Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Syntese av Wavelength-skiftende DNA hybridisasjonsprober ved hjelp av fotostabile cyaninfargestoffer

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54121
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology
* These authors contributed equally

Abstract

I denne protokollen, viser vi en fremgangsmåte for syntese av 2'-alkyn modifisert deoksyribonukleinsyre (DNA) strengene ved automatisert fastfase-syntese ved anvendelse av standard fosforamiditt-kjemi. Oligonukleotider post-syntetisk merket av to nye fotostabile cyaninfargestoffer bruker kobber-katalysert klikk-kjemi. Syntesen av både donor og akseptor fargestoff er beskrevet og er utført i tre etterfølgende trinn. Med DNA som den omgivende arkitektur, disse to farvestoffer gjennomgå en energioverføring når de bringes i tett nærhet av hybridisering. Derfor er annealing av to enkelt-trådede DNA-trådene visualisert ved en forandring av fluorescens farge. Denne fargeendring er karakterisert ved fluorescens-spektroskopi, men kan også observeres direkte ved hjelp av en håndholdt ultrafiolett (UV) lampe. Konseptet med en dual fluorescens fargeavlesning som gjør disse oligonukleotidprober utmerket verktøy for molekylær avbildning, spesielt når den som er beskrevet photostable fargestoffer brukes. Derved blir fotobleking av imaging sondene forebygges, og biologiske prosesser kan observeres i sanntid for en lengre tidsperiode.

Introduction

Molekylær avbildning representerer en fundamental teknikk for å forstå biologiske prosesser i levende celler. 1-3 Utviklingen av fluorescerende nukleinsyre basert prober for slike kjemiske-biologiske applikasjoner har blitt en voksende forskningsfelt. Disse fluorescerende prober må oppfylle noen krav for å bli egnet verktøy for celle bildebehandling. For det første bør de anvendte fargestoffer utviser fluorescens med høy kvante avkastning, stort Stokes 'skift og, viktigst av alt, høye photostabilities å tillate langsiktig in vivo imaging. Og for det andre, bør de vise en pålitelig fluorescens avlesning. Konvensjonell chromophore-drikk-systemer er basert på avlesning av en enkelt fluorescens farge ved enkle endringer i fluorescensstyrkene. 4 Denne tilnærmingen bærer risikoen for falske positive eller falske negative resultater grunnet autofluorescence av intracellulære komponenter eller lavt signal-til-støy-forhold på grunn av uønsket slukking av annen comkomponenter. 4

Vi har nylig rapportert om begrepet "DNA trafikklys" som viser to fluorescens fargeavlesninger ved anvendelse av to forskjellige kromoforene. 5-6 Konseptet er basert på energioverføring (ET) fra giveren fargestoff til akseptor-fargestoff som endrer fluorescens farge (se figur 1). Dette gir en mer pålitelig avlesning og dermed gir et kraftig verktøy for fluorescerende bildebehandling sonder. Merking av oligonukleotider med fluorescerende fargestoffer kan oppnås ved to forskjellige metoder. Fargestoffer kan inkorporeres i løpet av kjemisk DNA-syntese på en fast fase ved hjelp av tilsvarende modifiserte fosforamidit byggeklosser. 7 Denne metoden er begrenset til fargestoffer som er stabilt under standard fosforamiditt og avbeskyttelsesbetingelser. Som et alternativ, ble post-syntetiske modifikasjons metoder etablert i oligonukleotid kjemi. Her viser vi syntesen av en av våre nye bilderTabellen energi overføring parene 8,9 og etter syntetisk merking av DNA ved hjelp av kobber-katalysert 1,3-cykloaddisjon mellom azider og alkyner (CuAAC). 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: Sjå alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av de kjemikalier som anvendes i disse syntesene er giftige og kreftfremkallende. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner som vanligvis kreves i organisk kjemi laboratorier, som å bruke en laboratoriefrakk, vernebriller og hansker.

1. Syntese av fargestoffer

Merk: Begge fargestoffer kan syntetiseres ved de samme typer reaksjons Figur 2 viser en oversikt over disse reaksjoner..

  1. Syntese av 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-jodid (fargestoff 1)
    1. Syntese av 1- (3-jodpropyl) -4-metylpyridin-1-ium-jodid (figur 2A, trinn a)
      1. Oppløs 466 mg 4-pikolin og 5,91 g 1,3-diiodopropane i 10 ml acetonitril i en 20 ml ampulle topprom og slutter tett ved et septum cap.
      2. Oppvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. La blandingen avkjøles til romtemperatur, og deretter fjerne løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper.
      4. Tilsett 20 ml etylacetat, den gjenværende olje og behandle blandingen i en 120 W ultrasonisk bad i 3 min.
      5. Samle det dannede bunnfall ved filtrering og vaskes fem ganger med etylacetat. Tørk det faste produkt under vakuum, O / N.
    2. Syntese av 1- (3-azidopropyl) -4-metylpyridin-1-ium (figur 2A, trinn b)
      1. Oppløs 900 mg 1- (3-jodpropyl) -4-metylpyridin-1-ium-jodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml topprom hetteglass, tilsett 376 mg natriumazid, og slutter tett ved et septum cap.
      2. Oppvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. La blandingen avkjøles til romtemperatur, og deretter fjerne løsningsmidlet under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper.
      4. Tilsett 15 ml diklormetan til resten.
      5. Filtrer fra og kast det resulterende bunnfall.
      6. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk ved anvendelse av en råteary fordamper for å oppnå produktet som brun olje.
    3. Syntese av 1-metyl-1H-indol-3-karbaldehyd (figur 2A, trinn c)
      1. Under inert gass (argon), oppløse 1,45 g indol-3-karbaldehyd, 1,52 g kaliumkarbonat og 2,70 g dimetyl-karbonat i 10 ml absolutt dimetylformamid i en 50 ml rundkolbe utstyrt med en tilbakeløpskjøler.
      2. Omrør blandingen ved 130 ° C i 19 timer.
      3. Avkjøl til romtemperatur og hell blandingen på is.
      4. Ekstraher det vandige lag tre ganger med 150 ml etylacetat.
      5. Kombiner de organiske lag, vask dem med vann, tørker dem over natriumsulfat og fjerne løsningsmidlet ved 50 ° C under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper.
    4. Kobling til 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium-jodid (fargestoff 1) (figur 2A, trinn d)
      1. Arbeide under argon og under utelukkelse av fuktighet. oppløsteve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-metylpyridin-1-ium og 48 mg 1-metyl-1H-indol-3-karbaldehyd i 4 ml etanol i en 20 ml rundkolbe utstyrt med en tilbakeløpskjøler.
      2. Legg 0,07 ml piperidin og oppvarm til 80 ° C i 4 timer.
      3. La den avkjøles til romtemperatur.
      4. Samle det resulterende bunnfall ved filtrering og vask tre ganger med dietyleter.
      5. Legg dietyleter til supernatanten og samle det resulterende bunnfall ved filtrering. Vask tre ganger med dietyleter.
      6. Kombiner utfellinger.
  2. Syntese av 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-yl) vinyl) quinolin-1-ium-jodid (fargestoff 2)
    1. Syntese av 1- (3-jodpropyl) -4-methylquinolin-1-ium-jodid (figur 2B, trinn a)
      1. Oppløs 715 mg 4-metylkinolin og 5,91 g 1,3-diiodopropane i 10 ml acetonitril i en 20 ml ampulle topprom og slutter tett ved et septum cap.
      2. Varmetil 85 ° C i 16 timer.
      3. La blandingen avkjøles til romtemperatur, og deretter fjerne løsningsmidlet under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper.
      4. Tilsett 20 ml etylacetat, den gjenværende olje og behandle blandingen i en 120 W ultrasonisk bad i 3 min.
      5. Samle det dannede bunnfall ved filtrering og vaskes fem ganger med etylacetat. Tørk det faste produkt under vakuum, O / N.
    2. Syntese av 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium (figur 2B, trinn b)
      1. Oppløs 900 mg 1- (3-jodpropyl) -4-methylquinolin-1-ium-jodid i 12 ml acetonitril i en 20 ml topprom hetteglass, tilsett 333 mg natriumazid, og slutter tett ved et septum cap.
      2. Oppvarm til 85 ° C i 16 timer.
      3. La blandingen avkjøles til romtemperatur, og deretter fjerne løsningsmidlet under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper.
      4. Tilsett 15 ml diklormetan til resten.
      5. Filtrer fra og kast det resulterende bunnfall.
      6. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper for å oppnå produktet som brun olje.
    3. Syntese av 1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd (figur 2B, trinn c)
      1. Under inert gass (argon), oppløse 1,45 g 2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd, 0,996 g kaliumkarbonat og 1,77 g dimetyl-karbonat i 10 ml absolutt dimetylformamid i en 50 ml rundkolbe utstyrt med en tilbakeløpskjøler.
      2. Omrør blandingen ved 130 ° C i 19 timer.
      3. Avkjøl til romtemperatur og hell blandingen på is.
      4. Ekstraher det vandige lag tre ganger med 150 ml etylacetat.
      5. Kombiner de organiske lag, vask dem med vann, tørker dem over natriumsulfat og fjerne løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av rotasjonsfordamper.
    4. Kobling til 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metyl-2--fenyl-1 H-indol-3-yl) vinyl) quinolin-1-ium-jodid (figur 2B, trinn d)
      1. Jobb under argpå og under utelukkelse av fuktighet. Oppløs 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-ium og 59,7 mg 1-metyl-2-fenyl-1 H-indol-3-karbaldehyd i 4 ml etanol i en 20 ml rundkolbe utstyrt med tilbakeløpskjøler.
      2. Legg 0,06 ml piperidin og oppvarm til 80 ° C i 4 timer.
      3. La den avkjøles til romtemperatur.
      4. Samle det resulterende bunnfall ved filtrering og vask med dietyleter tre ganger.
      5. Legg dietyleter til supernatanten og samle det resulterende bunnfall ved filtrering. Vask tre ganger med dietyleter.
      6. Kombiner utfellinger.

2. Syntese av DNA-trådene

Merk: Syntese av DNA-trådene blir utført ved bruk av fosforamiditt-metoden på en fast fase, slik som beskrevet av M. Caruthers 11 på en DNA-synthesizer. Funksjon av syntetisatoren blir testet før den syntetiske prosedyren, og reagensene blir fornyet hvisnødvendig.

  1. Prearrangements
    1. Oppløse kommersielt tilgjengelig 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) i 1,2 ml amidite fortynningsmiddel (ekstra tørr acetonitril). Flytt oppløsningen i hetteglasset til en synthesizer hetteglass og skru inn synthesizer.
    2. Utfør en "lekkasjetest" (i henhold til produsentens instruksjoner) for å sørge for at ingen argon gasslekkasje eksisterer. Hvis "lekkasjetest" mislykkes, skru på flasken tettere.
    3. Prime Cu løsning ved å fylle røret som kobles til fast fase syntese kammeret.
    4. Vask alle linjer med acetonitril.
  2. Syntese av DNA-trådene
    1. Bruk den tilkoblede datamaskinen går inn i DNA-sekvensen og koblingsmetoden Følg instruksjonene fra produsentens protokoll. Koblingstrinnet av den Cu byggeelement tar 168 sek med 7 pulser (hver puls er 16 ul) sammenlignet med 40 sek med 7 pulser for en konvensjonellfosforamiditt som byggeklosser.
    2. den kolonne som inneholder CPG (kontrollert poreglass) som fast fase som er modifisert med ett pmol av den første basisfestet (DNA-syntese blir utført fra 3 'til 5') til syntesemaskinen.
    3. Starte syntesen på DNA synthesizer 11.
  3. Opparbeidelse av syntetiserte DNA-strengene
    1. Tørk kolonner med syntetiserte DNA-strengene i vakuum O / N.
    2. Bruk en tang til å åpne kolonnen og frigjøre CPG inn i en reaksjonsglasset. Legg 700 ul konsentrert ammoniakk for å avbeskytte den oligonukleotid og frigjøre DNA-tråden fra CPG.
    3. Lukk glasset og anvende en sikkerhets lokket på reaksjonskaret for å hindre den fra å sprekke, og oppvarm til 50 ° C i 18 timer.
    4. Fjerne ammoniakk ved sentrifugering under redusert trykk (100 mbar) ved 30 ° C i 30 minutter.
    5. Begynn filtrering fra CPG: Sentrifuger fartøy på 11 000 xg for 3 min. Ta supernatant og overføre den til en sentrifugalpumpe-enhet med en porestørrelse på 0,45 um. Sentrifuger ved 1000 x g i 4 min.
    6. I mellomtiden legge til 300 ul dobbeltdestillert vann til CPG, vortex i 20 sekunder og sentrifuger ved 11 000 xg i 3 min. Overfør supernatanten til sentrifugal-enheten og sentrifuger ved 1000 xg i 4 min. Gjenta dette vaskeprosedyren to ganger.
    7. Fjerne vannet fra de kombinerte vandige oppløsninger ved sentrifugering ved 0,1 mbar og 25 ° CO / N.

3. "Klikker" Prosedyre

  1. Tilsett 50 ul dobbeltdestillert vann, 25 ul av en natrium-askorbat-løsning (0,4 M i vann), 34 pl tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ul av azidet (0,01 M i DMSO / tBuOH 3: 1) og 17 ul av en tetrakis (acetonitril) -kobber (i) heksafluorfosfat-oppløsning (0,1 M i DMSO / tBuOH 3: 1) til den lyofiliserte alkyn-modifisert DNA-prøve. Inkuber prøven ved 60 ° C i 1,5 timer.
  2. Avkjøl til romtemperatur.
  3. Tilsett 150 ul Na2 EDTA (0,05 M i vann) og 450 pl natriumacetat (0,3 M i vann) til DNA-prøven og overfør til et 10 ml rør.
  4. Tilsett 10 ml etanol (100%) og hold ved -32 ° C i 16 timer.
  5. Sentrifugebeholderen i 15 min ved 1000 x g og fjern supernatanten.
  6. Vask DNA-pellet med 2 ml kald etanol (80%).
  7. Tørt pellet under redusert trykk.

4. HPLC Rensing

Merk: Før skille DNA-trådene sørge for at HPLC fungerer som den skal, er nok løsemiddel tilgjengelig og kolonnen er ren. Rens kolonne med utgangskonsentrasjon av buffer / acetonitril.

  1. Oppløs den urene DNA-pelleten i 250 ul dobbeltdestillert vann og overføring til en HPLC hetteglass.
  2. Start HPLC utført av 45 min med en gradient på 0% acetonitril til 15% acetonitril for farvestoff 1 og en gradi ent fra 0% acetonitril til 17% acetonitril for fargestoff 2. Følg med på løp ved å sjekke 260 nm (DNA absorpsjon) og 459 nm (fargestoff 1) eller 542 nm (fargestoff 2). Samle de fraksjoner som viser absorpsjon i begge bølgelengde kanaler.
  3. Kontroller de oppsamlede fraksjoner for riktig massen ved matriks-assistert laserdesorpsjon ionisering (MALDI) massespektrometri ved anvendelse av en matrise bestående av 3-hydroxypicolinic syre (3HPA) og diammoniumhydrogencitrate.
    1. Fremstille matrisen ved å blande 900 ul av en mettet, 3-HPA-løsning i 1: 1-blanding av acetonitril og vann med 100 ul av en diammoniumhydrogencitrate oppløsning (100 g / l) i vann.
    2. Pipetter 1-2 mL av DNA-probe på målet og la det tørke på lufta.
    3. Legg 0,2 mL av 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matrise til prøven og bland inntil den krystalliserer.
    4. Utfør MALDI massespektrometri.
    5. Kombinere disse HPLC fraksjoner som viser riktig masse.
_title "> 5. Fastsettelse av Konsentrasjon

Merk: Konsentrasjonen bestemmes ved å måle absorpsjonen ved 260 nm ved anvendelse av et UV / Vis spektrofotometer, basert på ekstinksjonskoeffisientene (ε 260) av de DNA-baser og fargestoff.

  1. Oppløs DNA i 100 - 200 ul dobbeltdestillert vann.
  2. Anvende 1 ul av DNA-oppløsningen på det UV / Vis spektrofotometer.
  3. Mål absorpsjonen ved 260 nm. Gjenta tre ganger.
  4. Ta gjennomsnittsverdien for å beregne konsentrasjonen av løsningen. For beregning av ekstinksjonskoeffisientene, bruk ε 260 nm av de fire naturlige basene 12 og den ε 260 nm av den kjøpte byggeelement Cu (betraktet som naturlig uridin) 12 for å oppnå den ε 260nm av hele DNA-tråden. For fargestoff 1, bruk ε 260nm = 10200 L * mol -1 * cm -1 og for fargestoff 2, bruk ε 260nm = 13100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Beregn konsentrasjonen av løsningen følgende Lambert-Beers lov, basert på ekstinksjonskoeffisientene og målte absorbansen. 13

6. Prøvepreparering og spektroskopi

  1. Utarbeidelse av enkelttrådprøver
    1. Forbered separat 1 ml 2,5 mikrometer løsninger av hver av de modifiserte DNA1 og DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM lur i buffer, pH = 7.
  2. Fremstilling av dobbeltstrengprøver
    1. Fremstille 1 ml av en oppløsning inneholdende 2,5 mM av DNA1 og 2,5 uM av DNA2 i 200 mM NaCl, 50 mM NAP i buffer, pH = 7 i et reaksjonskar.
    2. Sikre lokk med en sikkerhetshette og oppvarm til 90 ° C i 10 min. Deretter slår du av varme og la det avkjøles til romtemperatur O / N.
  3. absorpsjonsspektroskopi
    Merk: For å bestemme eksitasjon bølgelengde for fluorescens spectroscopy absorpsjon spektra er registrert.
    1. Enkelt strand målinger
      1. Spill inn en blank måling som bare inneholder 200 mM NaCl, 50 mM lur i buffer, pH = 7.
      2. Overfør den tilberedte oppløsning av DNA1 inn i en 1 cm kvartsglass kyvette og registrere absorpsjonen. Korrigere målingen mot tomme data. Bestemme den maksimale verdi av fargestoff absorpsjon.
      3. Gjenta for DNA2.
  4. flourescensspektroskopi
    1. Enkelt strand målinger
      1. Spill inn en blank måling som bare inneholder 200 mM NaCl, 50 mM lur i buffer, pH = 7; ved hjelp av eksitasjonsbølgelengden av fargestoff 1.
      2. Overfør DNA1 oppløsning i en 1 cm kvartsglass kyvette.
      3. Spill fluorescens spektrum.
    2. Dobbel tråd måling
      1. Overfør dobbel tråd oppløsning i en kvartsglass kyvette. Registrere fluorescens-spekteret ved hjelp av eksitasjonsbølgelengden av fargestoff 1.
  5. visualisering eksperimenter
    Forsiktig: Passende beskyttelsesbriller bør brukes for å unngå UV skade øynene!
    1. For å få en bedre forståelse av hva de registrerte spektra viser, strålebehandling kyvettene med håndholdt UV-lamper (figur 5). Observere endringen i fluorescens farge fra enkelt til dobbelt DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Absorpsjon og fluorescens-spektrene av de enkle og doble DNA føres som vist i figur 4.

Den registrerte absorpsjon spektra (figur 4 til høyre) viser absorpsjonsmaksima λ max ved 465 nm for enkelt-strandet DNA1 (fargestoff 1) og 546 nm for enkelt-strandet DNA2 (fargestoff 2). Herdet DNA1_2 (fargestoff 1 & fargestoff 2) viser maksima ved både 469 nm og 567 nm. Begge absorbsjonsmaksima viser et bathochromic skift, 4 nm for farvestoff 1 og 21 nm for fargestoff 2. Disse små spektroskopiske endringene er et resultat av excitonic interaksjoner mellom fargestoffer innen den doble spiralformede DNA-arkitektur.

Den tilsvarende fluorescens spektra (figur 4 til venstre) utstillings maxima λ max, ved 537 nm for enkelt-strandet DNA1 (fargestoff 1, eksitasjon ved 435 nm), ved 607 nm for enkelt-stranded DNA2 (fargestoff 2, eksitasjon ved 535 nm) og 615 nm for glødet DNA1_2 (fargestoff 1 & dye 2, eksitasjon ved 435 nm). DNA1_2 viser utelukkende utslipp maksimalt fargestoff 2 selv om fargestoff 1 er selektivt spent som bevis på at energioverføringen skjer effektivt fra dye en å farge 2. Dette gir et utslipp kontrastforhold på 01:57.

Forskjellen mellom enkelt- og dobbeltkjede er åpenbar ved sammenligning av emisjons farge i kyvetten under eksitasjon med en standard UV-lampe som vist i figur 5.

Figur 1
Figur 1. Grunnleggende konseptet med en energioverføring i DNA. Donor modifiserte DNA-kjede (grønn) viser fluorescens ved 535 nm ved bestråling ved 435 nm. Dersom det blir hybridisert med akseptor-modifiserte telleren tråd (rød) av den resulterende dobbeltkjede shows bare den røde fluorescens av akseptor fargestoff på 610 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Syntese oversikt over fargestoff 1 og fargestoff 2. Syntesen av de to cyaninfargestoffer 1 (A) og 2 (B) gjennomføres i tre etterfølgende trinn. 9 (A) a) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 timer, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 87%; c) K 2 CO 3, dimetylkarbonat, DMF, 130 ° C, 19 timer, 89%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 timer, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 timer, 93%; c) K 2 CO 3, dimetylkarbonat, DMF, 130 ° C, 19 timer, 98%; d) piperidine, EtOH, 80 ° C, 4 timer, 44%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Oppbygging av Cu-byggestein, fargestoffer 1 og 2 og sekvenser av DNA1 og DNA2. De fargestoffer 1 og 2 er knyttet til to 'posisjon ribose av en triazole linker innenfor gitte sekvenser av DNA1 og DNA2. 9 klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Fluorescence av enkle og doble DNA-strengene (til venstre) og absorpsjon av enkle og doble DNA-strengene (til høyre). Utslipp spektra av DNA1 (svart) spent på 464 nm, DNA2 (rød), spent på 535 nm og 435 nm (rosa ), og DNA1_DNA2 hybrid (blå), spent på 435 nm blir vist. Absorpsjon spektra av singelen strandet DNA1 (svart), DNA2 (rød), og den hybridiserte dobbel tråd DNA1_DNA2 (blå) er vist på høyre side vis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Utslipp fargen på enkelttrådet DNA med donor fargestoff (til venstre) og dobbelt-trådet DNA med donor og akseptor fargestoff (rett) under eksitasjon av en UV-lampe. Bildet av kuvette inneholdende den enkelkjedete DNA1 (left side) viser lyse grønn fluorescens, og bildet av dobbel strandet DNA1_DNA2 (høyre side) viser rød fluorescens i løpet av eksitasjon av en håndholdt UV-lampe ved 366 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen viser hele prosedyren for å merke DNA post-syntetisk via CuAAC av azid-modifisert fluorescerende fargestoffer. Dette omfatter syntesen av fargestoffer og alkyn-modifiserte DNA, så vel som merkingsprosedyren.

Syntesen av fargestoffer som følger fire trinn. Alle produktene kan oppnås ved en ganske enkel utfelling på grunn av sin positive ladning og ikke noe tidkrevende kolonnekromatografi er nødvendig. Innføringen av azidet funksjonalitet før de sentrale koblingstrinnene forkorter syntesene av fargestoffene til fire i stedet for fem påfølgende reaksjonstrinn. Anvendelsen av 1,3-diiodopropane i stedet for 3-jodpropanol for alkyleringstrinnet, den Appel reaksjonen og de følgende Finkelstein reaksjoner for å konvertere hydroksylfunksjonen til Jod funksjonaliteten ble unngått. Disse endringene i forhold til de publiserte prosedyrer tillate oss å syntetisere fargestoffer i større skala og kortere perioder.

(f.eks avbeskyttelse med kaliumkarbonat). Dette representerer et betydelig mer kostbart alternativ, og krever syntesen av de tilsvarende fargestoff modifisert fosforamiditter som DNA-byggestenene eller merkingen på den faste bærer (på-bead).

DNA1 er merket med fargestoff 1, giver fargestoff, og DNA2 av fargestoff 2, den akseptor fargestoff. Når DNA1 og DNA2 er glødet både fargestoffer komme inn i umiddelbar nærhet. En effektiv energioverføring er observert når fargestoff en er opphisset. I prinsippet kan excitonic samspillet mellom begge fargestoffer forstyrre en effektiv energioverføring siden sistnevnte prosessen krever frakoblet og opphissed fargestoff 1 og frikoblet dye 2. eksitasjon av de sammenkoblede fargestoffer ville sette i gang ulike photophysical veier. 14 Våre tidligere studier 9,15 avdekket at det påførte 3'-5'-diagonal arrangement av fargestoffer gir den strukturelle grunnlaget for bare små excitonic interaksjoner mellom den fargestoffer og effektiv energioverføring.

Den høye effektivitet av de viste energioverføring gjør det mulig nøyaktig avlesning fluorescens in in vitro og in vivo eksperimenter. Dette tilbyr et bredt spekter av bruksområder, inkludert visualisering av DNA hybridisering i molekylære beacons, binding av målmolekylene i nukleinsyre basert aptamerer samt visualisering av integriteten av små interfererende RNA (siRNA) inne celler. Den store begrensningen er kravet om å merke begge DNA-trådene. I fremtiden ønsker vi å fokusere vårt arbeid på utvikling av dobbelt merkede oligonukleotidprober som bærer både fargestoffer i en tråd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Økonomisk støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), Forskningsrådet Training Group GRK 2039 (finansiert av DFG) og KIT er takknemlig erkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
synthesis
4-Picoline Sigma Aldrich 239615
1,3-Diiodopropane Sigma Aldrich 238414
Acetonitrile Fisher Scientific 10660131 HPLC grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10456870 technical grade
Sodium azide Sigma Aldrich 71290 p.a. grade
Dichloromethane Fisher Scientific 10626642 technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98% ABCR AB112969
Potassium carbonate, 99+% Acros 424081000
dimethylcarbonate Sigma Aldrich 517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve Acros 348435000
Sodium sulfate Bernd Kraft 12623.46
Ethanol, 99.5% Acros 397690010
Piperidine, 99% Acros 147181000
Diethylether Fisher Scientific 10407830 technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% ABCR AB125050
4-Methylquinoline ABCR AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer Applied Biosystems  -
DMT-dA(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich A111081
DMT-dT Phosphoramidite Sigma Aldrich T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite Sigma Aldrich G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite Sigma Aldrich C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma Aldrich L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis Sigma Aldrich L010400
Cap A Sigma Aldrich L840000
Cap B Sigma Aldrich L850000
CPG dT Column 1.0 µmole Proligo Reagents T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole Proligo Reagents G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole Proligo Reagents C461010
ammonia (aqueous solution)  Fluka Analytical 318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm Pall ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) Sigma Aldrich 75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite Chem Genes ANP-7754
workup
vacuum concentrator Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate Sigma Aldrich 346276
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich A7631
EDTA disodium salt Sigma Aldrich E5134
TBTA-ligand  -  - synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer Bruker Daltonics
LC-318 C18 column Supelcosil via Sigma Aldrich 58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio Varian
Fluoromax-3 fluorimeter Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
  2. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  3. Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
  4. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
  5. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
  6. Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
  7. Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
  8. Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
  9. Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
  10. Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
  11. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  12. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
  13. Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
  14. Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
  15. Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).

Tags

Molecular Biology oligonukleotider energioverføring fluorescens klikk-kjemi fargestoffer fotostabile
Syntese av Wavelength-skiftende DNA hybridisasjonsprober ved hjelp av fotostabile cyaninfargestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arndt, S., Walter, H. K.,… More

Arndt, S., Walter, H. K., Wagenknecht, H. A. Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes. J. Vis. Exp. (113), e54121, doi:10.3791/54121 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter