Abstract
Isolasjon av gigantiske virus er av stor interesse for denne nye æra av virologi, spesielt siden disse gigantiske virus er relatert til protister. Giant virus kan være potensielt patogene for mange arter av protister. De tilhører den nylig beskrevet orden Megavirales. Den nye linjen Faustovirus som er isolert fra kloakkprøver er fjernt beslektet til pattedyr patogenet afrikansk svinepest-virus. Dette viruset er også spesifikk for sin amoebal vert, Vermamoeba vermiformis, en protoktister vanlig i helsevesenet vannsystemer. Det er viktig å fortsette å isolere nye Faustovirus genotyper for å forstørre sin genotype innsamling og studere dens pan-genom. Vi har utviklet nye strategier for isolering av ytterligere stammer ved å forbedre bruken av antibiotika og antisopp-kombinasjoner for å unngå at bakterier og sopp forurensninger av amøbe ko-kultur og som favoriserer viruset multiplikasjon. Vi har også implementert en ny starvation medium for å opprettholde V. vermiformis i optimale forhold for virus co-kultur. Til slutt har vi brukt flowcytometri i stedet for mikroskopisk observasjon, noe som er tidkrevende, å detektere den cytopatogen effekt. Vi erholdt to isolater fra kloakkprøvene, noe som viser effektiviteten av denne fremgangsmåte, og således utvide samlingen av Faustoviruses, for bedre å forstå deres miljø, vertsspesifisitet og genetiske innhold.
Introduction
Oppdagelsen av store virus, spesielt de som tilhører den Megavirales orden, helt forandret verden av virus når det gjelder partikkelstørrelse og genom kompleksitet. Virus ble tidligere antatt å være små enheter, og Mimivirus syntes å bryte alle regler. 1 Metagenomic data antyder ubiquity av gigantiske virus ikke bare i miljøet, 2-5 men også hos mennesker. 6 Derfor er det fortsatt behov å søke etter disse virusene i stor skala. Mangfoldet av disse gigantiske virus ble vurdert ved prøvetaking ikke bare et utvalg av vannmiljøer og tilhørende sedimentene over hele verden, 7-11 men også ved screening en rekke humane prøver 12,13 og miljøprøver. 7,9 De Acanthamoeba polyphaga mimivirus var isoleres ved co-kultur ved hjelp phagocytic protister, primært Acanthamoeba spp. 14-16 En hel samling av gigantiske virus var da ogsåisolert fra dette spesifisert protoktister vert, noe som gjorde det vitenskapelige samfunn begrense sin forskning og isolasjon prosedyre for Acanthamoeba spp. Klart dette avhengighet av en enkelt vert art har resultert i at en stor fraksjon av virus blir oversett. Det faktum at den gigantiske virus, CroV, ble isolert med svært bevegelige marine protozoer Kafeteria roenbergensis, 17,18 demonstrerer behovet for å bruke et bredere spekter av protozoer for å oppdage nye linjer eller familier av gigantiske virus. Reteno et al. Greid å velge andre protozoer som celle verter som aldri tidligere hadde blitt brukt, og isolert den nye Asfar relaterte avstamning av gigantiske virus (den nylig kåret Faustovirus). 19
I et forsøk på å isolere nye Faustovirus genotyper for å utvide medlemmene av denne viral avstamning, endret vi våre isoleringsprosedyrer og brukte dem til å screene miljøprøver i stand til å høste nye Faustoviruses. Vi deretterbeskrev hele protokollen for å karakterisere de nye isolatene. Vi vurderte Vermamoeba vermiformis, den vanligste frittlevende protoktister funnet i menneskelige omgivelser, 20-22 som allerede brukes i isolering av den første Faustovirus prototype E12. 19 Dette protoktister er for tiden fortsatt vert spesifikke for Faustovirus. Vi visste at ingen av de kjente gigantiske virus var patogene for dette amøbe, fordi ingen forsøk på å vokse andre gigantiske virus i vårt laboratorium viste amøbe lyse eller viral vekst. Av denne grunn, tror vi at V. vermiformis er den beste og mest unike celle støtte kjent for å isolere nye Faustoviruses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetaking
- Samle 70 prøver fra ulike miljøer og regioner. I dette tilfellet kan du bruke følgende: 5 skitne vannprøver fra landsbyen Saint Pierre de Meyzoargues (Frankrike), 15 prøver fra innsjøen i Parc Borély i Marseille (Frankrike); 15 sjøvannsprøver med sediment fra steinete viker på Samena i Marseille (Frankrike), 25 river vannprøver fra Alpene (Frankrike), og til slutt, 10 prøver fra kloakk i La Ciotat (Frankrike).
- Vortex prøver for homogenisering før inokulering, i ett minutt ved romtemperatur uten noen form for behandling.
2. Isolering Prosedyre
- Host Forberedelse til Blind Kultur Prosedyrer og Sample Inoculation
- Bruk V. vermiformis (stamme CDC19) som en celle støtte for den ko-kulturen.
- Opprettholde amøber ved 28 ° C, i en 75 cm2 cellekulturkolbe med 30 ml protease-pepton-gjærekstrakt-glucose-medium (PYG). Vennligst sjekk PYG sammensetningen i tabell 1.
Merk: Etter 48 timer er amøber kvantifisert ved en normal count bruker telle lysbilder (f.eks Kovaslides). - Høste celler ved en konsentrasjon på 5 x 10 mai-10 juni celle / ml, og pelleten amøber ved sentrifugering ved 720 xg i 10 min.
- Fjern supernatanten ved aspirasjon og re-suspendere amøber pellet i 30 ml sterilt sidens amoebal saltvann (PAS) Tabell 1. Gjenta denne skylling prosedyren.
- Re-suspen amøber i 30 ml sultemedium med et antibiotikum og soppdrepende blanding ved en konsentrasjon på ca. 10 6 amoeba / ml. Den sult medium er en overlevelse medium for amøben, slik at det å holde seg i live uten innkapsling eller multiplikasjon. Sjekk preparat i tabell 1.
Merk: Den antimikrobielle midlet blanding inneholdt 10 ug / ml vancomycin, 10 ug / ml imipenem, 20 ug / ml ciprofloxacin, 20 μg / ml doksycyklin, og 20 pg / ml vorikonazol. Denne blandingen tjente til å redusere bakterie- og soppforurensning som kan redusere eller forandre viral multiplikasjon. - Direkte inokulering av 25 ul av hver prøve på 200 ul amøbe monolag i en 96-brønns plate flat bunn favoriserer amøbe tilslutning og inkuber ved 30 ° C i et fuktig miljø (et fuktig miljø består av å plassere en våt kompress på innsiden av posen inneholdende plate for å unngå fordampning). Dette er primo-kulturen. La to brønner av amøber uten sample vaksinasjon; Dette fungerer som en negativ kontroll. Inkuber dette primo-kulturen i tre dager.
- Tre dager etter den første inokulering, sub-kultur Primo-kulturplaten på fersk amøber som beskrevet ovenfor, uten noen mikroskopisk observasjon. Inkuber ny plate i tre dager under de samme vilkår som primo-kulturen.
- Utføre den endelige kulturen etter at disse tre dagers inkubasjon på samme måte som for the primo- og sub-kultur. Inkuber den endelige kulturen i to dager. Deretter videre til deteksjon.
- Påvisning av Lysis av automatiserte flowcytometrisystemer
Merk: Blind kultur kombinert med flowcytometri skiller seg fra den tidligere standard system av isolasjon. Det er mer følsom, presis og automatisert. For deteksjonsformål, søkte vi en ny teknikk utviklet for å detektere lysis ved høyeste hastighet og uten mikroskopisk observasjon. Denne teknikk er fordelaktig for screeningprøver og har bedre følsomhet enn eldre teknikker. 7-9- Bruk 96-brønns plate i det avsluttende ko-kulturen for å detektere lysis.
- Slå på cytometeret og kjøre en ren og skylling for å få lavere bakgrunnsstøy i henhold til produsentens protokoll.
- Start høy gjennomstrømning Sampler (HTS) kombinert med flowcytometer å laste automatisk prøver fra 96-brønns plate og utføre en fullstendig automatisert oppkjøp innen 40 min according til produsentens protokoll.
- Sett opp HTS som følger: prøvevolum 150 ul, blanding volum 50 ul, blandehastighet 180, antall blandinger 5, vasking volum mellom hver prøve ble 400 ul, strømningshastighet 2,5 mL / sek, antall registrerte hendelser 10.000.
- Vurdere de negative kontrollbrønnene til det endelige samkultur mikroplate først for å gate amøbe populasjon og å bestemme prosentandelen av disse celle vertene i henhold til deres fysiske egenskaper. Sørg for å ha en homogen amøbe befolkning og en andre populasjon av en lavere hendelser tilsvarende rusk og støy.
Merk: Denne gating prosedyren skiller subcellulære rusk og klumper fra enkeltceller ved størrelse, anslått av fremover scatter. Det er derfor viktig å nøyaktig bestemme prosentandelen av hver populasjon med best mulig gating prosedyre. Disse prosentene kan variere, særlig hvis mange typer protozoer er brukt, så det er viktig alltid å ha en negative kontroll, som kan benyttes som referansegruppen for resten av prøvene. - Start gating ved å klikke erverve prøven.
- Registrere antall hendelser ikke mindre enn 10.000 hendelser.
- Lokal amøben populasjonen ved hjelp av pilen. Dette er hvordan du definerer portene.
- Etter gating, la HTS sted eller finne plate ved å klikke på "Hjem", og deretter kjøre hele platen automatisk. Utfør datainnsamling og analyse i henhold til størrelse og struktur parametre (henholdsvis FSC (forover scatter) og SSC (side scatter)).
Merk: Oppdager tap av amøbe-gated befolkningen signaler nærvær av en sykdomsfremkallende middel ansvarlig for amøbe lyse. Protozoer lysis forbundet med virus infeksjon påvises med et vilkårlig utformet terskel på 50% lysering av den amøbe befolkningen gated av analysatoren og sammenlignet med det samme ikke-infiserte populasjonen anvendt som en pålitelig negativ kontroll.
- Foreløpige Farging å avsløre tilstedeværelsen av Giant virus
- Etter lyse oppdaget av flowcytometri, pipette de lyserte co-kulturer å suspendere de resterende amøber. Deretter direkte cytosentrifuge 50 pl av suspensjonen ved 800 xg i 10 min.
- Etter sentrifugering fikse lysbilder med en ren metanol løsning. Flekk lysbildene ved hjelp av en kommersiell rask farging av eosin / blå Azur og DAPI flekker og observere under et lysmikroskop på 1,000X forstørrelse for å se på tilstedeværelsen av virus fabrikker.
- For hurtig farging, stupe skinnene inn i den første eosin-oppløsning (4 sek gjentatt tre ganger) og deretter passere direkte å stupe glir inn i det andre fikseringsoppløsning inneholdende blå Azur til 6 sekunder, og til slutt skylles lysbilder for 45 sek med en fosfatbufferoppløsning pH 7,2. La lysbilder tørke i romtemperatur, deretter videre til observasjonpå.
- For DAPI flekker, innskudd 15 mL av DAPI kommersielle stamløsning på den faste tørr lysbilde. Beskytt mot lys deretter videre til observasjon.
- elektron~~POS=TRUNC
- Etter den første identifikasjon på sidene ved å vurdere tilstedeværelse av den gigantiske viruset gjennom elektronmikroskopi observasjon av supernatant kulturer.
- Depositum 5 mL av den positive prøven på gløden-utladet rutenett. Vent i ca. 20 minutter ved romtemperatur.
- Tørk risten nøye og innskudd på den en liten dråpe av 1% ammoniummolybdat i 10 sek. La nettet tørke i 5 min.
- Fortsett til elektronmikroskopi ved 200 keV.
- Sett risten på holderen; innføre holderen inn i mikroskopet. Kontroller vakuum oversikt ved å klikke på det tilsvarende ikonet. Lukke ventiler og begynne observasjon på en flekk størrelse 5, og forstørrelse av x 25.000.
- Mål giganten virus ved hjelp ImageJ eller direktely på mikroskopet ved bruk av måleverktøyet i mikroskop som ligger på kjøpet skjermen.
Merk: Gi prøven inn i Faustovirus gruppen med et kapsid størrelse på omtrent 200 nm.
- Molekylbiologi
Merk: Etter denne identifikasjonen, molekylærbiologi testene var avgjørende for bekreftelse for å skille Faustovirus fra Marseillevirus, som har samme kapsid størrelse og utseende i henhold til elektronmikroskopi, selv om de ikke har samme vertsspesifisitet. Den Marseillevirus kan ikke vokse på Vermamoeba er Faustovirus spesifikke for Vermamoeba og alle forsøk på å vokse det på andre amøbe som Acanthamoeba har mislyktes i å date. Utformingen og anvendelsen av de spesifikke primer / sondesystemer oppført i verk av Reteno et al. aktivert en mer presis foreløpig klassifisering av de nylig isolerte virus gjennom forsterkning og sekvensering av de virale gener.- exskrift DNA fra de positive kulturprøver ved bruk av et automatisert utvinningssystem i henhold til produsentens protokoll.
- Utfør Real-time PCR ved hjelp av en termo som beskrevet i Reteno et al. 19
- Sekvens anvendelse av de samme primerne som ble brukt for forsterkning. Bruk primere rettet mot DNA-rettet RNA-polymerase subenheten 1 genet: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(fremover) og Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (bakover) med den Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA sonde.
4. Virus Production, Rensing og Genome Sequencing
- Subkultur det enkelt virus amøbe kultur for sluttpunktet fortynning kloning.
- For fremstilling: forberede 20 kolber inneholdende 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis og 5 ml av det isolerte virus som allerede er overført fra brønner til små kolber.
- Inkuber ved 30 ° C inntil fullstendiglyse av amøben. Observere hver dag av invertert optisk mikroskopi til alle amøbe lyseres.
- Etter fullført lyse, basseng alle kolber til en mottaker. Filter med et 0,45 um filter for å eliminere rester.
- Start rensing ved hjelp av ultrasentrifugering ved 89 800 xg i 75 min. Sørg for å kalibrere vekten av rørene før sentrifugering.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten fra hvert rør ved aspirasjon og re-suspendere pelleten i PAS med det samme volum som brukes for kalibrering, før gjentatt sentrifugering.
- Som ovenfor, fjern supernatanten og re-suspen alle pellets i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Rense viruset som blir produsert, ved anvendelse av 25% sukrose (27,5 g sukrose i 100 ml PBS, filtrert på et 0,22 um filter).
- Bruk 8 ml sukrose og 2 ml av virussuspensjonen. Sentrifuger ved 89800 x g i 1 time 15 min. Re-suspendere pellet i 1 ml PBS. Oppbevar ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemet studert i dette manuskriptet validert sitt bevis på konseptet ved å isolere to nye Faustoviruses. Av de 70 prøvene som ble testet, ble to episoder av lysis detektert, i motsetning til våre pålitelige negative kontroller. Den negative kontrollen for lyse inneholdt en 86% amøbe befolkningen. I motsetning de positive prøvene (ST1 for Saint Pierre de Meyzoargues), og (LC9 for La Ciotat prøve 9) viste en dramatisk nedgang i gated amøber; mer enn 60% av amøber ble lysert med høyest prosentandel av rusk. Disse robuste resultatene av deteksjonen trinn av vår fremgangsmåte er representert i figur 1. Eosin / blå Azur og DAPI farging bekreftet tilstedeværelsen av virus fabrikker inne i amøber, vist i figur 2. Elektronmikroskopi avslørte den typiske utseende av Megavirales med en icosahedral kapsid , 200 nm i størrelse, og mangler fibriller (figur 3). En spesifikk PCR for giganten virus, particularly for Faustovirus, bekreftet våre tidligere funn. Det må kontrolleres ved PCR for å eliminere tvetydige resultater eller forurenset isoleringer. Virusene ble klonet, produsert og renset for hele genomet sekvensering. Genomene til de nylig isolerte Faustoviruses er avlagt under følgende Bioproject: PRJEB11169. Den primo-, sub-, og finale kultur viste ingen sopp eller bakteriell forurensning, favoriserer dette viral multiplikasjon. Vermamoeba vermiformis tolerert anti-sopp og antibiotika blanding. Dette var klart i negativ kontroll med amøber der etter tre dager, den endelige kultur inneholdt mer enn 80% levende amøbe. Vermamoeba også gitt en god celle vert for isolasjon, produsere en betydelig virusmengde etter lyse.
Figur 1: Lysis deteksjon av automatiserte flowcytometri Dataene representert.t de to utvalgene, som høstet Faustovirus og viste amøbe lyse. En levende amøbe populasjon ble brukt som en negativ kontroll. To porter ble utformet i FSC-SSC tomt, potensielt tilsvarende celler og rusk. Etter den siste co-kultur, en stor bestand av rusk viste tilstedeværelsen av en eventuell infeksjon i prøvene (ST1 og LC9) (B), sammenlignet med negativ kontroll som viste ingen vesentlige endringer i gated populasjoner (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Virus fabrikker typiske for noen gigantiske virus i Eosin / blå Azur farging og DAPI farging Negativ kontroll viser V.. vermiformis kjernen bruker Eosin / blå Azur farging(A), og DAPI farging (D) (pilene peker til kjernen av amøbe). Forstørrelse på 1,000X. (B, C): Eosin / blå Azur farging ved 1,000X forstørrelse av V. vermiformis infisert med Faustovirus LC9. Piler peker på kjernen av sirkularisert smittet amøbe, er virus fabrikker merket med en stjerne. (E, F) DAPI farging ved 1,000X forstørrelse av V. vermiformis infisert med Faustovirus LC9. Pilene peker på virus fabrikker på 8 timer etter infeksjon (E), og 12 timer etter infeksjon (F). Scale bar 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Negativ farging micrograph. Negativ farging av viral suspensjon etter lyse deteksjon, viser nylig oppdaget Faustovirus med den typiske utseende Megavirales, med en icosahedral kapsid og en total størrelse på 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PYG sammensetning | mengder |
| proteose peptone | 20 g |
| Gjærekstrakt | 2 g |
| MgSO4. 7H 2 O | 0.980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| citrate natrium. dihydrate | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 x 6 H2O | 0,02 g |
| glukose | 18 g |
| destillert vann for | 1 L |
| Juster pH på 6,8 med HCl eller KOH. | |
| Autoklaver 15 min ved 121 ° C. | |
| sult medium | mengder |
| Gjærekstrakt | 2 g |
| glukose | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O | 0,02 g |
| PAS (beskrevet nedenfor) | 1 L |
| Filtrert på 0,22 mm | |
| PAS løsning A | mengder |
| KH 2 PO 4 | 0,136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0,142 g |
| PAS løsning B | mengder |
| MgSO4 .7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl 2 .2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml av hver oppløsning A og B, blir tilsatt til 1 liter destillert vann. | |
Tabell 1: Løsning oppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muligheten for at Faustovirus kan være den første del av en ny familie Megavirales nær ASFV ble først foreslått av Reteno et al., 19 men noen forskjeller kan fremdeles skjelnes. Det synes uklart om Faustovirus bør bli medlem av Asfarviridae familien eller om det bør i stedet danne en ny antatt viral familien. Dette problemet vil kreve ytterligere undersøkelser, spesielt en mer omfattende karakterisering av dens morfologi, vertsområde, replikasjonssyklus og genet repertoar. Flere Faustovirus genotyper bør isoleres for å utvide den pan-genomet og for bedre å forstå opprinnelsen og slektninger av denne viral gruppe eller familie. Teknikken vi brukte mulig for oss å fortsette å isolere nye medlemmer av denne potensielle nye familien. Denne teknikken blir koblet med litt modifisert ko-kultur teknikk, som virker som en berikelse trinn for bedre deteksjon. Den tiden som kreves av flowcytometri for innsamling av data for hundreds av prøvene ikke overstiger en halv time, noe som er en stor fordel i forhold til forrige standard co-kultur system. 9 Teknikken er langt bedre enn den forrige standardsystemet, spesielt i form av sin høyere følsomhet og presis kvantifisering.
Av de 70 prøvene som ble lansert, isolert vi ytterligere to Faustoviruses fra kloakk, som kan gi informasjon om miljø spesifisitet eller økosystem av dette viruset. Faktisk spesifisiteten av Faustovirus for protoktister Vermamoeba vermiformis, 19 samt den nye klassifiseringen av HcDNAV mellom Asfarviridae 23 og det faktum at dette viruset infiserer mange stammer av dinoflagellate Heterocapsa spp men er ute av stand til å infisere andre typer Planteplankton 24 antyder tilstedeværelsen av host-spesifisitet blant Asfarvirus eller dets nære slektninger.
Disse funnene antyder bruk av nye mobilnettet støtter opptrer ener spesifikke eller uspesifikke vertene, som kan gjemme slike virus. Vår teknikk kan tilpasses til andre typer av protister i forskjellige forhold. Vår metode merker fremgang i form av virusisolasjons og kultur teknikker. I sammendraget, berikelse trinn med den mest passende antibakterielle og soppdrepende blanding er avgjørende for eliminering av eventuelle bakterier eller soppsporer. Vår sult medium var den beste løsningen for å opprettholde amøbe i de beste forutsetninger for co-kultur, mens PAS medium som brukes i rutine kultur synes å være upassende for Vermamoeba spp, fordi rask innkapsling ble observert etter 24 timers inkubasjon. Dette var et stort skritt mot optimale dyrkningsforhold der tidligere teknikker hadde så langt mislyktes. For å oppnå de beste resultatene ved hjelp av kultur protokollen beskrevet her, er det anbefalt å bruke fersk amøber i stand til fagocytose. Antibiotika og soppdrepende blanding bør være ikke-giftig for protister ; Derfor er det anbefalt å teste levedyktighet av brukt protozoon på blandingen. Alle materialer som brukes bør steriliseres. Arbeidet skal utføres i et mikrobiologisk sikret innlegg klasse II for å unngå sannsynlig forurensning. Inkubasjonstider og de tre stadier av kultur bør respekteres som beskrevet. Behandlingstiden for flowcytometri deteksjon kan kalibreres avhengig av organismene som ble studert. En liten forskyvning i populasjonen fra den opprinnelige lede kan observeres, men dette avhenger av pålitelig negative kontrollen anvendt som en referanse befolkning.
Multiresistente bakterier som kan finnes i kultur og er patogener for amøbe kan liksom begrense vår viral isolasjonsmetoden, hvor vi kan ha bakterievekst maske virus 'multiplikasjon. Varierende den antibiotiske blanding eller til og med filtrering av kulturen for å fjerne bakteriene på mer enn 200 nm størrelse bør leder denne begrensningen noen ganger.
"> Alle disse er tilpasset forholdene tilby en ny optimal isoleringsprosedyren, som støtter viral multiplikasjon. Denne teknikken gir en betydelig fordel i oppdagelsen av nye virus, spesielt Megavirales, for å bedre forstå deres mangfold, opprinnelse, og potensialet patogenitet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
