Abstract
L'isolamento del virus giganti è di grande interesse in questa nuova era di virologia, soprattutto perché questi virus giganti sono legati alla protisti. i virus giganti possono essere potenzialmente patogeni per molte specie di protisti. Essi appartengono all'ordine recentemente descritto di Megavirales. La nuova stirpe Faustovirus che è stato isolato da campioni di acque reflue è lontano parente del virus della peste suina africana mammiferi patogeno. Questo virus è anche specifico per il suo ospite amoebal, vermiformis Vermamoeba, un protista comune nei sistemi idrici sanitari. E 'fondamentale continuare a isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di ampliare la sua collezione genotipo e studiare la sua pan-genoma. Abbiamo sviluppato nuove strategie per l'isolamento di ceppi supplementari migliorando l'uso di combinazioni di antibiotici e antifungini per evitare contaminazioni batteriche e fungine della co-coltura amebe e favorendo la moltiplicazione del virus. Abbiamo anche implementato un nuovo starvation medio di mantenere V. vermiformis in condizioni ottimali per i virus co-coltura. Infine, abbiamo utilizzato la citometria a flusso anziché osservazione microscopica, che richiede tempo, per rilevare l'effetto citopatico. Abbiamo ottenuto due isolati da campioni di depurazione, dimostrando l'efficacia di questo metodo e ampliando così la raccolta di Faustoviruses, per capire meglio il loro ambiente, specificità dell'ospite e contenuto genetico.
Introduction
La scoperta del virus giganti, specialmente quelli appartenenti all'ordine Megavirales, completamente cambiato il mondo dei virus in termini di dimensione delle particelle e del genoma complessità. I virus sono stati precedentemente pensato per essere piccole entità, e la mimivirus sembravano rompere tutte le regole. 1 metagenomiche dati suggeriscono l'ubiquità di virus giganti, non solo per l'ambiente, 2-5 ma anche negli esseri umani. 6 Pertanto, non vi è ancora la necessità per la ricerca di questi virus su larga scala. La diversità di questi virus giganti è stata valutata mediante il campionamento non solo una varietà di ambienti acquatici e delle loro sedimenti associati in tutto il mondo, 7-11 ma anche con la proiezione di una serie di campioni umani 12,13 e campioni ambientali. 7,9 I mimivirus Polyphaga Acanthamoeba è stato isolato dal co-coltura con protisti fagocitosi, soprattutto Acanthamoeba spp. 14-16 un'intera collezione di virus giganti sono stati poi ancheisolata da questo host protista specificato, che ha reso la comunità scientifica limitare la sua procedura di ricerca e di isolamento per Acanthamoeba spp. Chiaramente questo affidamento su una singola specie ospite ha portato ad una grande frazione di virus essere trascurato. Il fatto che il virus gigante, CroV, è stato isolato con il altamente mobili marino protozoi Caffetteria roenbergensis, 17,18 dimostra la necessità di utilizzare una gamma più ampia di protozoi, al fine di scoprire nuove linee o famiglie di virus giganti. Reteno et al. Sono riusciti a selezionare altri protozoi come host di cellule che non era mai stato utilizzato in precedenza, e isolato la nuova stirpe Asfar correlati di virus giganti (il nuovo nome Faustovirus). 19
Nel tentativo di isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di espandere i membri di questo lignaggio virale, abbiamo modificato le nostre procedure di isolamento e li hanno usati per lo screening campioni ambientali capaci di raccolta nuovi Faustoviruses. abbiamo poidescritto l'intero protocollo per caratterizzare i nuovi isolati. Abbiamo valutato vermiformis Vermamoeba, il protista a vita libera più comune in ambienti umani, 20-22 che è già utilizzato per l'isolamento del primo prototipo Faustovirus E12. 19 Questo protista è attualmente ancora-host specifico per Faustovirus. Sapevamo che nessuno dei virus noti giganti era patogeni per questa ameba, perché nessun tentativo di crescere altri virus giganti nel nostro laboratorio ha mostrato lisi ameba o la crescita virale. Per questo motivo, riteniamo che V. vermiformis è il migliore e più unico supporto di cellule noto per isolare nuovi Faustoviruses.
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Protocol
Raccolta 1. Esempio
- Raccogliere 70 campioni provenienti da diversi ambienti e regioni. In questo caso, utilizzare i seguenti: 5 campioni di acqua sporca dal villaggio di Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 campioni dal lago nel Parc Borély a Marsiglia (Francia); 15 campioni di acqua di mare con sedimenti dalle insenature rocciose a Samena a Marsiglia (Francia), 25 campioni di acqua del fiume dalle Alpi (Francia), e, infine, 10 campioni di acque reflue a La Ciotat (Francia).
- campioni Vortex per omogeneizzazione prima inoculando, per un minuto a temperatura ambiente senza alcun trattamento.
Procedura 2. Isolamento
- Host Preparazione per le procedure non vedenti Cultura e inoculazione del campione
- Usa V. vermiformis (ceppo CDC19) come supporto di cellule per la co-coltura.
- Mantenere la amebe a 28 ° C, in 75 cm pallone di coltura cellulare 2 con 30 ml di proteasi peptone-lievito medio estratto-glucosio (PYG). Si prega di verificare la composizione PYG nella tabella 1.
Nota: Dopo 48 ore, amebe sono quantificata una conta normale usando diapositive di conteggio (ad esempio, Kovaslides). - Celle di raccolta ad una concentrazione di 5 x 10 5 al 10 6 celle / ml, e pellet amebe per centrifugazione a 720 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet amebe in 30 ml di soluzione fisiologica sterile amoebal di pagina (PAS) Tabella 1. Ripetere la procedura di lavaggio.
- Risospendere amebe in 30 ml di terreno inedia con una miscela antibiotica e antimicotica ad una concentrazione di circa 10 6 amebe / ml. Il mezzo la fame è un mezzo di sopravvivenza per l'ameba, permettendogli di rimanere in vita senza incistamento o moltiplicazione. Controlla composizione in Tabella 1.
Nota: Il mix agente antimicrobico conteneva 10 mg / ml vancomicina, 10 mg / ml imipenem, 20 mg / ml di ciprofloxacina, 20 μg / ml doxiciclina, e 20 ug / ml voriconazolo. Questa miscela è servita a ridurre la contaminazione batterica e fungina che può diminuire o alterare la moltiplicazione virale. - Direttamente inoculare 25 ml di ogni campione sul 200 microlitri amebe monostrato in un fondo piatto piastra a 96 pozzetti favorire l'aderenza amebe e incubare a 30 ° C in un ambiente umido (un ambiente umido consiste nel porre un impacco bagnato all'interno sacchetto contenente il piastra per evitare l'evaporazione). Questo è il primo-coltura. Lascia due pozzi di amebe senza inoculazione del campione; questo agisce come controllo negativo. Incubare questo primo-cultura per tre giorni.
- Tre giorni dopo il primo inoculo, subcultura piastra primo-coltura su amebe fresca come descritto sopra senza alcuna osservazione microscopica. Incubare la nuova piastra per tre giorni sotto le stesse condizioni del primo-coltura.
- Eseguire la coltura, dopo questi tre giorni di incubazione stesso modo come per the primo- e sub-cultura. Incubare la cultura finale per due giorni. Quindi procedere al rilevamento.
- Rilevazione di Lysis da Automated citometria a flusso
Nota: la cultura cieco accoppiato con flusso differisce citometria dal precedente sistema standard di isolamento. E 'più sensibile, preciso e automatizzato. Per scopi di rilevamento, abbiamo applicato una nuova tecnica sviluppata per rilevare lisi alla massima velocità e senza osservazione microscopica. Questa tecnica è vantaggiosa per i campioni di screening e ha una migliore sensibilità rispetto alle tecniche più anziani. 7-9- Utilizzare la piastra a 96 pozzetti della co-coltura finale per rilevare lisi.
- Accendere il citometro ed eseguire un ciclo di pulizia e di risciacquo in modo da ottenere il rumore di fondo più basso secondo il protocollo del produttore.
- Avviare l'High Throughput Sampler (HTS) in combinazione con citofluorimetro per caricare automaticamente i campioni dalla piastra a 96 pozzetti e di eseguire una acquisizione completamente automatizzato entro 40 min According il protocollo del produttore.
- Impostare i HTS come segue: volume del campione 150 microlitri, mescolando il volume 50 ml, velocità 180, il numero di miscele 5 miscelazione, il volume di lavaggio tra ogni campione di 400 ml, portata 2,5 ml / sec, il numero di eventi registrati 10.000.
- Valutare i pozzetti di controllo negativo della co-coltura micro-piastra finale di per cancello popolazione amebe e per determinare la percentuale di questi host cellule secondo le loro caratteristiche fisiche. Essere sicuri di avere una popolazione un'ameba omogenea e una seconda popolazione di un eventi inferiore corrispondente a detriti e rumore.
Nota: Questa procedura gating distingue detriti subcellulare e grumi da singole cellule per dimensione, stimati dalla dispersione in avanti. È pertanto importante determinare con precisione la percentuale di ciascuna popolazione utilizzando la procedura migliore gating possibile. Queste percentuali possono variare, specialmente se si usano molti tipi di protozoi, quindi è importante sempre avere un negativcontrollo e che può essere utilizzato come popolazione di riferimento per il resto dei campioni. - Avviare il gating cliccando campione acquisire.
- Registrare il numero di eventi non meno di 10.000 eventi.
- Localizzare la popolazione ameba di interesse utilizzando la freccia. Questo è come definire le porte.
- Dopo gating, lasciare il posto HTS o individuare la piastra facendo clic su 'Home', quindi eseguire l'intera piastra automaticamente. Eseguire l'acquisizione e l'analisi dei dati in base ai parametri di dimensione e struttura (rispettivamente FSC (forward scatter) e SSC (scatter lato)).
Nota: Rilevare la perdita della popolazione amebe-gated segnala la presenza di un agente patogeno responsabile amebe lisi. Protozoi lisi associata all'infezione da virus viene rilevato con una soglia arbitrariamente creazione del 50% lisi della popolazione amebe gated dall'analizzatore e rispetto alla stessa popolazione non infetta utilizzato come controllo negativo affidabile.
- La colorazione preliminare per rivelare la presenza di virus giganti
- Al termine del rilevamento lisi mediante citometria di flusso, pipetta la co-culture lisato di sospendere i restanti amebe. Poi citocentrifuga direttamente 50 microlitri della sospensione a 800 xg per 10 min.
- Dopo la centrifugazione, fissare i vetrini con una soluzione di metanolo puro. Colorare le diapositive utilizzando una rapida colorazione commerciale di Eosina / blu Azur e colorazione DAPI ed osservare al microscopio ottico a 1,000X ingrandimento al fine di verificare la presenza di fabbriche di virus.
- Per una rapida colorazione, immergersi le diapositive nella prima soluzione eosina (4 sec ripetuto tre volte) e poi passare direttamente ad immergersi diapositive nella soluzione secondo fissaggio contenente blu Azur per 6 secondi, e, infine, lavare le diapositive per 45 secondi con una soluzione tampone fosfato pH 7.2. Lasciare le diapositive asciugare a temperatura ambiente, quindi procedere al observatisopra.
- Per colorazione DAPI, deposito di 15 ml di soluzione di riserva commerciale DAPI sul vetrino asciutta fisso. Proteggere dalla luce quindi procedere all'osservazione.
- Microscopio elettronico
- Dopo la prima identificazione sugli scivoli, valutare la presenza del virus gigante attraverso l'osservazione al microscopio elettronico delle culture surnatante.
- Deposito 5 ml di campione positivo sulla griglia bagliore-scarica. Attendere circa 20 min a temperatura ambiente.
- Essiccare la griglia con attenzione e deposito su una piccola goccia di 1% molibdato di ammonio per 10 sec. Lasciare la griglia asciugare per 5 min.
- Procedere alla microscopia elettronica a 200 keV.
- Posizionare la griglia sul supporto; introdurre il supporto nel microscopio. Controllare la panoramica del vuoto facendo clic sull'icona corrispondente. Chiudere le valvole e cominciano osservazione in un formato di punto 5, e l'ingrandimento di x 25.000.
- Misurare il virus gigante utilizzando ImageJ o direttaly sul microscopio utilizzando lo strumento di misura del microscopio situato nella schermata di acquisizione.
Nota: classificare il campione nel gruppo Faustovirus con una dimensione capside di circa 200 nm.
- Biologia molecolare
Nota: Seguendo questa identificazione, test di biologia molecolare sono stati cruciali per la conferma per distinguere Faustovirus da Marseillevirus, che ha la stessa dimensione del capside e aspetto al microscopio elettronico, sebbene non hanno la stessa specificità host. Il Marseillevirus non può crescere su Vermamoeba il Faustovirus è specifico per Vermamoeba e tutti i tentativi di crescere su altri ameba, come Acanthamoeba non sono riusciti fino ad oggi. La progettazione e l'applicazione di specifici sistemi di primer / sonda elencati nelle opere di Reteno et al. consentito una classificazione preliminare più precisa dei virus appena isolate tramite amplificazione e sequenziamento dei geni virali.- ExDNA tratto dai campioni di coltura positivi utilizzando un sistema di estrazione automatica secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire Real-time PCR utilizzando un termociclatore come descritto in Reteno et al. 19
- Sequenza utilizzando gli stessi primer che sono stati utilizzati per l'amplificazione. Utilizzare i primer di targeting DNA-RNA polimerasi diretto subunità 1 gene: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3 '(in avanti) e Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (reverse) con la sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA.
4. Virus produzione, purificazione e Genome Sequencing
- Sottocultura della cultura amebe virus unico per end-point di diluizione clonazione.
- Per la produzione: preparare 20 flaconi contenenti 30 ml di PYG, 10 ml di vermiformis Vermamoeba e 5 ml di virus isolato già trasferito da pozzi di flaconcini.
- Incubare a 30 ° C fino a completalisi dell'ameba. Osservare tutti i giorni con un microscopio ottico invertito fino a quando tutte le amebe vengono lisati.
- Dopo la completa lisi, piscina tutti i palloni in un destinatario. Filtrare con un filtro da 0,45 micron per eliminare i residui.
- Inizia la purificazione da ultracentrifugazione a 89.800 xg per 75 min. Assicurarsi di calibrare il peso dei tubi prima di iniziare la centrifugazione.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante da ciascuna provetta tramite aspirazione e risospendere il pellet in PAS con lo stesso volume usato per la calibrazione, prima di ripetere centrifugazione.
- Come sopra, rimuovere il surnatante e risospendere tutti i pellet in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS).
- Purificare il virus che viene prodotto utilizzando il 25% di saccarosio (27,5 g di saccarosio in 100 ml di PBS, filtrata su un filtro di 0,22 micron).
- Utilizzare 8 ml di saccarosio e 2 ml di sospensione virale. Centrifugare a 89.800 g per 1 ora e 15 min. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Conservare a -80 ° C.
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Representative Results
Il sistema studiato in questo manoscritto convalidato la sua prova di concetto, isolando due nuovi Faustoviruses. Dei 70 campioni esaminati, sono stati rilevati due episodi di lisi, contrariamente ai nostri controlli negativi affidabili. Il controllo negativo per lisi conteneva una popolazione un'ameba 86%. Al contrario, i campioni positivi (ST1 per Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 per il campione La Ciotat 9) hanno mostrato un drammatico calo delle amebe gated; più del 60% di amebe sono state lisate con la più alta percentuale di detriti. Questi risultati robusti della fase di rilevazione del nostro metodo sono rappresentati in Figura 1. Eosina / blu Azur e colorazione DAPI confermato la presenza di fabbriche virus all'interno della amebe, mostrata in figura 2. La microscopia elettronica ha rivelato l'aspetto tipico di Megavirales un capside icosaedrica , 200 nm in dimensioni e fibrille privi (Figura 3). Una PCR specifici per i virus gigante, particularly per Faustovirus, ha confermato i nostri risultati precedenti. Deve essere verificata mediante PCR per eliminare risultati ambigui o isolamenti contaminati. I virus sono stati clonati, prodotto e purificato per intero sequenziamento del genoma. I genomi dei Faustoviruses appena isolate sono presentati con la seguente Bioproject: PRJEB11169. Il primo-, sub, e la finale-cultura non ha mostrato fungine o contaminazione batterica, favorendo questa moltiplicazione virale. Vermiformis Vermamoeba tollerato la miscela anti-fungine e antibiotici. Questo era evidente nel controllo negativo amebe dove dopo tre giorni, la cultura finale conteneva più dell'80% amebe viventi. Vermamoeba anche fornito una buona cellula ospite per l'isolamento, producendo una carica virale significativo dopo lisi.
Figura 1: il rilevamento Lysis dal flusso automatizzato citometria La rappre dati.t i due campioni, che raccolte Faustovirus dimostrando di amebe lisi. Una popolazione amebe vive è stato utilizzato come controllo negativo. Due cancelli sono stati progettati nella trama FSC SSC, potenzialmente corrispondenti alle cellule e detriti. Dopo la co-coltura finale, una grande popolazione di detriti dimostrato la presenza di un potenziale infezione nei campioni (ST1 e LC9) (B), rispetto al controllo negativo che non ha mostrato variazioni sostanziali nelle popolazioni gated (A). Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Virus fabbriche tipici per alcuni virus giganti in Eosin / blu colorazione Azur e colorazione DAPI controllo negativo che mostrano il V.. vermiformis nucleo usando Eosin / blu Azur colorazione(A), e colorazione DAPI (D) (frecce indicano il nucleo dell'ameba). Ingrandimento a 1,000X. (B, C): eosina / blu Azur colorazione a 1,000X ingrandimento di V. vermiformis infettati con Faustovirus LC9. Le frecce indicano il nucleo dell'ameba infetti circolarizzato, fabbriche di virus sono contrassegnati con un asterisco. (E, F) colorazione DAPI a 1,000X ingrandimento di V. vermiformis infettati con Faustovirus LC9. Le frecce indicano le fabbriche di virus a 8 ore dopo l'infezione (E), e dopo l'infezione 12 ore (F). Barra della scala 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Negativo colorazione MICRograph. colorazione negativa della sospensione virale dopo il rilevamento lisi, che mostra il Faustovirus appena rilevato con il tipico aspetto del Megavirales, con un capside icosaedrica e una dimensione totale di 200 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| composizione PYG | le quantità |
| peptone proteoso | 20 g |
| Estratto di lievito | 2 g |
| MgSO 4. 7H 2 O | 0,980 g |
| CaCl 2 | 0.059 g |
| citrato di sodio. diidrato | 1 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 x 6 H 2 O | 0,02 g |
| Glucosio | 18 g |
| acqua distillata per | 1 L |
| Regolare il pH a 6,8 con HCl o KOH. | |
| Autoclave 15 min a 121 ° C. | |
| medio Starvation | le quantità |
| Estratto di lievito | 2 g |
| Glucosio | 18 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2. 6 H 2 O | 0,02 g |
| PAS (descritto di seguito) | 1 L |
| Filtrata su 0,22 millimetri | |
| PAS soluzione A | le quantità |
| KH 2 PO 4 | 0.136 g |
| Na 2 HPO 4 | 0.142 g |
| PAS soluzione B | le quantità |
| MgSO 4 .7H 2 O | 4,0 mg |
| CaCl 2 .2H 2 O | 4,0 mg |
| NaCl | 0,120 g |
| 10 ml di ciascuna soluzione A e B, vengono aggiunte in 1 L di acqua distillata. | |
Tabella 1: Soluzione ricette.
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Discussion
La possibilità che Faustovirus potrebbe essere il primo membro di una nuova famiglia Megavirales vicino al ASFV è stato suggerito da Reteno et al., 19 ma alcune differenze possono ancora essere distinto. Appare chiaro se Faustovirus dovrebbe far parte della famiglia Asfarviridae o se debba invece formare una nuova famiglia virale putativo. Questo problema richiede ulteriori indagini, in particolare, una caratterizzazione più completa della sua morfologia, gamma degli ospiti, ciclo di replicazione e Gene repertorio. Più genotipi Faustovirus devono essere isolati in modo da ampliare il pan-genoma e per comprendere meglio le origini e parenti di questo gruppo virale o di famiglia. La tecnica che abbiamo usato ci ha permesso di continuare isolare nuovi membri di questa potenziale nuova famiglia. Questa tecnica è accoppiato con la tecnica di co-coltura leggermente modificata, che funge da passaggio di arricchimento per una migliore rilevazione. Il tempo richiesto mediante citometria di flusso per l'acquisizione di dati per hundreds di campioni non supera mezz'ora, che è un vantaggio importante rispetto al precedente sistema di co-coltura standard. 9 La tecnica è molto meglio che il sistema standard precedente, in particolare in termini di maggiore sensibilità e precisa quantificazione.
Dei 70 campioni lanciati, abbiamo isolato due ulteriori Faustoviruses da acque reflue, che potrebbero fornire informazioni sulla specificità ambientale o ecosistema di questo virus. Infatti, la specificità Faustovirus dei protisti Vermamoeba vermiformis, 19 nonché la nuova classificazione HcDNAV tra i Asfarviridae 23 e il fatto che questo virus infetta molti ceppi di dinoflagellato Heterocapsa spp ma è incapace di infettare altri tipi di fitoplancton 24 suggerisce la presenza di host-specificità tra Asfarvirus o dei suoi parenti stretti.
Questi risultati implicano l'utilizzo di nuovi supporti cellulari che agiscono as host specifici o non specifici, che possono ospitare questi tipi di virus. La nostra tecnica può essere adattato ad altri tipi di protisti in condizioni diverse. I nostri marchi metodo progressi in termini di tecniche di isolamento e coltura virale. In sintesi, fasi di arricchimento con la miscela antibatterica e antimicotica più appropriati sono cruciali per l'eliminazione di ogni possibile contaminazione batterica o fungina. Il nostro mezzo di fame era la soluzione migliore per mantenere l'ameba nelle migliori condizioni per la co-coltura, mentre il medium PAS utilizzato nella cultura di routine sembra essere inappropriato per Vermamoeba spp, perché veloce incistamento è stata osservata dopo 24 ore di incubazione. Questo è stato un grande passo avanti verso condizioni di coltura ottimali in cui le tecniche precedenti avevano finora fallito. Per ottenere i migliori risultati utilizzando i protocolli di coltura qui descritti, si raccomanda di utilizzare amebe fresca capace di fagocitosi. La miscela antibiotica e antimicotica dovrebbe essere non tossico per i protisti ; pertanto, si consiglia di testare la fattibilità del protozoo utilizzato sulla miscela. Tutti i materiali utilizzati devono essere sterilizzati. Il lavoro dovrebbe essere condotto in un microbiologico assicurato di classe dopo la seconda per evitare qualsiasi probabile contaminazione. I tempi di incubazione e le tre fasi della cultura devono essere rispettati come descritto. Il tempo di elaborazione per il rilevamento citometria di flusso può essere calibrata a seconda organismi studiati. Un piccolo spostamento nella popolazione dal gating originale può essere osservato, ma questo dipende dal controllo negativo affidabile utilizzato come popolazione di riferimento.
batteri multi-resistenti che possono essere trovati nella cultura e che sono patogeni per l'ameba possa in qualche modo limitare il nostro metodo di isolamento virale, in cui possiamo avere una crescita batterica mascherare la moltiplicazione dei virus. Variando la miscela antibiotica o anche filtranti cultura per eliminare i batteri di oltre 200 nm dimensioni devono gestire questa limitazione volte.
"> Tutte queste condizioni adatte offrono una nuova procedura di isolamento ottimale, che supporta la moltiplicazione virale. Questa tecnica presenta un notevole vantaggio nella scoperta di nuovi virus, in particolare Megavirales, per comprendere meglio la loro diversità, origini, e il potenziale patogenicità.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium, PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22 μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al.
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).
- Claverie, J. -M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
