Abstract
Die Isolierung von Riesen-Viren ist von großem Interesse in dieser neuen Ära der Virologie, vor allem, da diese riesigen Viren sind Protisten verwandt. Riesen Viren können potentiell pathogen sein für viele Arten von Protisten. Sie gehören zu den kürzlich beschriebenen Reihenfolge von Megavirales. Die neue Linie Faustovirus, die von Abwasserproben isoliert wurde, ist weitläufig verwandt mit dem Säuger-Erreger der Afrikanischen Schweinepest-Virus. Dieses Virus ist auch spezifisch für seine Amöben Wirt, Vermamoeba vermiformis, einem Protisten gemeinsam in Wassersystemen Gesundheitswesen. Es ist wichtig, neue Faustovirus Genotypen fortzusetzen, um die Isolierung ihres Genotyps Sammlung zu vergrößern und seine pan-Genom untersuchen. Wir entwickelten neue Strategien für die Isolierung von zusätzlichen Belastungen durch die Verwendung von Antibiotika und Antimykotika Kombinationen, um die Verbesserung der Bakterien- und Pilzkontaminationen der Amöbe Kokultur und begünstigen die Virusvermehrung zu vermeiden. Wir führten auch eine neue starvation Medium zu halten V. vermiformis unter optimalen Bedingungen für Viren Co-Kultur. Schließlich verwendeten wir Durchflusszytometrie statt mikroskopischen Beobachtung, die zeitaufwendig ist, den cytopathogenen Effekt zu erkennen. Wir erhielten zwei Isolate von Abwasserproben, die Effizienz dieses Verfahrens zu beweisen und damit die Verbreiterung der Sammlung von Faustoviruses, besser an ihre Umgebung zu verstehen, Wirtsspezifität und genetische Inhalt.
Introduction
Die Entdeckung des Riesen Viren, vor allem die Angehörigen der Megavirales Ordnung, völlig verändert die Welt der Viren in Bezug auf die Partikelgröße und Genom Komplexität. Die Viren wurden bisher angenommen , kleine Einheiten zu sein, und die Mimivirus erschienen , alle Regeln zu brechen. 1 metagenomische Daten , die die Allgegenwart von Riesen Viren nicht nur in der Umgebung vermuten lässt, 2-5 , sondern auch beim Menschen. 6 Daher besteht weiterhin ein Bedarf ist für diese Viren in großem Maßstab zu suchen. Die Vielfalt dieser riesigen Viren durch Abtasten nicht nur eine Vielzahl von Gewässern und die damit verbundenen Ablagerungen weltweit beurteilt wurde, 7-11 , sondern auch durch eine Vielzahl von humanen Proben 12,13 Screening und Umweltproben. 7,9 Die Acanthamoeba polyphaga Mimivirus war isoliert durch Co-Kultur phagozytischen Protisten verwenden, in erster Linie spp Acanthamoeba. 14-16 waren eine ganze Sammlung von Riesenviren dann auchisoliert von dieser angegebenen Protisten Host, die die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Forschungs- und Isolierungsverfahren für Acanthamoeba spp beschränken gemacht. Offensichtlich diese Abhängigkeit von einem einzigen Host-Spezies hat dazu geführt, ein großer Teil der Viren übersehen. Die Tatsache , dass der Riese Virus, CroV, mit dem hoch motile marine Einzeller Cafeteria Roenbergensis isoliert wurde, zeigt , 17,18 die Notwendigkeit , eine breitere Palette von Protozoen zu verwenden , um neue Linien oder Familien von Riesen-Viren zu entdecken. Reteno et al. Gelang andere Protozoen als Zellwirte auszuwählen , die nie benutzt worden war, und isoliert die neue Asfar bezogenen Linie von Riesenviren (die neu benannte Faustovirus). 19
In einem Versuch, neue Faustovirus Genotypen zu isolieren, um die Mitglieder dieser viralen Linie zu erweitern, modifizierten wir unsere Isolierungsverfahren und verwendet sie Umweltproben zum Screening der Lage, neue Faustoviruses Ernte. Wir danndas gesamte Protokoll beschrieben, um die neuen Isolate zu charakterisieren. Wir untersuchten Vermamoeba vermiformis, die am häufigsten Protisten freilebende in menschlichen Umgebungen gefunden, 20-22 , die bereits in der Isolierung des ersten Faustovirus Prototyp E12 verwendet wird. 19 Diese Protisten ist derzeit noch wirtsspezifisch für Faustovirus. Wir wussten, dass keines der bekannten Riesen Viren für diese Amöbe pathogen war, weil keine Versuche anderen Riesen Viren wachsen in unserem Labor Amöbe Lyse oder das virale Wachstum zeigte. Aus diesem Grund glauben wir , dass V. vermiformis ist die beste und einzigartige Zell Unterstützung bekannt zu neuen Faustoviruses isolieren.
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Protocol
1. Probenentnahme
- Sammeln Sie 70 Proben aus verschiedenen Umgebungen und Regionen. In diesem Fall verwenden Sie die folgenden: 5 schmutzige Wasserproben aus dem Dorf Saint Pierre de Meyzoargues (Frankreich), 15 Proben aus dem See im Parc Borély in Marseille (Frankreich); 15 Meerwasserproben mit Sediment aus den Felsbuchten an Samena in Marseille (Frankreich), 25 Flusswasserproben aus den Alpen (Frankreich), und schließlich, 10 Proben von Abwasser in La Ciotat (Frankreich).
- Vortex Proben zur Homogenisierung vor dem Beimpfen, für eine Minute bei Raumtemperatur ohne jede Behandlung.
2. Isolierung Procedure
- Host-Vorbereitung für Blinde Kulturverfahren und Proben Inokulation
- Verwenden V. vermiformis (Stamm CDC19) als Zell Unterstützung für die Co-Kultur.
- Aufrechterhaltung der Amöben bei 28 ° C, in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche mit 30 ml Protease-Pepton-Hefeextrakt-Glucose - Medium (PYG). Bitte überprüfen Sie PYG Zusammensetzung in Tabelle 1.
Hinweis: Nach 48 Stunden Amöben durch eine normale Zählung mit Zählen Dias quantifiziert werden (zB Kovaslides). - Ernte Zellen bei einer Konzentration von 5 × 10 5 zu 10 6 Zellen / ml und Pellet Amöben durch Zentrifugation bei 720 xg für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, und erneut zu suspendieren die Amöben Pellet in 30 ml sterile Seite der Amöbensalzlösung (PAS) Tabelle 1. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang.
- Re-suspendieren Amöben in 30 ml Hungermedium mit einem Antibiotikum und antimykotische Mischung in einer Konzentration von etwa 10 6 amoeba / ml. Das Hungermedium ist ein Überlebensmedium für die Amöbe, es ermöglicht, ohne Encystirung oder Multiplikation am Leben zu bleiben. Überprüfen Zusammensetzung in Tabelle 1.
Hinweis: Das antimikrobielle Mittel Gemisch enthielt 10 ug / ml Vancomycin, 10 & mgr; g / ml Imipenem, 20 ug / ml Ciprofloxacin, 20 μg / ml Doxycyclin und 20 & mgr; g / ml Voriconazol. Diese Mischung diente dazu, die Bakterien und Pilzbefall zu reduzieren, die Virusvermehrung zu verringern oder verändern kann. - impfen Direkt 25 ul jeder Probe auf die 200 ul Amöbe Monoschicht in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden, die Amöbe Einhaltung begünstigen und bei 30 ° C in einer feuchten Umgebung brüten (feuchter Umgebung besteht in der Tasche eine nasse Kompresse des Vergebens enthält, die Platte, um Verdampfung zu vermeiden). Dies ist die primo-Kultur. Lassen Sie zwei Brunnen von Amöben ohne Probe Impfung; Dies dient als Negativkontrolle. Inkubieren dieses primo-Kultur für drei Tage.
- Drei Tage nach der ersten Inokulation Subkultur der primo-Kulturplatte auf frischem Amöben als ohne mikroskopische Beobachtung oben beschrieben. Inkubieren Sie die neue Platte für drei Tage unter den gleichen Bedingungen wie die primo-Kultur.
- Führen der endgültigen Kultur nach diesen drei Tagen Inkubation die gleiche Weise wie für the primo- und Subkultur. Inkubieren Sie die letzte Kultur für zwei Tage. Dann auf die Erkennung fortzufahren.
- Der Nachweis von Lysis durch automatisierte Flow Cytometry
Hinweis: Blind Kultur gepaart mit Durchflusszytometrie unterscheidet sich vom bisherigen Standard der Isolation. Es ist empfindlicher, präzise und automatisiert. Für Nachweiszwecke, wandten wir eine neue Technik der Lyse mit der höchsten Geschwindigkeit zu erfassen, entwickelt und ohne mikroskopische Beobachtung. Diese Technik ist von Vorteil für das Screening Proben und hat eine bessere Empfindlichkeit als ältere Techniken. 7-9- Verwenden, um die 96-Well-Platte der endgültigen Kokultur Lyse zu detektieren.
- Schalten Sie das Zytometer und führen Sie einen sauberen und Spülgang, um nach niedrigeren Hintergrundrauschen zu Protokoll des Herstellers zu erhalten.
- Starten Sie den High Throughput Sampler (HTS) in Kombination mit Durchflusszytometer automatisch Proben laden von der 96-Well-Platte und führen Sie eine vollständig automatisierten Erfassung innerhalb von 40 min according dem Protokoll des Herstellers.
- Richten Sie die HTS wie folgt: Probenvolumen 150 & mgr; l, Volumen 50 ul Mischen, Mischgeschwindigkeit 180, die Anzahl der Mixe 5, Waschvolumen zwischen jeder Probe 400 & mgr; l, Flussrate 2,5 l / s ab, die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse 10.000.
- Bewertung der negativen Kontrollvertiefungen des endgültigen Kokultur Mikroplatte zuerst um die amöben Bevölkerung Gate und der Anteil dieser Zellwirten gemäß ihrer physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Achten Sie darauf, eine homogene Amöbe Bevölkerung und eine zweite Population einer unteren Ereignisse zu haben, um Schmutz und Lärm entspricht.
Hinweis: Dieses Gating-Verfahren unterscheidet subzellulärer Schutt und Klumpen aus einzelnen Zellen durch Größe, durch Vorwärtsstreuung geschätzt. mit der bestmöglichen Gating-Verfahren ist es deshalb wichtig, genau den Prozentsatz jeder Population bestimmen. Diese Prozentsätze können variieren, insbesondere wenn viele Arten von Protozoen verwendet werden, so ist es wichtig, stets einen negativ zu haben,e Steuerung, die als die Referenzpopulation für den Rest der Proben verwendet werden kann. - Starten Sie die Gating acquire Probe durch einen Klick.
- Notieren Sie die Anzahl der Ereignisse, die nicht weniger als 10.000 Veranstaltungen.
- Localize die Amöbe Population von Interesse mit dem Pfeil. Dies ist, wie die Tore zu definieren.
- Nach Gating, lassen Sie den HTS-Spot oder die Platte finden, indem Sie "Start" klicken, dann die gesamte Platte automatisch ausgeführt. Führen Sie die Datenerfassung und Analyse nach der Größe und Strukturparameter (bzw. FSC (Vorwärtsstreuung) und SSC (side scatter)).
Hinweis: Die Erkennung des Verlust der Amöbe-gated Bevölkerung signalisiert das Vorhandensein eines Krankheitserregers verantwortlich für Amöbe Lyse. Protozoen Lyse mit Virusinfektion assoziiert ist mit einer beliebig gestaltet Schwelle von 50% Lyse der Amöbe Population durch den Analysator und im Vergleich zu dem gleichen nicht-infizierten Population verwendet als zuverlässige negative Kontrolle gated detektiert.
- Vorläufige Färbung zu offenbaren die Anwesenheit von Riesenviren
- Nach der Lyse Detektion mittels Durchflusszytometrie, pipettieren lysiert Kokulturen die verbleibenden Amöben zu suspendieren. Zytozentrifuge dann direkt 50 ul der Suspension bei 800 xg für 10 min.
- Nach dem Zentrifugieren fixieren Sie die Folien mit einer reinen Methanollösung. Stain die Folien eine kommerzielle Schnellfärbung von Eosin / blau Azur und DAPI-Färbung mit und beobachten unter einem Lichtmikroskop bei 1,000x Vergrößerung, um das Vorhandensein von Viren Fabriken zu überprüfen.
- Für eine schnelle Färbung, die Folien in die erste Eosinlösung stürzen (4 sec dreimal wiederholt) dann direkt gleitet in die zweite Befestigungslösung, die blauen Azur für 6 sec tauchen passieren, und spülen Sie schließlich die Folien für 45 sec mit einer Phosphatpufferlösung pH-Wert 7,2. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen, dann gehen Sie zu observatiauf.
- Für DAPI-Färbung, Ablagerung 15 ul der DAPI kommerziellen Stammlösung auf dem festen trockenen Objektträger. Vor Licht gehen dann auf die Beobachtung.
- Elektronenmikroskopie
- Nach der ersten Identifizierung auf den Folien, um die Anwesenheit des Virus durch giant Elektronenmikroskopie Beobachtung der Überstand Kulturen beurteilen.
- Kaution 5 ul der positiven Probe auf die glow-entladen Gitter. Warten für etwa 20 min bei Raumtemperatur.
- Trocknen Sie das Gitter vorsichtig und sich auf sie einen kleinen Tropfen von 1% Ammoniummolybdat für 10 Sekunden. Lassen Sie das Raster für 5 Minuten trocknen lassen.
- Gehen Mikroskopie bei 200 keV bis Elektron.
- Legen Sie das Gitter auf den Halter; den Halter in das Mikroskop einzuführen. Schauen Sie sich die Vakuum-Übersicht, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken. Ventile schließen und beginnen Beobachtung bei einer Punktgröße 5 und Vergrößerung von x 25.000.
- Messen Sie die Riesen-Virus mit ImageJ oder direktly am Mikroskop das Messwerkzeug des Mikroskops auf den Erwerb Bildschirms verwenden.
Hinweis: Klassifizieren Sie die Probe in die Faustovirus Gruppe mit einem Kapsid Größe von etwa 200 nm.
- Molekularbiologie
Anmerkung: Nach dieser Identifizierung, Molekularbiologie Untersuchungen zur Bestätigung, um entscheidend waren Faustovirus von Marseillevirus zu unterscheiden, die die gleiche Kapsid Größe und Aussehen unter Elektronenmikroskopie hat, obwohl sie die gleiche Wirtsspezifität nicht haben. Die Marseillevirus nicht auf Vermamoeba wachsen kann, ist die Faustovirus ist spezifisch für Vermamoeba und alle Versuche , es wie Acanthamoeba auf andere Amöbe zu wachsen sind bisher gescheitert. Das Design und die Anwendung der spezifischen Primer / Sonde - Systeme aufgeführt in den Werken von Reteno et al. ermöglichte eine genauere vorläufige Klassifizierung der neu-Amplifikation und Sequenzierung der viralen Gene isoliert Viren durch.- ExTrakts DNA aus den positiven Kulturproben eines automatisierten Extraktionssystems nach dem Protokoll des Herstellers.
- Eine Echtzeit - PCR - Thermocycler unter Verwendung der in Reteno et al. 19
- Sequenz unter Verwendung der gleichen Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden. Verwenden Sie die Primer DNA-RNA-Polymerase-Untereinheit 1 Gen-Targeting: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(vorwärts) und Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (rückwärts) mit die Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA-Sonde.
4. Virus Produktion, Reinigung und Genomsequenzierung
- Subkultur das einzige Virus Amöbe Kultur für Endpunktverdünnung Klonen.
- Zur Herstellung: Es werden 20 - Kolben , die 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis und 5 ml des isolierten Virus bereits aus Brunnen zu kleinen Kolben übertragen.
- Inkubieren bei 30 ° C bis zur vollständigenLyse der Amöbe. Beachten Sie jeden Tag durch invertierte Lichtmikroskopie, bis alle Amöben lysiert werden.
- Nach der vollständigen Lyse, bündeln alle Flaschen in einen Empfänger. Filter mit einem 0,45 um-Filter zur Beseitigung Schutt.
- Starten Sie die Reinigung durch Ultrazentrifugation bei 89.800 × g für 75 min. Achten Sie darauf, das Gewicht der Rohre zu kalibrieren, bevor Zentrifugation starten.
- Nach Zentrifugation entfernen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen durch Absaugen und das Pellet in PAS mit dem gleichen Volumen für die Kalibrierung verwendet resuspendieren, vor der Zentrifugation wiederholt.
- Wie oben, entfernen Sie den Überstand und resuspendiere alle Pellets in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Man reinige das Virus, das hergestellt wird, unter Verwendung von 25% Sucrose (27,5 g Saccharose in 100 ml PBS, filtriert auf einem 0,22 um Filter).
- Verwenden 8 ml Saccharose und 2 ml der viralen Suspension. Zentrifuge bei 89.800 · g für 1 h 15 min. Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS. Bei -80 ° C.
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Representative Results
Das System in diesem Manuskript studiert validiert seine Proof of Concept durch zwei neue Faustoviruses zu isolieren. Von den 70 getesteten Proben wurden zwei Episoden der Lyse nachgewiesen, im Gegensatz zu unseren zuverlässigen negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle für die Lyse enthielt eine 86% Amöbe Bevölkerung. Dagegen sind die positiven Proben (ST1 für Saint Pierre de Meyzoargues) und (LC9 für das La Ciotat Probe 9) zeigte einen dramatischen Rückgang der gated Amöben; mehr als 60% von Amöben wurden mit dem höchsten Prozentsatz von Schutt lysiert. Diese robusten Ergebnissen der Detektionsstufe unseres Verfahrens dargestellt sind in Fig . 1 Eosin / blue Azur und DAPI - Färbung bestätigten das Vorhandensein von Virus - Fabriken in der Amöben, die in 2 gezeigt. Die Elektronenmikroskopie zeigte das typische Aussehen von Megavirales mit einem ikosaedrischen Capsid , 200 nm in der Größe, und ohne Fibrillen (Abbildung 3). Eine spezifische PCR für Riesen-Viren, particularly für Faustovirus, bestätigt unsere bisherigen Erkenntnisse. Es muss durch PCR, um geprüft werden, um mehrdeutige Ergebnisse oder kontaminierten Isolationen zu beseitigen. Die Viren wurden kloniert, produziert und gereinigt für die gesamte Genomsequenzierung. Die Genome der neu isolierten Faustoviruses werden unter dem folgenden Bioproject vorgelegt: PRJEB11169. Die primo-, Unter- und final-Kultur zeigten keine Pilz- oder bakterielle Kontamination, diese Virusvermehrung begünstigt. Vermamoeba vermiformis toleriert die Anti-Pilz - und Antibiotika - Mischung. Dies war deutlich in der negativen Kontrolle von Amöben , wo nach drei Tagen die letzte Kultur mehr als 80% lebende Amöben enthalten. Vermamoeba auch eine gute Wirtszelle zur Isolierung vorgesehen ist , eine signifikante Viruslast nach der Lyse zu erzeugen.
Abbildung 1: Lysis Erkennung durch automatisierte Durchflusszytometrie Die Daten Vertre.t die beiden Proben, die Faustovirus geerntet und Amöbe Lyse zeigte. Eine lebende Amöben Bevölkerung wurde als negative Kontrolle verwendet. Zwei Tore wurden in der FSC-SSC Plot entwickelt, die möglicherweise zu den Zellen und Trümmer entspricht. Nach der abschließenden Co-Kultur, eine große Population von Ablagerungen zeigte die Anwesenheit einer potentiellen Infektion in den Proben (ST1 und LC9) (B), im Vergleich zu der Negativkontrolle , die in den gated Populationen (A) keine wesentlichen Veränderungen zeigten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Virus Fabriken typisch für einige Riesen-Viren in Eosin / blau Azur - Färbung und DAPI - Färbung Negative Kontrolle der V. zeigt. vermiformis Kern Eosin / blau Azur Färbung unter Verwendung(A) und DAPI - Färbung (D) (Pfeile in den Zellkern der Amöbe Punkt). Vergrößerung bei 1,000x. (B, C): Eosin / blau Azur Färbung bei 1,000x Vergrößerung von V. vermiformis mit Faustovirus LC9 infiziert. Die Pfeile zeigen auf den Kern des zirkularisiert infizierten Amöben, Viren Fabriken sind mit einem Stern markiert. (E, F) DAPI - Färbung bei 1,000x Vergrößerung von V. vermiformis mit Faustovirus LC9 infiziert. Die Pfeile zeigen auf Virus Fabriken in 8 Stunden nach der Infektion (E) und 12 Stunden nach der Infektion (F). Maßstabsbalken 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Negative Färbung micrograph. Negative Färbung der viralen Suspension nach der Lyse - Erkennung, die neu entdeckten Faustovirus mit dem typischen Aussehen von Megavirales zeigt, mit einem ikosaedrischen Kapsid und einer Gesamtgröße von 200 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| PYG Zusammensetzung | Mengen |
| Proteose Pepton | 20 g |
| Hefeextrakt | 2 g |
| 4 MgSO. 7H 2 O | 0,980 g |
| CaCl 2 | 0,059 g |
| Citrat-Natrium. Dihydrat | 1 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 x 6 H 2 O | 0,02 g |
| Glucose | 18 g |
| destilliertes Wasser | 1 L |
| PH-Einstellung auf 6,8 mit HCl oder KOH. | |
| Autoklaven 15 min bei 121 ° C. | |
| Starvation Medium | Mengen |
| Hefeextrakt | 2 g |
| Glucose | 18 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O | 0,02 g |
| PAS (siehe unten) | 1 L |
| Gefiltert auf 0,22 mm | |
| PAS - Lösung A | Mengen |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS - Lösung B | Mengen |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml jeder Lösung A und B werden in 1 l destilliertem Wasser zugesetzt. | |
Tabelle 1: Lösung Rezepte.
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Discussion
Die Möglichkeit , dass Faustovirus schließen das erste Mitglied einer neuen Megavirales Familie ASFV zuerst von Reteno et al vorgeschlagen wurde sein könnte., 19 , aber einige Unterschiede noch unterschieden werden können. Es scheint unklar, ob Faustovirus die Asfarviridae Familie beitreten sollte oder ob es stattdessen eine neue vermeintliche Virusfamilie bilden. Dieses Problem wird weiter untersucht werden müssen, insbesondere eine umfassende Charakterisierung seiner Morphologie, Wirtsbereich, Replikationszyklus und Gen-Repertoire. Mehr Faustovirus Genotypen sollten zu erweitern, um die pan-Genom und zum besseren Verständnis der Ursprünge und Verwandten dieser viralen Gruppe oder Familie isoliert werden. Die Technik, die wir verwendet, erlaubt es uns, neue Mitglieder dieser potenziellen neuen Familie weiterhin zu isolieren. Diese Technik ist mit der leicht modifizierten Co-Kulturtechnik gekoppelt ist, die für eine bessere Erkennung als Anreicherungsschritt wirkt. Die erforderliche Zeit durch Durchflusszytometrie für die Erfassung von Daten für hundreds der Proben nicht mehr als eine halbe Stunde, die im Vergleich zum bisherigen Standard - Co-Kultursystem ein großer Vorteil ist. 9 Die Technik weit besser als die bisherigen Standardsystem, insbesondere im Hinblick auf seine höhere Empfindlichkeit und genaue Quantifizierung ist.
Von den 70 Proben ins Leben gerufen, isolierten wir zwei weitere Faustoviruses von Abwasser, die Informationen über die Umweltspezifität oder Ökosystem dieses Virus zur Verfügung stellen könnte. Tatsächlich ist die Spezifität von Faustovirus für die Protisten Vermamoeba vermiformis, 19 sowie die neue Klassifikation der HcDNAV unter den Asfarviridae 23 und die Tatsache , dass dieses Virus viele Stämme von Dinoflagellaten Heterocapsa spp infiziert , ist aber nicht in der Lage zu infizieren andere Arten von Phytoplankton 24 schlägt vor , die Anwesenheit von Wirt-Spezifität unter Asfarvirus oder seine nahen Verwandten.
Diese Ergebnisse implizieren die Verwendung neuer Zellträger eine wirkendes spezifische oder unspezifische Hosts, die diese Arten von Viren beherbergen können. Unsere Technik kann auf andere Arten von Protisten in unterschiedlichen Bedingungen angepasst werden. Unsere Methode Marken Fortschritte in Bezug auf die Virusisolierung und Kulturtechniken. Anreicherungsschritte mit der am besten geeigneten antibakterielle und antimykotische Mischung sind von entscheidender Bedeutung für die Beseitigung einer möglichen bakteriellen oder Pilzkontamination Zusammengefasst. Unser Hungermedium war die beste Lösung , um die Amöbe unter den besten Bedingungen für die Co-Kultur aufrechtzuerhalten, während der PAS - Medium in der Routinekultur verwendet wird für Vermamoeba spp ungeeignet sein, weil schnell Encystirung nach 24 Stunden Inkubation beobachtet wurde. Das war ein großer Schritt in Richtung optimalen Kulturbedingungen, wo frühere Techniken hatte bisher gescheitert. Um die besten Ergebnisse unter Verwendung der Kulturprotokolle hier beschrieben zu erhalten, ist es empfehlenswert, der Lage der Phagozytose frisch Amöben zu verwenden. Die antibiotische und antifungale Mischung sollte für Protisten ungiftig sein ; Daher ist es empfehlenswert, die Lebensfähigkeit der verwendeten Protozoon auf die Mischung zu testen. Alle verwendeten Materialien sollten sterilisiert werden. Die Arbeiten sollten in einem mikrobiologischen gesichert Post Klasse durchgeführt werden II jede wahrscheinlich Kontamination zu vermeiden. Inkubationszeiten und die drei Stufen der Kultur sollte wie beschrieben eingehalten werden. Die Verarbeitungszeit für die Durchflusszytometrie Detektion kann in Abhängigkeit von den untersuchten Organismen kalibriert werden. Eine kleine Verschiebung in der Bevölkerung aus dem ursprünglichen Gating beobachtet werden kann, aber das hängt von der zuverlässigen negative Kontrolle als Referenzpopulation verwendet.
Multiresistente Bakterien, die in der Kultur gefunden werden können und Krankheitserreger für Amöben können unsere Virusisolationsmethode irgendwie zu begrenzen, in denen wir das Wachstum von Bakterien Maskieren Multiplikation "die Viren haben können. Variieren der antibiotischen Mischung oder sogar Filtrieren der Kultur, um die Bakterien von mehr als 200 nm zu eliminieren manchmal bemessen sollte diese Einschränkung zu verwalten.
"> Alle diese angepasst Bedingungen bieten eine neue optimale Isolierungsverfahren, die Virusvermehrung unterstützt. Diese Technik einen erheblichen Vorteil bei der Entdeckung neuer Viren präsentiert, vor allem Megavirales, um besser ihre Vielfalt zu verstehen, Herkunft und mögliche Pathogenität.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
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