Abstract
I detta protokoll visar vi en metod för syntes av 2'-alkyn modifierad deoxiribonukleinsyra (DNA) strängar genom automatiserad fastfas-syntes med användning av standard-fosforamiditkemi. Oligonukleotider är post-syntetiskt märkt genom två nya fotostabila cyaninfärgämnen med användning av koppar-katalyserade klick-kemi. Syntesen för både givare och acceptor-färgämne beskrivs och utförs i tre steg i följd. Med DNA som den omgivande arkitekturen, dessa två färgämnen genomgå en energiöverföring när de bringas i omedelbar närhet genom hybridisering. Därför är hybridisering av två enkelsträngade DNA-strängar visualiseras genom en förändring av fluorescensfärg. Denna färgändring kännetecknas av fluorescensspektroskopi, men kan också observeras direkt genom användning av en handhållen ultraviolett (UV) -lampa. Konceptet med en dubbel fluorescensfärg avläsning gör dessa oligonukleotidprober utmärkta verktyg för molekylär avbildning speciellt när den beskrivna photostable färgämnen används. Därigenom är fotoblekning av de avbildningssonder förhindras, och biologiska processer kan observeras i realtid för en längre tidsperiod.
Introduction
Molecular imaging utgör en grundläggande teknik för att förstå biologiska processer i levande celler. 1-3 Utvecklingen av fluorescerande nukleinsyra baserade prober för sådana kemiska-biologiska tillämpningar har blivit ett växande forskningsfält. Dessa fluorescerande prober måste uppfylla några krav för att bli lämpliga verktyg för cell imaging. För det första bör de tillämpade färgämnen uppvisar fluorescens med hög kvantutbyten, stora Stokes skift och, viktigast av allt, höga photostabilities att möjliggöra långsiktiga in vivo imaging. Och för det andra, bör de visar en tillförlitlig fluorescensavläsning. Konventionell kromofor släckare-system bygger på avläsning av en enda fluorescens färg genom enkla förändringar i fluorescensintensitet. 4 Detta tillvägagångssätt bär risken för falskt positiva eller falskt negativa resultat på grund av autofluorescens av intracellulära komponenter eller låga signal-brusförhållanden på grund av oönskad härdning av andra comkomponenter. 4
Vi rapporterade nyligen om begreppet "DNA trafikljus" som visar dubbla fluorescens färg avläsning genom att använda två olika kromoforer. 5-6 Konceptet bygger på energiöverföring (ET) från donator-färgämnet till acceptor-färgämne som ändrar fluorescens färg (se figur 1). Detta möjliggör en mer tillförlitlig avläsning och därmed ger ett kraftfullt verktyg för fluorescerande avbildningssonder. Märkning av oligonukleotider med fluorescerande färgämnen kan åstadkommas genom två olika tillvägagångssätt. Färgämnen kan införlivas under den kemiska DNA-syntes på en fast fas genom användning av motsvarande modifierade fosforamidit byggstenar. 7 Denna metod är begränsad till färgämnen som är stabila under standard fosforamidit och avlägsnande av skyddsgrupper förhållanden. Som ett alternativ, var eftersyntetiska modifieringsmetoder är etablerade i oligonukleotid kemi. Här visar vi syntesen av en av våra nya bildertabell energiöverförings par 8,9 och efter syntetisk märkning av DNA genom att använda kopparkatalyserade 1,3-cykloaddition mellan azider och alkyner (CuAAC). 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Flera av de kemikalier som används i dessa synteser är giftiga och karcinogena. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder som typiskt krävs i organisk kemi laboratorier, såsom att bära en laboratorierock, skyddsglasögon och handskar.
1. Syntes av färgämnena
Obs: Båda färgämnen kan syntetiseras av samma typ av reaktion Figur 2 visar en översikt över dessa reaktioner..
- Syntes av 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-jodid (färgämne 1)
- Syntes av 1- (3-jodopropyl) -4-metylpyridin-1-ium-jodid (figur 2A, steg a)
- Lös upp 466 mg 4-pikolin och 5,91 g 1,3-dijodopropan i 10 ml acetonitril i en 20 ml gasutrymme ampull och sluter tätt genom ett septum cap.
- Värm till 85 ° C under 16 h.
- Låt svalna till RT och sedan avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Tillsätt 20 ml etylacetat till den kvarvarande oljan och behandla blandningen i en 120 W ultraljudbad under tre min.
- Samla in den bildade fällningen genom filtrering och tvätta fem gånger med etylacetat. Torka den fasta produkten under vakuum O / N.
- Syntes av 1- (3-azidopropyl) -4-metylpyridin-1-ium (figur 2A, steg b)
- Lös upp 900 mg 1- (3-jodopropyl) -4-metylpyridin-1-ium-jodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml gasutrymme flaskan, tillsätt 376 mg natriumazid och sluter tätt genom ett septum cap.
- Värm till 85 ° C under 16 h.
- Låt svalna till RT och sedan avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Tillsätt 15 ml diklormetan till återstoden.
- Filtrera bort och kassera den resulterande fällningen.
- Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotary indunstare för att erhålla produkten som en brun olja.
- Syntes av 1-metyl-1H-indol-3-karbaldehyd (figur 2A, steg c)
- Under inert gas (argon), lös 1,45 g indol-3-karbaldehyd, 1,52 g kaliumkarbonat och 2,70 g dimetyl-karbonat i 10 ml absolut dimetylformamid i en 50 ml rundbottnad kolv utrustad med en återloppskylare.
- Rör om blandningen vid 130 ° C under 19 h.
- Låt svalna till RT, häll sedan blandningen på is.
- Extrahera vattenskiktet tre gånger med 150 ml etylacetat.
- Kombinera de organiska faserna, tvätta dem med vatten, torka dem över natriumsulfat och avlägsna lösningsmedlet vid 50 ° C under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Koppling till 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-jodid (färgämne 1) (figur 2A, steg d)
- Arbeta under argon och under uteslutning av fukt. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-metylpyridin-1-ium och 48 mg 1-metyl-1H-indol-3-karbaldehyd i 4 ml etanol i en 20 ml rundbottnad kolv utrustad med en återloppskylare.
- Lägga 0,07 ml piperidin och värm till 80 ° C under 4 h.
- Låt svalna till RT.
- Uppsamla den resulterande fällningen genom filtrering och tvätta tre gånger med dietyleter.
- Lägg dietyleter till supernatanten och samla den resulterande fällningen genom filtrering. Tvätta tre gånger med dietyleter.
- Kombinera de fällningar.
- Syntes av 1- (3-jodopropyl) -4-metylpyridin-1-ium-jodid (figur 2A, steg a)
- Syntes av 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-yl) vinyl) kinolin-1-ium-jodid (färgämne 2)
- Syntes av 1- (3-jodopropyl) -4-metylkinolin-1-ium-jodid (Figur 2B, steg a)
- Lös upp 715 mg 4-metylkinolin och 5,91 g 1,3-dijodopropan i 10 ml acetonitril i en 20 ml gasutrymme ampull och sluter tätt genom ett septum cap.
- Värmetill 85 ° C under 16 h.
- Låt svalna till RT och sedan avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Tillsätt 20 ml etylacetat till den kvarvarande oljan och behandla blandningen i en 120 W ultraljudbad under tre min.
- Samla in den bildade fällningen genom filtrering och tvätta fem gånger med etylacetat. Torka den fasta produkten under vakuum O / N.
- Syntes av 1- (3-azidopropyl) -4-metylkinolin-1-ium (Figur 2B, steg b)
- Lös upp 900 mg 1- (3-jodopropyl) -4-metylkinolin-1-ium-jodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml gasutrymme flaskan, tillsätt 333 mg natriumazid och sluter tätt genom ett septum cap.
- Värm till 85 ° C under 16 h.
- Låt svalna till RT och sedan avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare.
- Tillsätt 15 ml diklormetan till återstoden.
- Filtrera bort och kassera den resulterande fällningen.
- Avlägsna lösningsmedlet under minskat tryck med användning av en rotationsindunstare för erhållande av produkten som en brun olja.
- Syntes av 1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd (Figur 2B, steg c)
- Under inert gas (argon), lös 1,45 g 2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd, 0,996 g kaliumkarbonat och 1,77 g dimetyl-karbonat i 10 ml absolut dimetylformamid i en 50 ml rundbottnad kolv utrustad med en återloppskylare.
- Rör om blandningen vid 130 ° C under 19 h.
- Låt svalna till RT, häll sedan blandningen på is.
- Extrahera vattenskiktet tre gånger med 150 ml etylacetat.
- Kombinera de organiska faserna, tvätta dem med vatten, torka dem över natriumsulfat och avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av rotationsindunstare.
- Koppling till 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-2-phe nyl-1 H-indol-3-yl) vinyl) kinolin-1-ium-jodid (Figur 2B, steg d)
- Arbete skall ske argpå och under uteslutning av fukt. Lös upp 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-metylkinolin-1-ium och 59,7 mg 1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd i 4 ml etanol i en 20 ml rundbottnad kolv utrustad med återloppskylare.
- Lägga 0,06 ml piperidin och värm till 80 ° C under 4 h.
- Låt svalna till RT.
- Uppsamla den resulterande fällningen genom filtrering och tvätta med dietyleter tre gånger.
- Lägg dietyleter till supernatanten och samla den resulterande fällningen genom filtrering. Tvätta tre gånger med dietyleter.
- Kombinera de fällningar.
- Syntes av 1- (3-jodopropyl) -4-metylkinolin-1-ium-jodid (Figur 2B, steg a)
2. Syntes av DNA-strängarna
Anmärkning: Syntesen av DNA-strängarna utförs med användning av fosforamiditmetoden på en fast fas, såsom beskrivits av M. Caruthers 11 på en DNA-syntetiserare. Driften av synthesizern testas innan syntesförfarandet, och reagens förnyas omnödvändig.
- Prearrangements
- Upplösa kommersiellt tillgänglig 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) i 1,2 ml amidit utspädningsmedel (extra torr acetonitril). Flytta lösning i flaskan till en synthesizer flaska och skruva in synthesizer.
- Gör en "läcka test" (enligt tillverkarens anvisningar) för att se till att ingen gasläcka argon existerar. Om "läcka test" misslyckas, skruva in flaskan hårdare.
- Prime Cu lösning genom att fylla röret som förbinder till den fasta fasen synteskammaren.
- Tvätta alla rader med acetonitril.
- Syntes av DNA-strängar
- Använda den anslutna datorn att gå in i DNA-sekvensen och kopplingsmetod, följa anvisningarna från tillverkarens protokoll. Kopplingssteget av Cu byggsten tar 168 sekunder med 7 pulser (varje puls är 16 l) jämfört med 40 sekunder med 7 pulser för en konventionellfosforamidit som byggstenar.
- Montera kolonn innehållande CPG (glas med kontrollerade porer) som fast fas som är modifierad med en imol av den första basen (DNA-syntes sker från 3 'till 5') i syntetiseraren.
- Starta syntesen på DNA-syntetiseraren 11.
- Upparbetning av syntetiserade DNA-strängar
- Torka kolonnerna med de syntetiserade DNA-strängarna under vakuum O / N.
- Använda en grip att öppna kolonnen och släpp CPG i en reaktionsflaska. Lägg 700 ul koncentrerad ammoniaklösning för att avskydda oligonukleotiden och frigöra DNA-strängen från CPG.
- Stäng flaskan och applicera ett lock säkerhet på reaktionskärlet för att förhindra att det brister, och värm till 50 ° C under 18 timmar.
- Avlägsna ammoniak genom centrifugering under reducerat tryck (100 mbar) vid 30 ° C under 30 min.
- Starta filtrering från CPG: Centrifug kärl vid 11.000 xg for 3 min. Ta supernatanten och överföra den till en centrifugalanordning med en porstorlek av 0,45 | j, m. Centrifugera vid 1000 xg under 4 min.
- Under tiden till 300 pl dubbeldestillerat vatten till CPG, vortex under 20 s och centrifugera vid 11000 xg under 3 min. Överför supernatanten till centrifugalanordningen och centrifugera vid 1000 xg under 4 minuter. Upprepa tvättningen två gånger.
- Ta bort vattnet från de kombinerade vattenlösningar genom centrifugering vid 0,1 mbar och 25 ° CO / N.
3. "klickar" ordningen
- Tillsätt 50 pl dubbelt destillerat vatten, 25 pl av en natriumaskorbat lösning (0,4 M i vatten), 34 ul tris - [(1-bensyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1), 114 pl av aziden (0,01 M i DMSO / tBuOH 3: 1) och 17 fil av en tetrakis (acetonitril) koppar (i) hexafluorfosfat lösning (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1) till den lyofiliserade alkyn-modifierat DNA-prov. Inkubera provet vid 60 ° C under 1,5 h.
- Kyl till RT.
- Lägg 150 pl Na2EDTA (0,05 M i vatten) och 450 | il natriumacetat (0,3 M i vatten) till DNA-provet och överför till ett 10 ml rör.
- Tillsätt 10 ml etanol (100%) och hålla -32 ° C under 16 timmar.
- Centrifug fartyg under 15 minuter vid 1000 xg och avlägsna supernatanten.
- Tvätta DNA-pelleten med 2 ml kall etanol (80%).
- Torr pellet under reducerat tryck.
4. HPLC-rening
Obs! Innan separera DNA-strängarna se till att HPLC fungerar korrekt, räcker lösningsmedel tillgänglig och kolonnen är ren. Skölj kolonnen med utgångskoncentrationen av buffert / acetonitril.
- Lös rå DNA-pelleten i 250 | il dubbeldestillerat vatten och överför till en HPLC-flaska.
- Starta HPLC-körning av 45 min med en gradient av 0% acetonitril till 15% acetonitril för färgämne 1 och en gradi ent 0% acetonitril till 17% acetonitril för färgämne 2. Övervaka körningen genom att kontrollera 260 nm (DNA absorption) och 459 nm (färgämne 1) eller 542 nm (färg 2). Samla de fraktioner som visar absorption i båda våglängdskanaler.
- Kontrollera de uppsamlade fraktionerna för rätten massan genom matrisassisterad laserdesorptionsjonisering (MALDI) masspektrometri med användning av en matris bestående av 3-hydroxipikolinsyra (3HPA) och diammoniumhydrogencitrate.
- Förbereda matrisen genom att blanda 900 | il av en mättad 3-HPA-lösning i 1: 1-blandning av acetonitril och vatten med 100 pl av en diammoniumhydrogencitrate lösning (100 g / L) i vatten.
- Pipett 1-2 pl av DNA-sonden på målet och låt den torka på luft.
- Tillsätt 0,2 pl av 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matrisen till provet och blanda tills den kristalliserar.
- Utföra MALDI masspektrometri.
- Kombinera dessa HPLC-fraktioner som uppvisar rätt massa.
Obs: Koncentrationen bestämmes genom mätning av absorptionen vid 260 nm med användning av en UV / Vis-spektrofotometer, på grundval av de extinktionskoefficienter (ε 260) av DNA-baser och färgämnet.
- Lös DNA i 100 - 200 ^ dubbelt destillerat vatten.
- Applicera 1 pl av DNA-lösningen på UV / Vis-spektrofotometer.
- Mäta absorptionen vid 260 nm. Upprepa tre gånger.
- Ta medelvärdet för att beräkna koncentrationen av lösningen. För beräkningen av de extinktionskoefficienter, använd ε 260 nm av de fyra naturliga baserna 12 och ε 260 nm av den köpta byggsten Cu (betraktas som naturliga uridin) 12 för att erhålla den ε 260 nm av hela DNA-strängen. För färgämne 1, användning ε 260 nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 och färgämne 2, användning ε 260 nm = 13.100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Beräkna koncentrationen av lösningen efter Lambert-Beers lag baserad på de extinktionskoefficienter och uppmätta absorbanserna. 13
6. Provberedning och spektroskopi
- Beredning av enkelsträngade prov
- Förbereda separat 1 ml av 2,5 ^ M lösningar av var och en av den modifierade DNA1 och DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM NaP-buffert, pH = 7.
- Framställning av dubbelsträngade prover
- Förbereda en ml av en lösning innehållande 2,5 | iM av DNA1 och 2,5 ^ M av DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM NaP-buffert, pH = 7 i ett reaktionskärl.
- Säkra locket med en säkerhetslock och upphetta till 90 ° C under 10 min. Sedan stänger värme och låt svalna till RT O / N.
- absorptionsspektroskopi
Obs: För att bestämma excitationsvåglängden för fluorescens spectroscopy absorptionsspektra registreras.- Enskilda mätningar sträng
- Spela in ett tomt mätning innehållande endast 200 mM NaCl, 50 mM NaP i buffert, pH = 7.
- Överför den beredda lösningen av DNA1 i en 1 cm kvartsglas kyvett och spela absorptionen. Korrigera mätningen mot de tomma data. Bestämma det maximala värdet av färgämne absorption.
- Upprepa för DNA2.
- Enskilda mätningar sträng
- fluorescensspektroskopi
- Enskilda mätningar sträng
- Spela in ett tomt mätning innehållande endast 200 mM NaCl, 50 mM NaP i buffert, pH = 7; med användning av excitationsvåglängd av färgämne 1.
- Överför DNA1 lösningen i en 1 cm kvartsglas kyvett.
- Registrera fluorescensspektrum.
- Dubbelsträngat mätning
- Överföra dubbelsträngen lösningen i en kvartsglas kyvett. Registrera fluorescensspektrum med användning av excitationsvåglängd av färgämne 1.
- Enskilda mätningar sträng
- visualiserings experiment
Varning: Lämplig ögonskydd bör användas för att undvika UV-skador på ögonen!- För att få en bättre förståelse för vad de inspelade spektra visar, bestråla kyvetterna med handhållen UV-lampor (Figur 5). Observera förändring i fluorescens färg från den inre till den dubbelsträngade DNA: t.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Absorption och fluorescensspektra av den inre och dubbelsträngat DNA registreras såsom visas i fig 4.
Den inspelade absorptionsspektra (Figur 4 höger) visar absorptionsmaxima λ max vid 465 nm för enkelsträngad DNA1 (färgämne 1) och 546 nm för enkelsträngad DNA2 (färg 2). Glödgat DNA1_2 (färg 1 & dye 2) visar maxima vid både 469 nm och 567 nm. Både absorptionsmaximum visar en batokrom skift, 4 nm för färgämnet ett och 21 nm för färgämnet 2. Dessa små spektroskopiska förändringar är resultatet av excitoniska interaktioner mellan färgämnena i den dubbelhelix DNA arkitektur.
Motsvarande fluorescens spektra (figur 4 till vänster) uppvisar maxima λ max, vid 537 nm för enkelsträngad DNA1 (färg 1, excitation vid 435 nm), vid 607 nm för enstaka-stranded DNA2 (färgämne 2, excitering vid 535 nm) och vid 615 nm för glödgat DNA1_2 (färgämne 1 & färga 2, excitering vid 435 nm). DNA1_2 visar enbart emissionsmaximum färgämne 2 även färgämne ett selektivt glada som bevisar att energiöverföringen sker effektivt från färgämne en att färga 2. Detta ger en kontrast emissionsförhållande på 01:57.
Skillnaden mellan enkel och dubbel sträng är uppenbart genom att jämföra emissionsfärg i kyvetten under excitation med en standard UV-lampa såsom visas i figur 5.
Figur 1. Grundtanken med en energiöverföring i DNA. Givaren modifierade DNA-strängen (grön) visar fluorescens vid 535 nm vid bestrålning vid 435 nm. Om det är hybridiserad med acceptor-modifierade motverka strängen (röd) den resulterande dubbelsträng shows bara den röda fluorescens av acceptor-färgämne vid 610 nm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Syntes översikt av färgämne 1 och färgämne 2. Syntesen av två cyaninfärgämnen 1 (A) och 2 (B) genomföres i tre steg i följd. 9 (A) a) 1,3-dijodopropan, CH3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) K 2 CO 3, dimetylkarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-dijodopropan, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, dimetylkarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) -piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 timmar, 44%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Struktur Cu-byggsten, färgämnen 1 och 2 och sekvenser av DNA1 och DNA2. De färgämnen 1 och 2 är kopplade till två position i ribosen med en triazol linker inom de givna sekvenserna av DNA1 och DNA2. 9 klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fluorescence av enkel- och dubbelsträngade DNA-strängar (till vänster) och absorption av enkel- och dubbelsträngade DNA-strängar (höger). emissionsspektra för DNA1 (svart) exciteras vid 464 nm, DNA2 (röd), upphetsad vid 535 nm och 435 nm (rosa ), och DNA1_DNA2 hybrid (blå), exciteras vid 435 nm visas. Absorptionsspektra för den enkelsträngade DNA1 (svart), DNA2 (röd), och den hybridiserade dubbelsträngade DNA1_DNA2 (blå) visas på höger sida visa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Utsläpps färgen på enkelsträngat DNA med donator-färgämnet (vänster) och dubbelsträngad DNA med donator och acceptor-färgämne (höger) under excitering av en UV-lampa. Bilden av kuvetten innehållande den enkelsträngade DNA1 (lefT-sidan) visar ljust grön fluorescens, och bilden av dubbelsträngad DNA1_DNA2 (höger) visar röd fluorescens under excitation av en handhållen UV-lampa vid 366 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar hela förfarandet för att märka DNA post syntetiskt via CuAAC av azid-modifierade fluorescerande färgämnen. Detta inkluderar syntesen av färgämnen och alkynen modifierade DNA samt märkningsförfarandet.
Syntesen av färgämnena följande fyra steg. Alla produkter kan erhållas genom en ganska enkel utfällning på grund av deras positiva laddning och ingen tidsödande kolonnkromatografi behövs. Införandet av aziden funktionaliteter vid den centrala kopplingsstegen förkortar syntesen av färgämnena till fyra i stället för fem reaktionssteg i följd. Tillämpningen av 1,3-dijodopropan i stället för 3-jodopropanol för alkyleringssteget, den Appel reaktionen och följande Finkelstein-reaktioner för att omvandla hydroxylfunktionen i jod funktionaliteter undveks. Dessa förändringar i jämförelse med de publicerade förfaranden tillåter oss att syntetisera färgämnena i större skalor och kortare tidsperioder.
DNA1 märks av färgämne 1, donator-färgämnet och DNA2 av färgämne 2, den acceptor-färgämne. När DNA1 och DNA2 är glödgad både färgämnen komma i omedelbar närhet. En effektiv energiöverföring observeras när färgämnet ett exciteras. I princip kan excitoniska interaktion mellan de båda färgämnena störa en effektiv energiöverföring, eftersom den senare processen kräver okopplade och väckad färgämne 1 och okopplade färgämne 2. excitation av de kopplade färgämnen skulle initiera olika fotofysikaliska vägar. 14 Våra tidigare studier 9,15 visade att den tillämpas 3'-5'-diagonal arrangemang av färgämnen ger den strukturella grunden för endast små excitoniska interaktioner mellan Färgämnena och effektiv energiöverföring.
Den höga effektiviteten hos den demonstrerade energiöverföring möjliggör exakt fluorescens avläsning i in vitro och in vivo experiment. Detta erbjuder ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive visualisering av DNA-hybridisering i molekylära fyrar, bindning av målmolekyler i nukleinsyra baserade aptamers samt visualisering av integriteten hos små störande RNA (siRNA) inuti celler. Den största begränsningen är kravet att märka båda DNA-strängar. I framtiden vill vi fokusera vårt arbete på att utveckla dubbelt märkta oligonukleotidprober som bär båda färgämnen i en sträng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansiellt stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), forsknings Training Group GRK 2039 (finansierat av DFG) och kit är tacksamma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
