Abstract
عزل الفيروسات العملاقة هي ذات أهمية كبيرة في هذا العصر الجديد من الفيروسات، وخاصة لأن هذه الفيروسات العملاقة ترتبط الطلائعيات. قد تكون الفيروسات العملاقة المحرضة للعديد من أنواع الطلائعيات. وهم ينتمون إلى أجل وصف مؤخرا من Megavirales. سلالة جديدة Faustovirus التي تم عزلها من عينات مياه الصرف الصحي غير بعيدة الصلة إلى الممرض الثدييات الخنازير الأفريقية فيروس الحمى. هذا الفيروس هو أيضا محددة لاستضافة amoebal لها، الدودي Vermamoeba، وأولاني المشتركة في شبكات المياه والرعاية الصحية. ومن الأهمية بمكان أن تواصل عزل المورثات Faustovirus جديدة من أجل توسيع مجموعة النمط الوراثي ودراسة في عموم الجينوم. قمنا بتطوير استراتيجيات جديدة لعزل سلالات إضافية من خلال تحسين استخدام نوعين من المضادات الحيوية ومضادات الفطور وذلك لتجنب التلوث البكتيرية والفطرية من الاميبا ثقافة مشتركة وتفضيل تكاثر الفيروس. نحن أيضا نفذت starvatio جديدن المتوسطة للحفاظ على V. الدودي في الظروف المثلى للبحث عن الفيروسات شارك في الثقافة. وأخيرا، كنا التدفق الخلوي بدلا من الملاحظة المجهرية، التي تستغرق وقتا طويلا، للكشف عن تأثير ممرض للخلايا. حصلنا على اثنين من عزلات من عينات مياه الصرف الصحي، وتثبت كفاءة هذه الطريقة وبالتالي توسيع مجموعة من Faustoviruses، من أجل فهم أفضل بيئة، والنوعية التي تستضيفهم والمحتوى الجيني.
Introduction
اكتشاف الفيروسات العملاقة، وخاصة أولئك الذين ينتمون إلى أجل Megavirales، تغير تماما في عالم الفيروسات من حيث حجم الجسيمات والجينوم التعقيد. ويعتقد أن الفيروسات في السابق أن تكون الكيانات الصغيرة، وظهر فيروس محاكي لكسر جميع القواعد. وتشير 1 Metagenomic بيانات كل مكان من الفيروسات العملاقة ليس فقط في البيئة، 2-5 ولكن أيضا في البشر. 6 لذلك، لا يزال هناك حاجة للبحث عن هذه الفيروسات على نطاق واسع. وجرى تقييم للتنوع هذه الفيروسات العملاقة عن طريق أخذ عينات ليس فقط مجموعة متنوعة من البيئات المائية والرواسب المرتبطة بها في جميع أنحاء العالم، 11/07 ولكن أيضا عن طريق فحص مجموعة متنوعة من العينات البشرية 12،13 والعينات البيئية. كان 7،9 في فيروس محاكي polyphaga الشوكميبة معزولة عن طريق المشاركة في الثقافة باستخدام الأولانيات أكلة، في المقام الأول الشوكميبة النيابة 14-16 كانت هناك مجموعة كاملة من الفيروسات العملاقة ثم أيضامعزولة عن هذا المضيف أولاني محدد، مما جعل المجتمع العلمي تقييد إجراء البحوث وعزلتها عن الشوكميبة النيابة. بوضوح وقد أدى هذا الاعتماد على الأنواع المضيفة واحدة في جزء كبير من الفيروسات التي يجري تجاهلها. حقيقة أن الفيروس العملاق، CroV، تم عزل مع متحركة عالية البحرية roenbergensis كافتيريا البروتوزوا، 17،18 يوضح الحاجة إلى استخدام مجموعة واسعة من البروتوزوا من أجل اكتشاف سلالات جديدة أو الأسر من الفيروسات العملاقة. Reteno آخرون تمكنوا من تحديد الأوليات الأخرى بصفتها الدولة المضيفة الخلية التي لم تستخدم من قبل، وعزل النسب المتعلقة الأصفر ما هو جديد من الفيروسات العملاقة (المسماة حديثا Faustovirus). 19
في محاولة لعزل المورثات Faustovirus جديدة من أجل توسيع أعضاء هذه النسب الفيروسي، علينا تعديل الإجراءات عزلتنا واستخدموه لفحص عينات بيئية قادرة على حصاد Faustoviruses جديدة. نحن بعد ذلكوصف بروتوكول كامل لتوصيف السلالات الجديدة. قمنا بتقييم الدودي Vermamoeba، وجدت في بيئات الإنسان أولاني حرة المعيشة الأكثر شيوعا، 20-22 الذي يستخدم بالفعل في عزلة أول نموذج Faustovirus E12. 19 هذا أولاني حاليا لا تزال تستضيف محددة لFaustovirus. كنا نعلم أن أيا من الفيروسات العملاقة المعروفة والمسببة للأمراض لهذا الاميبا، لأنه لا يوجد محاولات لتنمو الفيروسات العملاقة الأخرى في مختبرنا أظهرت تحلل الأميبا أو النمو الفيروسي. لهذا السبب، فإننا نعتقد أن V. الدودي هو أفضل والأكثر تفردا دعم خلية معروفة لعزل Faustoviruses جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
مجموعة 1. عينة
- جمع 70 عينة من بيئات ومناطق مختلفة. في هذه الحالة، استخدم ما يلي: 5 عينات من المياه القذرة من قرية سان بيار دي Meyzoargues (فرنسا)، 15 عينة من البحيرة في حديقة Borély في مرسيليا (فرنسا)؛ 15 عينة مياه البحر مع الرواسب من مداخل الصخرية في سامينا في مرسيليا (فرنسا)، 25 عينة مياه النهر من جبال الألب (فرنسا)، وأخيرا، 10 عينات من مياه الصرف الصحي في اسيوتا (فرنسا).
- عينات دوامة لمدة التجانس قبل بتلقيح، لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة دون أي علاج.
إجراء 2. عزل
- استضافة التحضير لإجراءات مكفوفين الثقافة والتلقيح عينة
- استخدام V. الدودي (سلالة CDC19) كدعم خلية للثقافة مشتركة.
- الحفاظ على الاميبات عند 28 درجة مئوية، في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة مع 30 مل من البروتياز ببتون الخميرة استخراج الجلوكوز المتوسطة (PYG). يرجى التحقق من تكوين PYG في الجدول 1.
ملاحظة: بعد 48 ساعة، وكميا الاميبات من قبل عدد باستخدام العادية الشرائح العد (على سبيل المثال، Kovaslides). - حصاد الخلايا بتركيز 5 × 10 مايو - 10 يونيو خلية / مل، وبيليه الاميبات بواسطة الطرد المركزي في 720 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف بواسطة الشفط، وإعادة تعليق بيليه الاميبات في 30 مل من محلول ملحي معقم amoebal الصفحة في (PAS) الجدول 1. كرر هذا الإجراء الشطف.
- اعادة تعليق الاميبات في 30 مل من المتوسط المجاعة مع خليط مضاد حيوي ومضاد للفطريات في تركيز ما يقرب من 10 6 الاميبا / مل. المتوسط الجوع هو وسيلة البقاء على قيد الحياة لالاميبا، مما مكنها من البقاء على قيد الحياة دون تكيس أو الضرب. تحقق تكوين في الجدول 1.
ملاحظة: مزيج عامل مضاد للميكروبات يتضمن 10 ميكروغرام / مل فانكومايسين، 10 ميكروغرام / مل إيميبينيم، 20 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين، 20 μز / مل الدوكسيسيكلين، و 20 ميكروغرام / مل voriconazole. هذا المزيج خدم للحد من التلوث الجرثومي والفطرية التي يمكن أن تقلل أو تغيير الضرب الفيروسي. - مباشرة تطعيم 25 ميكرولتر من كل عينة على الأميبا أحادي الطبقة 200 ميكرولتر في قاع مسطح لوحة 96-جيدا لصالح الالتزام الاميبا واحتضان عند 30 درجة مئوية في بيئة رطبة (تتكون بيئة رطبة من وضع ضغط الرطب داخل حقيبة تحتوي على لوحة لتجنب التبخر). هذه هي الثقافة بريمو. ترك بئرين من الاميبات دون أي التلقيح عينة. هذا بمثابة سيطرة سلبية. احتضان هذه الثقافة بريمو لمدة ثلاثة أيام.
- بعد ثلاثة أيام من التلقيح الأولى، جنوب ثقافة لوحة بريمو الثقافة على الاميبات جديدة كما هو موضح أعلاه دون أي مراقبة مجهرية. احتضان لوحة جديدة لمدة ثلاثة أيام تحت نفس الشروط التي بريمو الثقافة.
- أداء ثقافة النهائية بعد هذه الأيام الثلاثة من الحضانة بنفس طريقة للصرفالبريد primo- ودون ثقافة. احتضان الثقافة النهائية لمدة يومين. ثم المضي قدما إلى الكشف.
- الكشف عن تحلل بواسطة الآلي التدفق الخلوي
ملاحظة: ثقافة أعمى إلى جانب تدفق يختلف الخلوي من النظام القياسي السابق من العزلة. ومن أكثر حساسية ودقيقة والآلي. لأغراض الكشف وطبقنا تقنية جديدة وضعت للكشف عن تحلل على أعلى سرعة ودون الملاحظة المجهرية. هذا الأسلوب هو مفيد للعينات الفحص، ولها حساسية أفضل من التقنيات القديمة 7-9- استخدام لوحة 96-جيدا النهائية ثقافة مشتركة للكشف عن تحلل.
- بدوره على الكريات وتشغيل دورة نظيفة وشطف من أجل الحصول على أقل من الضوضاء في الخلفية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إطلاق إنتاجية عالية عينات (HTS) جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي لتحميل تلقائيا عينات من لوحة 96-جيدا وأداء عملية استحواذ مؤتمتة بالكامل في غضون 40 دقيقة accordinز لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إعداد HTS على النحو التالي: حجم العينة 150 ميكرولتر، خلط حجم 50 ميكرولتر، سرعة 180، عدد يمزج 5 الاختلاط، حجم الغسيل بين كل عينة 400 ميكرولتر، معدل التدفق 2.5 ميكرولتر / ثانية، وعدد من الأحداث المسجلة 10000.
- تقييم آبار المراقبة السلبية للثقافة مشتركة لوحة صغيرة النهائية للمرة الأولى في لبوابة السكان الاميبا وتحديد نسبة من هذه المضيفين خلية وفقا لخصائصها الفيزيائية. يجب التأكد من أن عدد سكانها الاميبا متجانسة ويبلغ عدد سكانها الثاني من أدنى أحداث الموافق الحطام والضوضاء.
ملاحظة: هذا الإجراء النابضة يميز الحطام التحت خلوية وكتل من الخلايا واحد من حيث الحجم والتي يقدرها مبعثر إلى الأمام. ولذلك فمن المهم أن تحدد بدقة نسبة مئوية من كل السكان الذين يستخدمون أفضل إجراء النابضة ممكن. قد تختلف هذه النسب، وخاصة في حالة استخدام أنواع عديدة من الكائنات ذات الخلية الواحدة، لذلك من المهم دائما أن يكون negativمراقبة الإلكترونية، والتي يمكن أن تستخدم السكان إشارة لبقية العينات. - بدء النابضة بالنقر على عينة اكتساب.
- تسجيل عدد من الأحداث لا تقل عن 10000 الأحداث.
- توطين السكان الاميبا الاهتمام باستخدام السهم. هذه هي الطريقة لتحديد البوابات.
- بعد النابضة، والسماح للبقعة HTS أو تحديد لوحة بالنقر على "المنزل"، ثم قم بتشغيل لوحة كاملة تلقائيا. أداء جمع البيانات وتحليلها وفقا لمعايير حجم وهيكل (على التوالي، FSC (مبعثر إلى الأمام) وSSC (مبعثر الجانب)).
ملاحظة: الكشف عن فقدان السكان بوابات الاميبا يشير إلى وجود عامل ممرض مسؤولة عن تحلل الاميبا. تم الكشف عن الطفيليات تحلل المرتبطة عدوى فيروس مع عتبة مصممة بشكل تعسفي من 50٪ تحلل من السكان الاميبا بوابات بواسطة محلل وبالمقارنة مع نفس السكان غير المصاب تستخدم لمراقبة سلبية يمكن الاعتماد عليها.
- تلطيخ الأولي لتكشف عن وجود الفيروسات العملاق
- بعد الكشف عن تحلل التدفق الخلوي، ماصة هي lysed المشترك الثقافات تعليق الاميبات المتبقية. ثم cytocentrifuge مباشرة 50 ميكرولتر من تعليق في 800 x ج لمدة 10 دقيقة.
- بعد الطرد المركزي، وتحديد الشرائح مع الحل الميثانول النقي. وصمة عار على الشرائح باستخدام تلطيخ السريع التجارية من يوزين / أزرق دازور وتلطيخ دابي ومراقبة تحت المجهر الضوئي في 1،000X التكبير من أجل التحقق من وجود مصانع فيروس.
- لتلطيخ السريع، يغرق الشرائح في حل يوزين الأول (4 ثانية يتكرر ثلاث مرات) ثم تمرير مباشرة إلى إغراق الشرائح في تحديد الحل الثاني يحتوي على الأزرق دازور ل6 ثانية، وأخيرا شطف الشرائح لمدة 45 ثانية مع حل العازلة الفوسفات الرقم الهيدروجيني 7.2. ترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة، ثم الشروع في observatiعلى.
- لتلطيخ دابي، وديعة 15 ميكرولتر من محلول المخزون التجاري دابي على الشريحة الجافة الثابتة. حماية من الضوء ثم الشروع في الملاحظة.
- المجهر الإلكتروني
- بعد تحديد الأول على الشرائح، تقييم وجود فيروس عملاق من خلال الملاحظة المجهر الإلكتروني الثقافات طاف.
- إيداع 5 ميكرولتر من عينة إيجابية على الشبكة في تصريفها توهج. انتظر حوالي 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تجفيف شبكة بعناية وديعة عليه قطرة صغيرة من كربونات الأمونيوم 1٪ لمدة 10 ثانية. ترك الشبكة لتجف لمدة 5 دقائق.
- انتقل إلى الإلكترون المجهري في 200 كيلو.
- وضع شبكة على حامل. إدخال حامل في المجهر. تحقق نظرة عامة الفراغ عن طريق النقر على أيقونة المقابلة. والصمامات وثيقة وتبدأ المراقبة في حجم البقعة 5، والتكبير من العاشر 25000.
- قياس الفيروس العملاق باستخدام يماغيج أو مباشرةلاي على المجهر باستخدام أداة قياس المجهر الموجود على الشاشة الاستحواذ.
ملاحظة: تصنيف العينة إلى مجموعة Faustovirus مع حجم القفيصة ما يقرب من 200 نانومتر.
- البيولوجيا الجزيئية
ملاحظة: بعد هذا التحديد، كانت الاختبارات البيولوجيا الجزيئية الحيوية للتأكيد من أجل التمييز Faustovirus من Marseillevirus، والذي له نفس حجم القفيصة والمظهر تحت المجهر الإلكتروني، على الرغم من أنها لم يكن لديك نفس خصوصية المضيف. وMarseillevirus لا يمكن أن تنمو على Vermamoeba، وFaustovirus غير محددة لVermamoeba وفشلت كل المحاولات لتنمو على الأميبا أخرى مثل الشوكميبة قد فشلت حتى الآن، وتصميم وتطبيق أنظمة التمهيدي / مسبار المحددة المدرجة في أعمال Reteno وآخرون. تمكين تصنيف الأولي أكثر دقة من الفيروسات المعزولة حديثا من خلال التضخيم وتسلسل الجينات الفيروسية.- السابقالحمض النووي الجهاز من العينات الثقافة الإيجابية باستخدام نظام استخراج الآلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- أداء في الوقت الحقيقي PCR باستخدام thermocycler كما هو موضح في Reteno وآخرون. 19
- تسلسل باستخدام نفس الاشعال التي استخدمت لتضخيم. استخدام بادئات تستهدف الموجه الحمض النووي RNA البلمرة فرعية 1 الجينات: Fstv_S2F 5'-التقييم القطري المشترك GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 "(إلى الأمام) وFstv_S2R 5'-TTG CAC لجنة مكافحة الإرهاب CGC AGT TAA A-3" (عكس) مع التحقيق Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-طمرة.
4. إنتاج الفيروسات وتنقية وتسلسل الجينوم
- ثقافة فرعية ثقافة الاميبا الفيروس واحدة لنقطة النهاية تخفيف الاستنساخ.
- لإنتاج: إعداد 20 قوارير تحتوي على 30 مل من PYG، 10 مل من الدودي Vermamoeba و 5 مل من الفيروس المعزول نقلت بالفعل من الآبار لقوارير صغيرة.
- احتضان عند 30 درجة مئوية حتى يكتملتحلل من الاميبا. ملاحظة كل يوم بواسطة المجهر الضوئي مقلوب حتى هي lysed كل الاميبا.
- بعد تحلل كامل، تجميع جميع القوارير إلى مستلم واحد. تصفية مع مرشح 0.45 ميكرون لإزالة الحطام.
- بدء تنقية بواسطة تنبيذ فائق في 89800 x ج لمدة 75 دقيقة. تأكد من معايرة الوزن من الأنابيب قبل البدء الطرد المركزي.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف من كل أنبوب بواسطة طموح وإعادة تعليق بيليه في PAS مع نفس الحجم تستخدم لمعايرة، قبل تكرار الطرد المركزي.
- على النحو الوارد أعلاه، وإزالة طاف واعادة تعليق جميع الكريات في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تنقية الفيروسات التي يتم إنتاجها، وذلك باستخدام 25٪ سكروز (27.5 غرام من السكروز في 100 مل من برنامج تلفزيوني وتصفيتها على مرشح 0.22 ميكرون).
- استخدام 8 مل من السكروز و 2 مل من تعليق الفيروسي. أجهزة الطرد المركزي في 89800 x ج لمدة 1 ساعة 15 دقيقة. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني. تخزين في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النظام درس في هذه المخطوطة التحقق من صحة دليل للمفهوم من خلال عزل اثنين Faustoviruses جديدة. من 70 عينة تم اختبارها، تم الكشف عن حلقتين من تحلل، وعلى النقيض من الضوابط السلبية يمكن الاعتماد عليها لدينا. سيطرة سلبية للتحلل الواردة السكان الاميبا 86٪. على النقيض من ذلك، فإن عينات إيجابية (ST1 لسان بيار دي Meyzoargues)، و (LC9 لعينة اسيوتا 9) وأظهرت انخفاضا كبيرا في الاميبات بوابات. كانت هي lysed أكثر من 60٪ من الاميبات مع أعلى نسبة من الحطام. وتمثل هذه النتائج القوية للمرحلة الكشف عن أسلوبنا في الشكل 1. وأكد يوزين / أزرق دازور وتلطيخ دابي وجود مصانع الفيروس داخل الاميبات، كما هو موضح في الشكل (2). وكشف المجهر الإلكتروني المظهر النموذجي للMegavirales مع القفيصة العشرينى الوجوه ، 200 نانومتر في الحجم، وتفتقر إلى الألياف (الشكل 3). وPCR محددة للبحث عن الفيروسات العملاقة، والسلطة الفلسطينيةrticularly لFaustovirus، أكدت النتائج التي توصلنا إليها السابقة. يجب أن يتم التحقق من قبل PCR من أجل القضاء على النتائج غامضة أو العزلة الملوثة. تم استنساخ الفيروسات وإنتاجها وتنقيتها لكامل تسلسل الجينوم. وتقدم مجموعة العوامل الوراثية للFaustoviruses معزولة حديثا تحت Bioproject التالية: PRJEB11169. أظهرت primo-، الصحراء، والأخيرة ثقافة لا الفطرية أو التلوث الجرثومي، لصالح هذا الضرب الفيروسي. الدودي Vermamoeba تسامحت خليط مضاد للفطريات ومضاد حيوي. وكان هذا واضحا في السيطرة السلبية للالاميبات حيث بعد ثلاثة أيام، وثقافة النهائية الواردة أكثر من 80٪ الأميبا تعيش وقدمت Vermamoeba أيضا مجموعة خلية جيد للعزلة، مما ينتج عنه الحمل الفيروسي كبير بعد تحلل.
الشكل 1: كشف تحلل عن طريق التدفق الخلوي الآلي وتمثيلا والبيانات.ر العينتين التي تحصد Faustovirus وأظهرت الاميبا تحلل. وقد استخدم السكان الأميبا تعيش كعنصر تحكم السلبية. وقد صممت بوابتين في مؤامرة FSC SSC، يحتمل أن تكون المقابلة لخلايا والحطام. بعد المباراة النهائية ثقافة مشتركة، تظاهر عدد كبير من الحطام وجود عدوى محتملة في عينات (ST1 وLC9) (B)، بالمقارنة مع السيطرة السلبية التي لم تظهر أي تغييرات كبيرة في السكان بوابات (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فيروس مصانع نموذجية لبعض الفيروسات العملاقة في يوزين / أزرق دازور تلطيخ ودابي السيطرة السلبية تلطيخ تبين خامسا. الدودي نواة باستخدام يوزين / الزرقاء دازور تلطيخ(A)، وتلطيخ دابي (D) (السهام تشير إلى نواة الأميبا). التكبير في 1،000X. (B، C): يوزين / الأزرق تلطيخ دازور في 1،000X التكبير من V. إصابة الدودي مع Faustovirus LC9. السهام تشير إلى نواة الاميبا المصابين circularized، وتتميز مصانع فيروس مع النجمة. (E، F) تلطيخ دابي في 1،000X التكبير من V. إصابة الدودي مع Faustovirus LC9. تشير الأسهم إلى المصانع الفيروس في 8 ساعة بعد العدوى (E)، و 12 ساعة بعد العدوى (F). مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): السلبية تلطيخ ميكرograph. تلطيخ السلبي للتعليق الفيروسي بعد الكشف عن تحلل، والتي تبين Faustovirus الكشف حديثا مع ظهور نموذجية من Megavirales، مع القفيصة العشرينى الوجوه والحجم الإجمالي من 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تكوين PYG | كميات |
| ببتون البروتيوز | 20 ز |
| خلاصة الخميرة | 2 ز |
| MgSO 4. 7H 2 O | 0.980 غرام |
| CaCl 2 | 0.059 غرام |
| سترات الصوديوم. ثنائي الهيدرات | 1 ز |
| الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 × 6 H 2 O | 0.02 ز |
| جلوكوز | 18 ز |
| الماء المقطر ل | 1 L |
| ضبط درجة الحموضة عند 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك أو KOH. | |
| الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. | |
| متوسطة المجاعة | كميات |
| خلاصة الخميرة | 2 ز |
| جلوكوز | 18 ز |
| الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O | 0.02 ز |
| PAS (مفصلة أدناه) | 1 L |
| تمت تصفيتها على 0.22 ملم | |
| PAS حل ل | كميات |
| KH 2 PO 4 | 0.136 غرام |
| نا 2 هبو 4 | 0.142 غرام |
| PAS حل B | كميات |
| MgSO 4 .7H 2 O | 4.0 ملغ |
| CaCl 2 .2H 2 O | 4.0 ملغ |
| كلوريد الصوديوم | 0.120 غرام |
| يتم إضافة 10 مل من كل حل A و B في 1 لتر من الماء المقطر. | |
الجدول 1: الحل صفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
احتمال أن Faustovirus يمكن أن يكون أول عضو من عائلة Megavirales جديدة قريبة من ASFV كان أول من اقترح من قبل Reteno وآخرون، 19 ولكن لا يزال من الممكن تمييز بعض الاختلافات. ويبدو واضحا ما إذا كانت Faustovirus أن تنضم إلى عائلة فيروسات حمى الخنازير الأفريقية وما يتصل بها أو ما إذا كان ينبغي بدلا من ذلك تكوين أسرة الفيروسية المفترضة الجديدة. وسوف تتطلب هذه المسألة مزيدا من التحقيق، ولا سيما توصيف أكثر شمولا من التشكل لها، مجموعة والمضيف، دورة النسخ المتماثل وذخيرة الجينات. يجب أن تكون معزولة عن Faustovirus المورثات من أجل التوسع في عموم الجينوم ولفهم أفضل للأصول والأقارب من هذه المجموعة الفيروسية أو العائلة. تقنية كنا سمحت لنا لمواصلة عزل أعضاء جدد من هذه العائلة الجديدة المحتملة. ويقترن هذا الأسلوب مع تقنية ثقافة مشتركة معدلة بشكل طفيف، الذي يعمل بمثابة خطوة تخصيب للكشف عن أفضل. الوقت اللازم من قبل التدفق الخلوي للحصول على بيانات عن هو جين تاولا يتجاوز ndreds عينات مدة نصف ساعة، وهو مكسب كبير بالمقارنة مع نظام المشاركة في الثقافة القياسي السابق. 9 الأسلوب هو أفضل بكثير من نظام المعيار السابق، لا سيما من حيث لحساسية أعلى وتقدير دقيق.
من 70 عينات أطلقت، ونحن عزل اثنين من مزيد Faustoviruses من مياه الصرف الصحي، والتي يمكن أن توفر معلومات حول خصوصية البيئة والنظام الإيكولوجي من هذا الفيروس. وبالفعل، فإن خصوصية Faustovirus للأولاني الدودي Vermamoeba، 19 فضلا عن تصنيف جديد من HcDNAV بين فيروسات حمى الخنازير الأفريقية وما يتصل بها (23) والواقع أن هذا الفيروس يصيب العديد من السلالات من دوامي السياط Heterocapsa النيابة ولكن غير قادر على إصابة أنواع أخرى من العوالق النباتية 24 يوحي بحضور المضيف خصوصية بين Asfarvirus أو الأقارب المقربين.
وتعني هذه النتائج أن استخدام الدعامات الخلوية الجديدة التي تعمل علىق المضيفين محددة أو غير محددة، والتي يمكن أن تؤوي هذا النوع من الفيروسات. لدينا تقنية يمكن أن تتكيف مع أنواع أخرى من الطلائعيات في ظروف مختلفة. التقدم علامات أسلوبنا في مجال تقنيات العزل والثقافة الفيروسية. وباختصار، الخطوات التخصيب مع مزيج مضاد للجراثيم ومضاد للفطريات الأنسب حاسمة للقضاء على أي تلوث بكتيري أو فطري ممكن. وكان لدينا المتوسطة المجاعة أفضل حل للحفاظ على الأميبا في أفضل الظروف لثقافة مشتركة، في حين أن متوسط تقييم الأداء المستخدمة في الثقافة الروتينية يبدو غير مناسب للVermamoeba النيابة، لوحظ تكيس سريع بعد 24 ساعة من الحضانة. وكانت هذه خطوة كبيرة نحو ظروف التربية المثلى حيث التقنيات السابقة قد فشلت حتى الآن. من أجل الحصول على أفضل النتائج باستخدام بروتوكولات الثقافة وصفها هنا، فمن المستحسن استخدام الاميبات جديدة قادرة على البلعمة. يجب أن يكون خليط مضاد حيوي ومضاد للفطريات غير سامة لالأولانيات . وبالتالي، فمن المستحسن لاختبار جدوى الأوالي المستخدمة في الخليط. يجب تعقيم جميع المواد المستخدمة. وينبغي إجراء العمل في الميكروبيولوجية تأمين وظيفة من الدرجة الثانية لتجنب أي تلوث محتمل. ينبغي احترام مرات الحضانة والمراحل الثلاث للثقافة كما هو موضح. الوقت اللازم للتجهيز لكشف التدفق الخلوي يمكن معايرة اعتمادا على الكائنات التي شملتها الدراسة. يمكن ملاحظة تحول طفيف في عدد السكان من النابضة الأصلي، ولكن هذا يعتمد على سيطرة سلبية موثوقة تستخدم مجموعة مرجعية.
البكتيريا المقاومة للموضوع التي يمكن العثور عليها في ثقافة وهي مسببات الأمراض للالاميبا يمكن أن تحد نوعا ما لدينا وسيلة العزل الفيروسي، حيث أننا يمكن أن يكون نمو البكتيريا اخفاء الضرب الفيروسات. تنويع مزيج مضاد حيوي أو حتى الترشيح الثقافة من أجل القضاء على البكتيريا من أكثر من 200 نانومتر الحجم يجب أن إدارة هذا الحد في بعض الأحيان.
"> جميع هذه الشروط تكييفها توفر إجراء العزل الأمثل الجديد، الذي يدعم تكاثر الفيروس. تقدم هذه التقنية ميزة كبيرة في اكتشاف الفيروسات الجديدة، لا سيما Megavirales، من أجل فهم أفضل تنوعها، أصول، والمرضية المحتملة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
