המסחרי DAPI לשקופית היבשה הקבועה. להגן מפני אור מכן להמשיך תצפית.
- מיקרוסקופי אלקטרונים
- לאחר זיהוי הראשון בשקופיות, להעריך את הנוכחות של הנגיף הענק באמצעות תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים של תרבויות supernatant.
- הפקדה 5 μl של המדגם החיובי על הרשת-משוחרר הזוהרת. המתן כ 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- יבש את הרשת בזהירות פיקדון עבורו טיפה קטנה של molybdate אמוניום 1% למשך 10 שניות. השאר את הרשת להתייבש במשך 5 דקות.
- המשך במיקרוסקופ אלקטרונים ב 200 keV.
- מניחים את הרשת על בעל; להציג המחזיק לתוך מיקרוסקופ. בדוק את סקירת הוואקום על ידי לחיצה על הסמל המקביל. שסתום לסגור ולהתחיל התבוננות בכל גודל נקודה 5, וגדלה של x 25,000.
- מדוד את הווירוס הענק באמצעות ImageJ או ישירly על המיקרוסקופ שימוש באפשרות המידה של המיקרוסקופ ממוקם על מסך הרכישה.
הערה: לסווג את המדגם לתוך הקבוצה Faustovirus עם גודל קפסיד של כ 200 ננומטר.
- ביולוגיה מולקולרית
הערה: בעקבות זיהוי זה, בדיקות ביולוגיה מולקולרית היו מכריעים עבור אישור כדי להבדיל Faustovirus מ Marseillevirus, אשר יש באותו גודל קפסיד והמראה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים, למרות שאין להם את אותה הספציפיות המארח. Marseillevirus לא יכול לצמוח על Vermamoeba, את Faustovirus ספציפי Vermamoeba וכל הניסיונות לגדל אותו על אמבה אחרת כגון Acanthamoeba נכשלו עד כה. העיצוב והיישום של מערכות פריימר / בדיקה הספציפיות מופיעות בעבודות של Reteno et al. מופעל סיווג ראשוני מדויק יותר של הווירוסים חדשים מבודדים באמצעות הגברת רצף של גני ויראלי.- לְשֶׁעָבַרדנ"א בדרכי ממדגמים התרבות החיוביים באמצעות מערכת חילוץ אוטומטית על פי הפרוטוקול של היצרן.
- בצע בזמן אמת PCR להשתמש thermocycler כמתואר Reteno et al. 19
- רצף באמצעות אותו פריימרים ששימשו הגברה. השתמש פריימרים מיקוד למקטע RNA פולימראז מכוונת DNA 1 הגן: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT גת GGT CAC ATA G-3 '(קדימה) Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3 "(הפוכה) עם החללית Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-טמרה.
4. הפקת וירוס, רצף טיהור הגנום
- תת תרבות אמבת וירוס אחד עבור שיבוט דילול נקודת סיום.
- לייצור: להכין 20 צלוחיות המכיל 30 מ"ל של PYG, 10 מ"ל של vermiformis Vermamoeba ו -5 מ"ל של הנגיף מבודד כבר הועבר מבארות צלוחיות קטנות.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד מלאתמוגה של אמבה. שים לב כל יום על ידי מיקרוסקופ אופטי הפוך עד שכל האמבה הם lysed.
- לאחר תמוגה שלם, ברכה כל הצלוחיות לתוך נמען אחד. מסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר לחסל פסולת.
- הפעל את הטיהור ידי ultracentrifugation ב 89,800 XG במשך 75 דקות. הקפד לכייל את המשקל של הצינורות לפני תחילת צנטריפוגה.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant מצינור כל על ידי שאיפה מחדש להשעות הגלולה ב PAS עם אותו הנפח משמש לכיול, לפני חזרה צנטריפוגה.
- כנ"ל, להסיר את supernatant מחדש להשעות את כל כדורי ב 1 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
- לטהר את הנגיף מיוצר, באמצעות סוכרוז 25% (27.5 גרם של סוכרוז 100 מ"ל של PBS, מסונן על מסנן 0.22 מיקרומטר).
- השתמש 8 מיליליטר של סוכרוז 2 מיליליטר של השעית ויראלי. צנטריפוגה ב 89,800 XG במשך שעה 1 15 דקות. מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המערכת למדה בכתב היד הזה תוקפת הוכחה של מושג על ידי בידוד השני Faustoviruses החדש. מבין 70 הדגימות שנבדקו, שני פרקים לתמס אותרו, בניגוד לביקורות השליליות האמינות שלנו. השליטה השלילית עבור תמוגה הכילה אוכלוסיית אמבת 86%. לעומת זאת, דגימות חיוביות (ST1 עבור סנט פייר דה Meyzoargues), ו (LC9 למדגם לה סיוטה 9) הראו ירידה דרמטית אמבות מגודרת; יותר מ -60% של אמבות היו lysed עם האחוז הגבוה ביותר של פסולת. תוצאות חזקות אלה של שלב האיתור של השיטה שלנו מיוצגים באיור 1. Eosin / כחול מכתים Azur ו DAPI אישר את נוכחותו של מפעלים וירוס בתוך אמבות, שמוצג באיור 2. מיקרוסקופית אלקטרונים חשף את המראה האופייני של Megavirales עם קפסיד icosahedral , 200 ננומטר בגודל, סיבים חסרים (איור 3). ה- PCR ספציפי לאיתור וירוסים ענק, PArticularly עבור Faustovirus, אשר הממצאים הקודמים שלנו. זה חייב להיבדק על ידי PCR כדי לחסל תוצאות מעורפלות או בידודים מזוהמים. וירוסים היו משובטים, פיק מטוהר עבור רצף הגנום כולו. הגנום של Faustoviruses המבודד החדש מוגש תחת Bioproject הבא: PRJEB11169. Primo-, משנה, ואחרונה-התרבות לא הראתה פטרייתי או זיהום חיידקים, תוך העדפת כפל ויראלי. Vermiformis Vermamoeba נסבל התערובת אנטי פטרייתי אנטיביוטיה. הדבר זה היה ברור הביקורת השלילית של אמבות שבו לאחר שלושה ימים, התרבות הסופית הכילה למעלה מ -80% אמבת חיים. Vermamoeba גם ספק תא מארח טוב לבידוד, ייצור עומס נגיפי משמעותי לאחר תמוגה.
איור 1: זיהוי תמוגה ידי זרימה אוטומטית cytometry represen הנתונים.t את שני המדגמים, אשר שנקטפו Faustovirus והראה תמוגה אמבה. אוכלוסיית אמבת חיים שמשה כביקורת שלילית. שני שערים נועדו בעלילת FSC-SSC, פוטנציאל מתאים התאים ופסולת. לאחר שיתוף התרבות הסופית, אוכלוסייה גדולה של פסולת הפגינה הנוכחות של זיהום פוטנציאלי הדגימות (ST1 ו LC9) (B), לעומת השליטה השלילית אשר לא הראתה שינויים משמעותיים באוכלוסיות המגודרות (א). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מפעלים וירוס טיפוסי לאיתור וירוסים ענק כלשהו Eosin / כתמים כחולים Azur ו DAPI מכתים בקרה שלילית מראה את V.. גרעין vermiformis באמצעות Eosin / כחול Azur מכתים(א), מכתים DAPI (ד) (חיצים מצביעים על הגרעין של האמבה). גדלה ב 1,000X. (B, C): Eosin / מכתים Azur כחול בהגדלה 1,000X של V. vermiformis נגוע LC9 Faustovirus. חצים מצביעים על הגרעין של האמבה הנגועה circularized, מפעלי וירוס מסומנים בכוכבית. (E, F) מכתים DAPI בהגדלה 1,000X של V. vermiformis נגוע LC9 Faustovirus. חצים להצביע על מפעלים וירוס ב -8 שעות לאחר ההדבקה (E), ו -12 שעות לאחר ההדבקה (F). סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: micr מכתים שליליograph. מכתים שלילי של השעית ויראלי לאחר זיהוי תמוגה, מראה את Faustovirus החדשה שנתגלתה עם המראה האופייני של Megavirales, עם קפסיד icosahedral וכן גודל כולל של 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| רכב PYG | כמיות |
| peptone Proteose | 20 גרם |
| תמצית שמרים | 2 g |
| MgSO 4. 7H 2 O | 0.980 גרם |
| CaCl 2 | 0.059 גרם |
| נתרן ציטרט. מימי | 1 גרם |
| פה (4 NH) 2 (SO 4) 2 x 6 H 2 O | 0.02 גרם |
| גלוקוז | 18 גרם |
| מים מזוקקים במשך | 1 L |
| התאם את ה- pH 6.8 עם HCl או KOH. | |
| 15 דק 'החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס. | |
| בינוני רעב | כמיות |
| תמצית שמרים | 2 g |
| גלוקוז | 18 גרם |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O | 0.02 גרם |
| PAS (כמפורט להלן) | 1 L |
| מסונן על 0.22 מ"מ | |
| פתרון PAS | כמיות |
| KH 2 PO 4 | 0.136 גרם |
| Na 2 HPO 4 | 0.142 גרם |
| B פתרון PAS | כמיות |
| MgSO 4 .7H 2 O | 4.0 מ"ג |
| CaCl 2 .2H 2 O | 4.0 מ"ג |
| NaCl | 0.120 גרם |
| 10 מ"ל של כל פתרון ו- B, מתווספים לתוך 1 ליטר של מים מזוקקים. | |
מתכוני פתרון: טבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האפשרות Faustovirus יכול להיות החבר הראשון של משפחה חדשה Megavirales קרוב ASFV הוצע לראשונה על ידי Reteno et al., 19 אבל כמה הבדלים עדיין ניתן להבחין. נראה ברור אם Faustovirus צריך להצטרף למשפחת Asfarviridae או שמא במקום ליצור משפחה ויראלי המשוערת חדש. בעיה זו תדרוש חקירה נוספת, בפרט אפיון מקיף יותר של המורפולוגיה שלה, מגוון מארח, מחזור שכפול ורפרטואר גן. עוד גנוטיפים Faustovirus צריכים להיות מבודדים על מנת להרחיב את הגנום המחבת כדי להבין טוב יותר את המקורות והקרובים של קבוצה ויראלי או מש'. הטכניקה שבה השתמשנו, אפשרה לנו להמשיך לבודד חברים חדשים של המשפחה החדשה פוטנציאל זה. טכניקה זו בשילוב עם טכניקת שיתוף התרבות השונה במקצת, אשר ממשמשת צעד העשרה איתור טוב יותר. הזמן הנדרש על ידי cytometry זרימה לרכישת נתונים עבור hundreds של דגימות אינו עולה על חצי שעה, וזה יתרון גדול לעומת מערכת שיתוף תרבות התקן הקודמת. 9 הטכניקה היא הרבה יותר טובה מאשר מערכת התקן הקודמת, בעיקר מבחינת רגישותו הגבוהה כימות מדויקת.
מבין 70 הדגימות השיקו, אנחנו מבודדים שני Faustoviruses רחוק יותר מן הביוב, אשר יכול לספק מידע על סגולי או אקולוגי הסביבתיים של וירוס זה. ואכן, את הספציפיות של Faustovirus עבור vermiformis לפרוטיסטים Vermamoeba, 19 וכן הסיווג החדש של HcDNAV בין Asfarviridae 23 והעובדה וירוס זה מדביק זנים רבים של spp dinoflagellate Heterocapsa אבל אינו מסוגל להדביק סוגים אחרים של פיטופלנקטון 24 מצביע על נוכחות של-סגולי מארח בין Asfarvirus או והקרוב שלה.
ממצאים אלו מרמזים על שימוש תומך הסלולר החדש מתנהגזה מארחים ספציפיים או שאינם ספציפיים, אשר עשוי להכיל סוגים כאלה של וירוסים. הטכניקה שלנו ניתן להתאים סוגים אחרים של הפרוטיסטים בתנאים שונים. סימני השיטה שלנו להתקדם מבחינת טכניקות בידוד והתרבות ויראלי. לסיכום, צעדים עשרה בתערובת אנטיבקטריאלי נגד פטריות המתאימה ביותר הם קריטיים עבור החיסול של כל זיהום חיידקים או פטרייתי אפשרי. בינוני הרעב שלנו הוא הפתרון הטוב ביותר לשמירה על האמבה את התנאים הטובים ביותר עבור שיתוף תרבות, בעוד בינוני PAS המשמש בתרבות שגרה שנראה מתאים spp Vermamoeba, כי יצירת ביצי קיימא מהר נצפו לאחר 24 שעות של דגירה. זה היה צעד גדול לקראת תנאי תרבות האופטימליים שבו טכניקות קודמות נשמעו עד כה נכשלו. על מנת לקבל את התוצאות הטובות ביותר באמצעות פרוטוקולי התרבות המתוארים כאן, מומלץ להשתמש אמבות טריות מסוגלים phagocytosis. תערובת האנטיביוטיקה נגד פטריות צריכה להיות רעילה עבור הפרוטיסטים ; ומכאן, מומלץ לבדוק את הכדאיות של אַבחַי בשימוש על התערובת. יש לעקר כל החומרים המשמשים. העבודה צריכה להתנהל בתוך כיתה פוסט מאובטח מיקרוביולוגית שנייה כדי למנוע זיהום סביר. פעמים דגירה ואת שלושת השלבים של תרבות יש לכבד כמתואר. זמן עיבוד זרימת איתור cytometry ניתן לכייל בהתאם היצורים שנחקרו. שינוי קל באוכלוסייה מן gating המקורית אפשר לראות, אבל זה תלוי הבקרה השלילית האמינה כאוכלוסיית התייחסות.
חיידקים רבים עמידים שניתן למצוא בתרבות והם פתוגנים עבור אמבה יכולים איכשהו להגביל שיטת הבידוד ויראלי שלנו, שבו אנחנו יכולים להיות התפתחות חיידקים מסווה את הכפל 'הווירוסים. משנים את תערובת אנטיביוטיקה או אפילו filtrating התרבות כדי לחסל את החיידקים של יותר מ -200 ננומטר בגודל צריך לנהל מגבלה זו לפעמים.
"> כל תנאים מותאמים מציעים הליך בידוד אופטימלי חדש, התומך כפל ויראלי. טכניקה זו מציגה יתרון יחסי משמעותי על גילוי וירוסים חדשים, במיוחד Megavirales, כדי להבין טוב יותר את הגיוון שלהם, מקורותיה, ועל פתוגניות פוטנציאליים.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
