Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi

7.5K görüntülenme

DOI:

10.3791/54104

4 Haziran 2016

Bu makalede

Özet

Burada, dev virüslerin asfarvirüs ile ilgili yeni bir soyu olan Faustovirus'un yeni genotiplerinin karakterizasyonu için viral izolasyondaki en son gelişmeleri açıklıyoruz. Bu protokol, virüslerin, özellikle amipleri enfekte eden dev virüslerin yüksek verimli izolasyonuna uygulanabilir.

Özet

Dev virüslerin izolasyonu bu dev virüsler protistler ilgili özellikle, viroloji, bu yeni dönemde büyük ilgi olduğunu. Dev virüsler protistlerin birçok tür için potansiyel patojenik olabilir. Onlar Megavirales son zamanlarda açıklanan sipariş aittir. Pis su örneklerinden izole edilmiş yeni bir soy Faustovirus memeli patojen Afrika domuz ateşi virüsü uzaktan ilişkili olduğunu. Bu virüs aynı zamanda amoebal ana bilgisayar Vermamoeba vermiformis, sağlık su sistemlerinde yaygın protistler özgüdür. Onun genotip koleksiyonunu büyütmek ve pan-genomu incelemek amacıyla yeni Faustovirus genotiplerin izole devam çok önemlidir. Bu amip ko-kültür bakteriyel ve fungal kirletmesini önlemek için antibiyotik ve antifungal kombinasyonlarının kullanımının geliştirilmesi ve virüs çoğalmasını lehine ek suşlarının izole edilmesi için yeni bir strateji geliştirildi. Biz de yeni bir starvatio uygulamayaN, orta V korumak virüs ko-kültür için uygun koşullarda vermiformis. Son olarak, sitopatojenik bir etkiye tespit etmek için, zaman alıcı, akış sitometrisi yerine mikroskopik gözlem kullanılmıştır. Biz daha iyi bir ortam, ev sahibi özgüllük ve genetik içeriğini anlamak için, bu yöntemin etkinliğini kanıtlayan ve böylece Faustoviruses toplanması genişletilmesi, kanalizasyon örneklerinden iki izolatı elde edilmiştir.

Giriş

Dev virüsler, Megavirales sipariş ait özellikle keşif, tamamen partikül büyüklüğü ve genom karmaşıklığı açısından virüslerin dünyayı değiştirdi. Virüsler, daha önce küçük işletmeler olduğu düşünülen ve Mimivirus tüm kuralları kırmaya ortaya çıktı. 1 Metagenomic veri ortamında, 2-5 değil, aynı zamanda insanlarda sadece dev virüslerin aynı anda her yerde göstermektedir. 6 Bu nedenle, hala ihtiyaç vardır büyük ölçekte bu virüslerin aramak için. Bu dev virüslerin çeşitlilik insan numuneleri 12,13 ve çevresel örneklerde çeşitli tarama ile, dünya çapında da 7-11 fakat su ortamlarının çeşitliliği ve bunlarla ilişkili se....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Örnek Toplama

  1. Farklı ortamlarda ve bölgelerden gelen 70 örnekleri toplamak. Saint Pierre de Meyzoargues (Fransa), Marsilya (Fransa) Parc Borely gölden 15 numune köyünden 5 kirli su örnekleri;: Bu durumda, aşağıdaki kullanın 15 deniz suyu 25 nehir suyu örnekleri Alpler (Fransa) Marsilya SAMENA (Fransa), kayalık girişlerden sediman numuneler ve nihayet, La Ciotat kanalizasyon 10 numune (Fransa).
  2. herhangi bir tedavi olmaksızın oda sıcaklığında, bir dakika boyunca, aşılanmasından önce homojenleştirme vorteksleyin örnekleri.

2. İzolasyon Prosedürü

  1. Kör Kültür Usul ve Numune Aşılama için Hazırlık ev sahip....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yazıda incelenen sistem iki yeni Faustoviruses izole ederek kavramın kendi kanıtı valide. Test edilen 70 örnek, lizis iki bölüm Güvenilir negatif kontroller aksine, tespit edilmiştir. lizis için negatif kontrol% 86 amip nüfus içeriyordu. Buna karşılık, pozitif örnekler (Saint Pierre de Meyzoargues için ST1) ve (La Ciotat Numune 9 LC9) kapılı amip dramatik bir düşüş gösterdi; amip fazla% 60 kalıntı en yüksek yüzde lize edildi. Bizim yöntemin saptama aşamasının bu sağlam sonuçlar

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Faustovirus ASFV yakın yeni Megavirales ailesinin ilk üyesi ihtimali ilk Reteno ve diğ., 19 tarafından önerildi ancak bazı farklılıklar de ayırt edilebilir. Faustovirus Asfarviridae ailesine katılmak gerekip gerekmediğini veya yerine yeni bir varsayılan virüs ailesini oluşturmalıdır belirsizliğine dikkat çekmektedir. Bu konu daha fazla araştırma, kendi morfolojisi özellikle daha kapsamlı karakterizasyonu, ev sahibi aralığı, çoğaltma döngüsü ve gen repertuarı gerektirecektir. Daha Faustovirus genotipl.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarların yapacak bir teşekkür yok.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LSR FORTESSA sitometresi BD BiosciencesFransa 649225B4
TECNAI G2 F20FEIAlmanya 5027/11
Optik ters mikroskopleica Fransa72643
DNA ekstraksiyonuQiagen EZ1 Gelişmiş XL Ekstraksiyon RobotuFransa L106A0452
PCR Cycler CFX96BioradFransa785BR06298
PYG ortamı, PAS, Açlık ortamıKurum içi laboratuvar üretimi Marsilya URMITEx
Amip suşu CDC-19ATCCFransa50237
PlakalarCellstarFransa655180
PCR malzemeleri, primerler.eurogentecFransaEl yazması
camtik slayt 10'da belirtilen astarlar, ızgaralarlaKova ABDH899871441F
Eozin / mavi Azur-Hemacolor lekesiMerck milipore Fransa111955,6,57,109468
Vakum tahrikli filtrelerThermo scientificFranceBPV4550 / 20170115
Fosfat Tamponlu TuzluSu Thermo Fisher scientific Fransa 10010-023
DAPI lekeYaşam Teknolojileri Fransa D1306
cytospin 4 sitosantrifüjThermo Fisher scientificFransa10522013JT184-31
Tek sitolojitüneli Biyomedikal polimerler inc.FransaBMP-cyto-S50
Karbon ızgaraları EuromedexFransa FCF400NI
Amonyum molibdatVWR uluslararası Fransa 21276185
Şişeler SARSTEDTAlmanya
833911 0.22 &; m filtreleri Milex millipor FransaSE2M229104
Ultrasantrifüj Sorval WX 80Thermo scientificFrance9102448
Hızlı akış filtreleriNalgeneFransa450-0020
sayılı Kanun Serisi

Kaynaklar

  1. Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
  2. Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
  3. Monier, A. A., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Faustovirus zolasyonuAk SitometrisiAntibiyotik Antifungal Kar mA l k OrtamSitopatik Etki TespitiElektron MikroskobuVir s Fabrikas BoyamaKanalizasyon Numunesi lemeAmoeba Ko k lt r