Abstract
このプロトコルでは、我々は、2'-アルキンの合成のための方法を示す標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動化固相合成によってデオキシリボ核酸（DNA）鎖を修飾。オリゴヌクレオチドは合成後の銅触媒によるクリックケミストリーを使用して、2つの新しい光安定シアニン色素によって標識されています。両方のドナーとアクセプター色素の合成が記載されており、三つの連続工程で行われます。それらはハイブリダイゼーションにより近接させられるときに、周囲のアーキテクチャとしてDNAと、これら2つの色素が、エネルギー移動を受けます。したがって、2つの一本鎖DNA鎖のアニーリングは、蛍光色の変化によって視覚化されます。この色の変化は、蛍光分光法によって特徴付けられるだけでなく、直接ハンドヘルド紫外線（UV）ランプを使用して観察することができます。デュアル蛍光色読み出しの概念は、これらのオリゴヌクレオチドプローブを分子イメージング特に記載フォーのための優れたツールを作りますtostable染料が使用されています。これにより、イメージングプローブの光退色を防止し、かつ生物学的プロセスは、より長い期間のために実時間で観察することができます。
Introduction
分子イメージングは、生きた細胞内の生物学的プロセスを理解するための基本的な技術を表している。1-3、化学、生物学的応用のための蛍光核酸ベースのプローブの開発が拡大する研究分野となっています。これらの蛍光プローブは、細胞イメージングのために適したツールとなるために、いくつかの要件を満たす必要があります。まず、適用される染料は、in vivoイメージングに長期を可能にするために、高い量子収率、大きなストークスシフトと、最も重要なのは、高いphotostabilitiesで蛍光を示すべきです。そして第二に、彼らは信頼性の高い蛍光読み出しを示すべきです。従来の発色団-消光剤、システムは、蛍光強度の簡単な変更によって、単一の蛍光色の読み出しに基づいている。4このアプローチは、細胞内の成分の自己蛍光または低い信号対雑音比に起因する偽陽性または偽陰性結果のリスクを負います他のCOMによって望ましくない消光によるものンポーネント。4
我々は最近、二つの異なる発色団を使用して二重蛍光色の読み出しを示す「DNAの交通信号灯」の概念に報告した。5-6概念は蛍光を変更するアクセプター色素にドナー色素からのエネルギー移動（ET）に基づいています色（ 図1参照）。これは、より信頼性の高い読み出しを可能にし、それによって蛍光イメージングプローブのための強力なツールを提供します。蛍光色素を有するオリゴヌクレオチドの標識には、2つの異なるアプローチによって達成することができます。染料は、それに応じて修正されたホスホルアミダイトビルディングブロックを使用して、固相に化学的DNA合成の間に組み込むことができる。7、この方法は、標準的なホスホルアミダイトおよび脱保護条件下で安定であり、色素に限定されます。別の方法として、合成後修飾方法は、オリゴヌクレオチドの化学的性質に設立されました。ここでは、私たちの新しい写真の1の合成を実証しますテーブルのエネルギー伝達対8,9とアジドとアルキン（CuAAC）間の銅触媒1,3-付加環を使用して、DNAの合成後の標識。10
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Protocol
注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、毒性および発癌性があります。典型的には、実験室のコートを着て安全メガネや手袋などの有機化学研究室で必要とされるすべての適切な安全対策を使用してください。
染料の1の合成
注：両方の色素は、反応の同じタイプによって合成することができる。図2は、これらの反応の概要を示します。
- 1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）の合成
- 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化物の合成（図2（a）は、工程a）
- 466 mgの4-ピコリンと20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。
- 16時間85℃に加熱します。
- その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
- 残油に酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。
- 濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。
- 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム（図2A、ステップb）の合成
- 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの376ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。
- 16時間85℃に加熱します。
- その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
- 残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。
- オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。
- 腐敗を用いて減圧下で溶媒を除去進蒸発は、褐色の油状物として生成物を得ました。
- 1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒド（図2A、ステップc）の合成
- 不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45グラムインドール-3-カルバルデヒド1.52グラムの炭酸カリウム2.70グラムのジメチルカーボネートを溶解します。
- 19時間130℃で混合物を攪拌します。
- その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。
- 水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。
- 有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下50℃で溶媒を除去します。
- カップリングの1-（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）ビニル）ピリジン-1-イウムヨウ化物（染料1）（図2A、ステップd）
- アルゴン下、湿気の排除下で働きます。 Dissol還流冷却器を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウム及び48mgの1-メチル-1H-インドール-3-カルバルデヒドまし。
- 4時間80℃に0.07ミリリットルピペリジンと熱を追加します。
- RTに冷却します。
- 濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで3回洗浄します。
- 上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。
- 沈殿物を組み合わせます。
- 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルピリジン-1-イウムヨウ化物の合成（図2（a）は、工程a）
- 1-（3-アジドプロピル）の合成-4-（2-（1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（色素2）
- 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化物の合成は、（図2Bには、工程a）
- 715 mgの4 - メチルキノリン及び20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの10ミリリットル中5.91グラムの1,3-ジヨードプロパンを溶解し、セプタムキャップでしっかり密封。
- 熱16時間85℃です。
- その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
- 残りの油を酢酸エチル20mlを加え、3分間120 W超音波浴中の混合物を扱います。
- 濾過により形成された沈殿物を回収し、酢酸エチルで5回洗浄します。真空O / Nの下で固体生成物を乾燥させます。
- 1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムの合成（図2B、ステップb）
- 、20ミリリットルのヘッドスペースバイアル中のアセトニトリルの12ミリリットル中に900mgの1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化を溶解し、アジ化ナトリウムの333ミリグラムを追加し、セプタムキャップでしっかり密封。
- 16時間85℃に加熱します。
- その後、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去することを可能にします。
- 残渣にジクロロメタンの15ミリリットルを追加します。
- オフフィルターと得られた沈殿物を捨てます。
- 溶剤のuを削除しますファインダー褐色の油状物として生成物を得るために、ロータリーエバポレーターを使用して圧力を減少させました。
- 1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドの合成（図2B、ステップc）
- 不活性ガス（アルゴン）下で、還流冷却器を備えた50ml丸底フラスコ中の10 mlの無水ジメチルホルムアミド1.45 G 2フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒド、0.996グラムの炭酸カリウム1.77グラムのジメチルカーボネートを溶解します。
- 19時間130℃で混合物を攪拌します。
- その後、氷の上に混合物を注ぐ、室温まで冷却します。
- 水層を150 mLの酢酸エチルで3回抽出します。
- 有機層を合わせ、水でそれらを洗浄し、硫酸ナトリウム上でそれらを乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。
- 1-への結合（3-アジドプロピル）-4-（2-（1-メチル-2-脱pheニル-1H-インドール-3-イル）ビニル）キノリン-1-イウムヨウ化物（図2B、ステップd）
- argの下での作業上と水分の排除下で。を備えた20 mL丸底フラスコ中で4 mlのエタノール中に90mgの1-（3-アジドプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウム及び59.7 mgの1-メチル-2-フェニル-1H-インドール-3-カルバルデヒドを溶解還流冷却器。
- 4時間80℃に0.06ミリリットルピペリジンと熱を追加します。
- RTに冷却します。
- 濾過により得られた沈殿物を収集し、ジエチルエーテルで三回洗浄します。
- 上澄み液にジエチルエーテルを加え、濾過により得られた沈殿物を収集します。ジエチルエーテルで3回洗浄します。
- 沈殿物を組み合わせます。
- 1-（3-ヨードプロピル）-4-メチルキノリン-1-イウムヨウ化物の合成は、（図2Bには、工程a）
DNAストランドの2合成
注：DNA合成機でM.カルザース11で説明したようにDNA鎖の合成は、固相上のホスホルアミダイト法を用いて行われます。シンセサイザーの機能は、合成手順の前にテストされ、試薬があれば更新します必要。
- Prearrangements
- アミダイト希釈剤（余分な乾燥アセトニトリル）の1.2ミリリットルで、市販の2'-O-プロパルギルdeoxyuridinephosphoramidite（CU）を溶解します。シンセサイザーバイアルにバイアルにソリューションを移動して、シンセサイザーにねじ込み。
- 何のアルゴンガス漏れがないことを確認する（製造者の指示に従って）、「リークテスト」を実行します。 「リークテスト」が失敗した場合は、より緊密にバイアルにねじ込みます。
- プライム固相合成室に接続する管を充填することによりCuのソリューション。
- アセトニトリルですべての行を洗ってください。
- DNA鎖の合成
- 製造業者のプロトコルからの指示に従って、DNA配列との結合方法を入力するように接続されたコンピュータを使用してください。 CUビルディングブロックのカップリング工程は、従来の7パルスで40秒に比べ7パルス（各パルスは16マイクロリットルである）で168秒を要しビルディングブロックとしてホスホラミダイト。
- シンセサイザーに最初の塩基（DNA合成は、3 'から5'から行われる）の1マイクロモルで修飾されている固相としてCPG（孔制御ガラス）を含むカラムをマウントします。
- DNA合成11上の合成を開始します。
- 合成されたDNA鎖の後処理
- 真空O / Nの下で合成されたDNA鎖の列を乾かします。
- 列を開き、反応バイアルにCPGを解放するためにピンセットを使用してください。オリゴヌクレオチドを脱保護し、CPGからDNA鎖を解放するために濃アンモニア水溶液700μlのを追加します。
- 18時間50℃にバイアルを閉じて、破裂を防ぐために、反応容器にセキュリティ蓋を適用し、熱。
- 30℃で30分間減圧（100ミリバール）下での遠心分離によってアンモニアを除去。
- CPGからろ過を開始します。遠心分離容器を11,000×gでFOでR 3分。上清を取り、孔径0.45μmの遠心分離装置にそれを転送します。 4分1,000×gで遠心分離します。
- 一方CPG、3分間、11,000×gで20秒間遠心のための渦に蒸留水300μlを添加します。 4分間の千×gで遠心分離装置及び遠心分離に上清を移します。 2回洗浄手順を繰り返します。
- 0.1ミリバールと25°CO / Nで遠心分離することにより、合わせた水溶液から水を除去します。
3.「クリック」の手順
- 、アスコルビン酸ナトリウム溶液（水中0.4 M）を25μl、50μlの34μlのトリスを二重蒸留水を追加 - [（1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3：アジ化物の1）、114μL（0.01 DMSO中のM / tBuOH 3：1）およびテトラキス17μlの（アセトニトリル）銅（I）ヘキサフルオロリン酸溶液（0.1 DMSO中のM / tBuOH 3： 1）凍結乾燥されたアルキン修飾DNAサンプルへ。 1.5時間、60℃でサンプルをインキュベートします。
- RTに冷却します。
- DNAサンプルと10ミリリットルチューブへの転送に150μlののNa 2 EDTA（水中の0.05 M）および450μlの酢酸ナトリウム（水中の0.3 M）を追加します。
- 10ミリリットルのエタノール（100％）を加え、16時間、-32℃で保管してください。
- 千×gで15分間遠心分離容器、上清を除去します。
- 2ミリリットルの冷エタノール（80％）でDNAペレットを洗浄します。
- 減圧下で乾燥したペレット。
4. HPLC精製
注：HPLCは正常に動作していることを確認するDNAの鎖を分離する前に、十分な溶媒が利用可能で、列がきれいです。バッファ/アセトニトリルの出発濃度でカラムを洗浄します。
- 二重蒸留水250μlの粗DNAペレットを溶解し、HPLCバイアルに移します。
- 染料1およびgradiのためにアセトニトリルの15％、0％アセトニトリルの勾配で45分のHPLCの実行を開始します色素2のアセトニトリルの17％、0％のアセトニトリルの耳鼻咽喉科を、260nm（DNA吸収）と459 nmの（染料1）または542 nmの（色素2）をチェックすることによって実行を監視します。両方の波長チャネルでの吸収を示し、それらの画分を収集します。
- 3-ヒドロキシ酸（3HPA）とdiammoniumhydrogencitrateからなる行列を使用して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）質量分析法によって権利質量のために集めた画分を確認してください。
- 水中のdiammoniumhydrogencitrate溶液（100グラム/ L）100μlのアセトニトリルと水の1：1混合物に飽和3-HPA溶液を900μLを混合することにより、マトリックスを準備します。
- ターゲット上のDNAプローブのピペット1-2μlを、空気にそれを乾燥させてください。
- サンプルに3-HPA / diammoniumhydrogencitrate行列の0.2μlを添加して、それが結晶化するまで混合します。
- MALDI質量分析を実行します。
- 右の質量を示すそれらのHPLC画分を兼ね備えています。
注：濃縮は、DNA塩基と色素の吸光係数（ε260）に基づいて、UV /可視分光光度計を用いて260nmでの吸収を測定することによって決定されます。
- 二重蒸留水200μlの - 100でDNAを溶解します。
- UV /可視分光光度計でのDNA溶液1μlを適用します。
- 260nmの吸収を測定します。 3回繰り返します。
- 溶液の濃度を計算するために平均値をとります。吸光係数の計算のために、全体のDNA鎖のεの260nmのを得るために4つの天然塩基12のε260nmのと（自然ウリジンとみなす）を購入ビルディングブロックCUのεの260nmの 12を使用します 。染料1については、使用率ε260nmの = 10200のL *モル-1 * cm -1で色素2、使用率ε260nmの = 13100のL *モル<SUP> -1 * cm -1で。吸光係数と測定された吸光度に基づいて、ランバート・ベールの法則以下の溶液の濃度を計算する。13
6.サンプル調製と分光
- 一本鎖サンプルの調製
- 200mMのNaCl、50mMののNaP iはバッファに変更されたDNA1とDNA2の各2.5μMのソリューションの個別に1ミリリットルのpH = 7を準備します。
- 二本鎖サンプルの調製
- 反応容器中で200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7にDNA2の2.5 DNA1のμM、2.5μMを含む溶液の1ミリリットルを準備します。
- 10分間90°Cに安全キャップと熱で蓋を固定します。その後、加熱をオフにして、RT O / Nまで冷却することができます。
- 吸光分光法
注：蛍光スペックの励起波長を決定するにはtroscopy吸収スペクトルが記録されています。- 一本鎖の測定
- 唯一の200mMのNaCl、50mMののNaP iは緩衝液、pH = 7を含むブランク測定を記録します。
- 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1の調製した溶液を移し、吸収を記録します。ブランクデータに対する測定を修正してください。色素吸収の最大値を決定します。
- DNA2のために繰り返します。
- 一本鎖の測定
- 蛍光分光法
- 一本鎖の測定
- 唯一の200mMのNaCl、 私はバッファ50 mMの仮眠を含むブランク測定を記録し、pH = 7に。色素1の励起波長を使用して。
- 1cmの石英ガラスキュベットにDNA1ソリューションを転送します。
- 蛍光スペクトルを記録します。
- 二本鎖の測定
- 石英ガラスキュベットに二本鎖のソリューションを転送します。 染料1の励起波長を用いて蛍光スペクトルを記録します。
- 一本鎖の測定
- 可視化実験
注意：適切な眼の保護が目に紫外線によるダメージを回避するために着用する必要があります！- 記録されたスペクトルが表示されているものをよりよく理解するために、携帯型UV-ランプ（ 図5）でキュベットを照射します。二本鎖DNAへのシングルからの蛍光色の変化を観察します。
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Representative Results
図4に示すように、一本鎖および二本鎖DNAの吸収および蛍光スペクトルが記録されています。
記録された吸収スペクトル（ 図4右）一本鎖DNA1（染料1）と一本鎖DNA2（色素2）のために546 nmのための465 nmでのショーの吸収極大λmaxを。アニールDNA1_2（染料1＆染料2）は、469 nmおよび567 nmの両方で最大値を示しています。両方の吸収極大は、これらの小さな分光変化、色素2用染料1および21 nmのための4nmの深色シフトを示す二重らせんDNAアーキテクチャ内の色素間の励起子相互作用の結果です。
単一のための607 nmにおける対応する蛍光スペクトルの一本鎖DNA1（染料1、435 nmでの励起）のために537 nmの（左図4）展示極大λmaxの、-stranded DNA2（染料2、535 nmでの励起）およびアニールDNA1_2ための615 nmで（染料1＆435 nmで2、励起色素）。染料1は、エネルギー移動これは1：57の発光コントラスト比を与える2を染めるための染料1から効率的に発生していることを証明する選択的に励起されたもののDNA1_2は、単に色素2の発光最大値を示しています。
図5に示すように、単一及び二本鎖との間の差は、標準的なUVランプによる励起時に、キュベット中の発光色を比較することにより明らかです。
DNAにおけるエネルギー伝達の 図1. 基本的な考え方。ドナー修正されたDNA鎖（緑）は、435 nmの照射により535nmで蛍光を示しています。それが得られた二本鎖のアクセプターで修飾されたカウンタ鎖（赤）とハイブリダイズされている場合ノウハウ610 nmでアクセプター色素の唯一の赤色蛍光。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2は、 合成色素1および色素2.2つのシアニン色素1（A）の合成及び2（B） の概要は、次の 3つの連続工程で行われる。 図9（A）a）の1,3-ジヨードプロパンを、CH 3 CN、85℃、16時間、94％。 B）のNaN 3、CH 3 CN、85℃、16時間、87％。 c）K 2 CO 3、炭酸ジメチル、DMF、130℃、19時間、89％。 D）ピペリジン、EtOH中、80℃、4時間、80％。 （B）A）1,3-ジヨードプロパン、CH 3 CN、85℃、16時間、49％。 B）のNaN 3、CH 3 CN、85℃、16時間、93％。 C言語）K 2 CO 3、炭酸ジメチル、DMF、130℃、19時間、98％。 d）のピペリジン、エタノール、80℃、4時間、44％が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CU-ビルディングブロックの 図3 の構造、染料1及び2とDNA1とDNA2の配列を。染料1及び2は、DNA1とDNA2の与えられた配列内のトリアゾールリンカーにより、リボースの2 '位に結合されている。9 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4 のFluo一本鎖及び二本鎖DNA鎖（左）と一本鎖および二本鎖DNA鎖（右）の吸収のrescence。DNA1の発光スペクトル（黒）464 nmで励起し、DNA2（赤）、535 nmおよび435 nmで励起された（ピンク）、および435 nmで励起DNA1_DNA2ハイブリッド（青）が、示されています。一本鎖DNA1（黒）、DNA2（赤）、およびハイブリダイズした二本鎖DNA1_DNA2（青）の吸収スペクトルは、右側のショーに表示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
UVランプによる励起時にドナー色素（左）と、ドナーとアクセプター色素（右）との二本鎖DNAと一本鎖DNAの 図5. 発光色。一本鎖DNA1を含むキュベットの画像（LEFT側）は、明るい緑色の蛍光を示し、二本鎖DNA1_DNA2（右側）の画像は、366 nmでのハンドヘルドUVランプによる励起時に赤色蛍光を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、アジド修飾された蛍光色素によりCuAAC経由して、DNA合成後に標識するための完全な手順を示しています。これは、染料およびアルキン修飾DNAの合成と同様にラベリング手順を含みます。
色素の合成は、4つのステップに従います。すべての製品は、それらの正電荷のためにではなく、簡単な沈殿によって得ることができ、何時間のかかるカラムクロマトグラフィーは必要ありません。中央のカップリング工程の前にアジド官能基の導入は、4の代わりに、5つの連続反応工程への色素の合成を短縮します。 1,3-ジヨードプロパンの代わりに、アルキル化工程、アペル反応およびヨード機能にヒドロキシル官能基を変換するには、次のフィンケルシュタイン反応のための3-ヨードプロパノールの適用は回避されました。公表された方法と比較してこれらの変更は、私たちは、より大きなスケールと時間の短い期間で色素を合成することができます。
DNA1は、色素2、アクセプター色素により色素1、ドナー色素、及びDNA2によって標識されます。 DNA1とDNA2がアニールされる場合には両方の色素が近接に入ります。染料1が励起されたときに、効率的なエネルギー転移が観察されます。原則として、両方の色素間の励起子相互作用は、後者の方法は、非結合を必要とするので、効率的なエネルギー移動を妨害し、励起することができます結合された染料のd色素1及び非結合染料2励起は異なる光物理的経路を開始することになる。14我々の以前の研究9,15は染料の適用3'-5'-対角配置が間少しだけ励起子相互作用のための構造的基礎を提供することを明らかにしました染料と効率的なエネルギー移動。
実証エネルギー伝達の高効率は、in vitroおよびin vivo実験で正確な蛍光読み出しを可能にします。これは、細胞内の核酸ベースのアプタマーと同様に低分子干渉RNA（siRNA）の整合性の可視化で標的分子の結合は、分子ビーコンでDNAハイブリダイゼーションの可視化などのアプリケーションの広い範囲を、提供しています。主な制限は、両方のDNA鎖を標識するための要件です。今後は、一方の鎖の両方の色素を担持する二重標識オリゴヌクレオチドプローブの開発に私たちの仕事を集中することを目指しています。
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Acknowledgments
ドイツ学術協会（DFG、ワ1386 / 17-1）によって財政支援、研究研修グループGRK 2039（DFGが資金提供）およびKITは深く感謝されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
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