Abstract
In questo protocollo, dimostriamo un metodo per la sintesi di 2'-alchino modificato acido (DNA) trefoli nucleici di sintesi in fase solida utilizzando la chimica automatizzata fosforamidite standard. Oligonucleotidi sono post-sinteticamente etichettate da due nuove tinte cianina fotostabili utilizzando rame-catalizzata click-chimica. La sintesi di dye donatore e accettore è descritto ed avviene in tre fasi consecutive. Con il DNA come l'architettura circostante, questi due coloranti subiscono un trasferimento di energia quando vengono portati in stretta prossimità mediante ibridazione. Pertanto, ricottura di due singoli filamenti di DNA bloccati viene visualizzato da un cambiamento di colore di fluorescenza. Questo cambiamento di colore è caratterizzato mediante spettroscopia di fluorescenza, ma può anche essere osservato direttamente utilizzando una lampada ultravioletta palmare (UV). Il concetto di una doppia lettura di fluorescenza di colore rende questi sonde oligonucleotidiche ottimi strumenti per l'imaging molecolare soprattutto quando il pho descrittocoloranti tostable vengono utilizzati. In tal modo, photobleaching delle sonde di imaging è impedito, e processi biologici può essere osservato in tempo reale per un periodo di tempo più lungo.
Introduction
Imaging molecolare rappresenta una tecnica fondamentale per la comprensione dei processi biologici all'interno delle cellule viventi. 1-3 Lo sviluppo di fluorescenti sonde base di acido nucleico per tali applicazioni chimico-biologico è diventato un campo di ricerca in espansione. Queste sonde fluorescenti devono soddisfare alcuni requisiti per diventare strumenti adatti per l'imaging cellulare. In primo luogo, i coloranti applicati devono mostrare fluorescenza con elevati rendimenti quantici, turni grande Stokes 'e, soprattutto, di alta photostabilities per consentire a lungo termine imaging in vivo. E in secondo luogo, essi dovrebbero mostrare una lettura di fluorescenza affidabile. Convenzionale cromoforo-quencher sistemi si basano sulla lettura di un singolo colore di fluorescenza con semplici cambiamenti di intensità di fluorescenza. 4 Questo approccio si assume il rischio di risultati falsi positivi o falsi negativi a causa di autofluorescenza di componenti intracellulari o bassi rapporti segnale-rumore a causa di quenching indesiderato da altri comcomponenti. 4
Recentemente abbiamo riportato sul concetto di "semafori DNA" che mostrano doppio letture colore fluorescenza utilizzando due cromofori differenti. 5-6 Il concetto è basato sul trasferimento di energia (ET) dalla tintura donatore al colorante accettore che cambia la fluorescenza colore (vedi Figura 1). Questo consente una lettura più affidabile e quindi fornisce un potente strumento per sonde di imaging fluorescenti. Etichettatura di oligonucleotidi con coloranti fluorescenti può essere ottenuto mediante due approcci diversi. Coloranti possono essere incorporati durante la sintesi del DNA chimica su una fase solida utilizzando blocchi fosforammidito corrispondentemente modificati. 7 Questo metodo è limitato ai coloranti che sono stabili in condizioni Phosphoramidite e deprotezione standard. In alternativa, le metodologie di modificazione post-sintetici sono stati stabiliti in oligonucleotide chimica. Qui, dimostriamo la sintesi di una delle nostre nuove fotoenergia tabella coppie di trasferimento 8,9 e l'etichettatura di post-sintetico del DNA utilizzando rame-catalizzata 1,3-cicloaddizione tra azidi ed alchini (CuAAC). 10
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Protocol
Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate che sono tipicamente richiesti nei laboratori di chimica organica, come ad esempio indossare un camice da laboratorio, occhiali e guanti.
1. Sintesi dei coloranti
Nota: Le due coloranti possono essere sintetizzati dagli stessi tipi di reazione Figura 2 mostra una panoramica di queste reazioni..
- Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1)
- Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro (Figura 2A, passaggio a)
- Sciogliere 466 mg 4-picolina e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto.
- Riscaldare a 85 ° C per 16 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Aggiungere 20 ml di etile acetato per l'olio residuo e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min.
- Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N.
- Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io (Figura 2A, fase b)
- Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 376 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto.
- Riscaldare a 85 ° C per 16 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo.
- Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante.
- Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un rotevaporatore ary per ottenere il prodotto come olio bruno.
- Sintesi di 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2A, fase c)
- Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g indolo-3-carbaldeide, carbonato di potassio 1,52 ge 2,70 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo.
- Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio.
- Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml.
- Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a 50 ° C sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io ioduro (dye 1) (Figura 2A, fase d)
- Lavorare sotto argon e con esclusione di umidità. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridin-1-io e 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo.
- Aggiungere 0,07 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore.
- Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
- Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare tre volte con dietiletere.
- Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico.
- Unire i precipitati.
- Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylpyridin-1-io ioduro (Figura 2A, passaggio a)
- Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (dye 2)
- Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro (Figura 2B, il passaggio a)
- Sciogliere 715 mg 4 methylquinoline e 5,91 g di 1,3-diiodopropano in 10 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flacone 20 ml e sigillare ermeticamente da un tappo setto.
- Calorea 85 ° C per 16 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Aggiungere 20 ml di etile acetato per l'olio rimanente e trattare la miscela in un bagno ad ultrasuoni W 120 per 3 min.
- Raccogliere il precipitato formatosi mediante filtrazione e lavare cinque volte con acetato di etile. Essiccare il prodotto solido sottovuoto O / N.
- Sintesi di 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io (Figura 2B, fase b)
- Sciogliere 900 mg 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro in 12 ml di acetonitrile in uno spazio di testa flaconcino 20 ml, aggiungere 333 mg di sodio azide, e sigillare ermeticamente da un tappo setto.
- Riscaldare a 85 ° C per 16 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, quindi rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Aggiungere 15 ml di diclorometano al residuo.
- Filtrare fuori e scartare il precipitato risultante.
- Rimuovere la u solventender pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante per ottenere il prodotto come olio bruno.
- Sintesi di 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide (Figura 2B, la fase c)
- Sotto gas inerte (argon), sciogliere 1,45 g di 2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide, carbonato di potassio 0,996 ge 1,77 g dimetil carbonato in 10 ml di dimetilformammide assoluta in 50 ml pallone munito di refrigerante a ricadere a fondo rotondo.
- Mescolare la miscela a 130 ° C per 19 ore.
- Lasciare raffreddare a RT, poi versate il composto sul ghiaccio.
- Estrarre la fase acquosa tre volte con acetato di etile 150 ml.
- Combinare gli strati organici, lavarli con acqua, asciugarli su solfato di sodio e rimuovere il solvente a pressione ridotta usando evaporatore rotante.
- Accoppiamento di 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-metil-2-phe NYL-1H-indol-3-il) vinil) idrossi-1-io ioduro (Figura 2B, fase d)
- Lavorare sotto argsopra e sotto l'esclusione di umidità. Disciogliere 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylquinolin-1-io e 59,7 mg 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldeide in 4 ml di etanolo in 20 ml pallone a fondo tondo dotato di condensatore a riflusso.
- Aggiungere 0,06 ml piperidina e si riscalda a 80 ° C per 4 ore.
- Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
- Raccogliere il precipitato per filtrazione e lavare con dietiletere tre volte.
- Aggiungere dietiletere al surnatante e raccogliere il precipitato per filtrazione. Lavare tre volte con etere etilico.
- Unire i precipitati.
- Sintesi di 1- (3-iodopropyl) -4-methylquinolin-1-io ioduro (Figura 2B, il passaggio a)
2. Sintesi dei filamenti di DNA
Nota: La sintesi dei filamenti di DNA viene effettuata con il metodo fosforammidito su una fase solida, come descritto da M. Caruthers 11 su un sintetizzatore di DNA. Il funzionamento del sintetizzatore viene testato prima della procedura di sintesi e reagenti si rinnovano senecessario.
- predisposizioni
- Sciogliere il disponibile in commercio 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml di diluente amidite (acetonitrile extra dry). Spostare soluzione nel flaconcino di una fiala sintetizzatore e avvitare in sintetizzatore.
- Eseguire un "test di tenuta" (secondo le istruzioni del produttore) per assicurarsi che non esiste alcuna fuga di gas argon. Se la "prova di tenuta" fallisce, avvitare il flacone più strettamente.
- Prime soluzione cU riempiendo il tubo che collega la camera di sintesi in fase solida.
- Lavare tutte le linee con acetonitrile.
- Sintesi di filamenti di DNA
- Usare il computer collegato ad entrare nel metodo di sequenza del DNA e l'accoppiamento, seguendo le istruzioni dal protocollo del produttore. La fase di accoppiamento del blocco di costruzione cU prende 168 secondi con 7 impulsi (ogni impulso sono 16 ml) rispetto a 40 sec con 7 impulsi per una convenzionalePhosphoramidite come blocchi di costruzione.
- Montare la colonna contenente la CPG (vetro pori controllata) come fase solida che viene modificato con 1 mol della prima base (sintesi del DNA viene eseguita da 3 'a 5') nel sintetizzatore.
- Avviare la sintesi sul sintetizzatore di DNA 11.
- Workup di filamenti di DNA sintetizzati
- Asciugare le colonne con i filamenti di DNA sintetizzati sotto vuoto O / N.
- Utilizzare una pinza per aprire la colonna e rilasciare il CPG in una fiala di reazione. Aggiungere 700 ml di soluzione di ammoniaca acquosa concentrata al deproteggere l'oligonucleotide e rilasciare il filamento di DNA dal CPG.
- Chiudere la fiala e applicare un coperchio di sicurezza sul recipiente di reazione per evitarne la rottura, e si riscalda a 50 ° C per 18 ore.
- Rimuovere ammoniaca mediante centrifugazione a pressione ridotta (100 mbar) a 30 ° C per 30 min.
- Inizia filtrazione da CPG: nave Centrifugare a 11.000 xg for 3 min. Prendere supernatante e trasferirlo in un dispositivo centrifuga con dimensione dei pori di 0,45 micron. Centrifugare a 1000 xg per 4 min.
- Nel frattempo aggiungere 300 ml di acqua distillata al doppio CPG, vortex per 20 secondi e centrifugare a 11.000 xg per 3 min. Trasferire il surnatante nel dispositivo centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 4 min. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte.
- Rimuovere l'acqua dalle soluzioni acquose riunite per centrifugazione a 0,1 mbar e 25 ° CO / N.
3. Procedura "Cliccando"
- Aggiungere 50 ml di acqua bidistillata, 25 ml di una soluzione di ascorbato di sodio (0,4 M in acqua), 34 microlitri tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ml di azide (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ml di un tetrakis (acetonitrile) di rame (I) soluzione esafluorofosfato (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) al campione di DNA alchino-modificato liofilizzato. Incubare il campione a 60 ° C per 1,5 ore.
- Raffreddare a RT.
- Aggiungere 150 microlitri Na 2 EDTA (0,05 M in acqua) e 450 ml di acetato di sodio (0,3 M in acqua) per il campione di DNA e trasferimento in una provetta da 10 ml.
- Aggiungere 10 ml di etanolo (100%) e mantenerlo a -32 ° C per 16 ore.
- nave Centrifugare per 15 minuti a 1000 xg e rimuovere il surnatante.
- Lavare DNA pellet con 2 ml di etanolo freddo (80%).
- pellet secco sotto pressione ridotta.
4. HPLC Purificazione
Nota: Prima di separare i filamenti di DNA assicurarsi che l'HPLC funziona correttamente, abbastanza solvente è disponibile e la colonna è pulito. Lavare colonna con la concentrazione iniziale di tampone / acetonitrile.
- Sciogliere il greggio DNA pellet in 250 ml di acqua bidistillata e trasferimento in una fiala HPLC.
- Inizia HPLC run di 45 min con un gradiente di 0% acetonitrile al 15% di acetonitrile per tinture 1 e gradi ento di 0% acetonitrile al 17% di acetonitrile per tintura 2. Monitorare la corsa controllando 260 nm (assorbimento DNA) e 459 nm (dye 1) o 542 nm (dye 2). Raccogliere quelle frazioni che mostrano assorbimento in entrambi i canali di lunghezza d'onda.
- Controllare le frazioni raccolte per la messa destra matrice assistito ionizzazione desorbimento laser (MALDI) spettrometria di massa utilizzando una matrice costituita da 3 hydroxypicolinic acido (3 hPa) e diammoniumhydrogencitrate.
- Preparare la matrice mescolando 900 ml di una soluzione satura di 3 HPA in 1: 1 miscela di acetonitrile e acqua con 100 ml di una soluzione diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) in acqua.
- Pipetta 1-2 ml di sonda DNA sul bersaglio e lasciare asciugare all'aria.
- Aggiungere 0,2 ml di matrice 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate al campione e mescolare fino cristallizza.
- Eseguire la spettrometria di massa MALDI.
- Unire le frazioni HPLC che presentano la massa a destra.
Nota: La concentrazione viene determinata misurando l'assorbimento a 260 nm usando un UV / Vis spettrofotometro, sulla base dei coefficienti di estinzione (ε 260) delle basi del DNA e il colorante.
- Sciogliere il DNA in 100 - 200 ml di acqua bidistillata.
- Applicare 1 ml di soluzione di DNA in UV / Vis spettrofotometro.
- Misurare l'assorbimento a 260 nm. Ripetete tre volte.
- Prendere il valore medio per calcolare la concentrazione della soluzione. Per il calcolo dei coefficienti di estinzione, utilizzare ε 260nm delle quattro basi naturali 12 e 260 nm ε della CU blocco acquistato (considerato come uridina naturale) 12 per ottenere l'260nm ε dell'intero filamento di DNA. Per tintura 1, uso ε 260 nm = 10,200 L * mol -1 * cm -1 e tintura 2, l'uso ε 260 nm = 13.100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Calcolare la concentrazione della soluzione seguente legge di Lambert-Beers 'sulla base dei coefficienti di estinzione e assorbanze misurate. 13
6. Preparazione del campione e Spettroscopia
- Preparazione dei campioni singolo filamento
- Preparare separatamente 1 ml di 2,5 uM soluzioni di ciascuno degli DNA1 modificato e DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i buffer, pH = 7.
- Preparazione dei campioni doppio filamento
- Preparare 1 ml di una soluzione contenente 2,5 mM di DNA1 e 2,5 mM di DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7 in un recipiente di reazione.
- Fissare il coperchio con un tappo di sicurezza e di calore a 90 ° C per 10 min. Quindi spegnere il riscaldamento e lasciar raffreddare fino a RT O / N.
- spettroscopia di assorbimento
Nota: per determinare la lunghezza d'onda di eccitazione per la specifica di fluorescenzaspettri di assorbimento troscopy sono registrati.- Misurazioni singole Strand
- Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7.
- Trasferire la soluzione preparata di DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo e registrare l'assorbimento. Correggere la misurazione con i dati vuoti. Determinare il valore massimo di assorbimento colorante.
- Ripetere l'operazione per DNA2.
- Misurazioni singole Strand
- spettroscopia di fluorescenza
- Misurazioni singole Strand
- Registrare una misurazione in bianco contenente solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP i tampone pH = 7; utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione di colorante 1.
- Trasferire la soluzione DNA1 in vaschetta da 1 cm vetro di quarzo.
- Registrare lo spettro di fluorescenza.
- Misurazione doppio filamento
- Trasferire la soluzione a doppio filamento in una provetta di vetro di quarzo. Registrare lo spettro di fluorescenza utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione di colorante 1.
- Misurazioni singole Strand
- esperimenti di visualizzazione
Attenzione: la protezione degli occhi adeguata dovrebbe essere indossato per evitare danni UV per gli occhi!- Per ottenere una migliore comprensione di ciò che gli spettri registrati stanno mostrando, irradiare le cuvette con palmare lampade UV (Figura 5). Osservare il cambiamento di colore di fluorescenza dal singolo al DNA a doppio filamento.
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Representative Results
Assorbimento e spettri di fluorescenza del DNA a singolo e doppio filamento sono registrati come mostrato in Figura 4.
Gli spettri di assorbimento registrata (Figura 4 a destra) mostrano l'assorbimento massimi λ max a 465 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1) e 546 nm per DNA2 a singolo filamento (dye 2). Il DNA1_2 ricotto (dye 1 & dye 2) mostra massimi sia a 469 nm e 567 nm. Entrambi massimi di assorbimento mostrano uno spostamento batocromico, 4 nm per tinture 1 e 21 nm per tinture 2. Queste piccole variazioni spettroscopiche sono il risultato di interazioni eccitoniche tra i coloranti all'interno dell'architettura doppia elica del DNA.
Gli spettri di fluorescenza corrispondente (figura 4 a sinistra) mostra maxima λ max, a 537 nm per DNA1 a singolo filamento (dye 1, eccitazione a 435 nm), a 607 nm per singoloDNA2 -stranded (tintura 2, eccitazione a 535 nm) e 615 nm per DNA1_2 ricotto (colorante 1 & dye 2, eccitazione a 435 nm). DNA1_2 mostra solo la massima emissione di tintura 2, anche se tintura 1 è selettivamente eccitato il quale evidenzia che il trasferimento di energia avviene in modo efficiente da tintura 1 per tingere 2. Questo dà un rapporto di contrasto emissione di 01:57.
La differenza tra singola e doppia è evidente confrontando il colore dell'emissione in cuvetta durante l'eccitazione con una lampada UV standard, come illustrato in figura 5.
Figura 1. concetto di base di un trasferimento di energia in DNA. Il donatore modificato DNA strand (verde) mostra la fluorescenza a 535 nm su di irradiazione a 435 nm. Se è ibridato con il contatore filamento accettore-modificato (rosso) risultante doppio filamento shows solo la fluorescenza rossa del colorante accettore a 610 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sintesi panoramica di colorante 1 e tintura 2. La sintesi dei due coloranti cianinici 1 (A) e 2 (B) viene condotta in tre fasi consecutive. 9 (A) a) 1,3-diiodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 ore, 94%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 ore, 87%; c) K 2 CO 3, dimetil carbonato, DMF, 130 ° C, 19 ore, 89%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 ore, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropano, CH 3 CN, 85 ° C, 16 ore, 49%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 ore, 93%; c) K 2 CO 3, dimetil carbonato, DMF, 130 ° C, 19 ore, 98%; d) piperidina, EtOH, 80 ° C, 4 ore, 44%. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Struttura del blocco Cu-building, coloranti 1 e 2 e sequenze di DNA1 e DNA2. I coloranti 1 e 2 sono legati alla posizione 2 'del ribosio da un linker triazolo all'interno delle sequenze date di DNA1 e DNA2. 9 clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Fluorescence di filamenti di DNA bloccati singole e doppie (a sinistra) e l'assorbimento dei filamenti di DNA bloccati singole e doppie (a destra). Emissione spettri di DNA1 (nero) eccitato a 464 nm, DNA2 (rosso), eccitato a 535 nm e 435 nm (rosa ), e DNA1_DNA2 ibrida (blu), eccitato a 435 nm sono mostrati. Gli spettri di assorbimento del DNA1 singolo filamento (nero), DNA2 (rosso), ed il ibridato DNA1_DNA2 filo doppio (blu) vengono visualizzati sul lato destro spettacolo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. colore di emissione del DNA a singolo filamento con la tintura dei donatori (a sinistra) e DNA a doppio filamento con donatore e accettore colorante (a destra) durante l'eccitazione da una lampada UV. L'immagine della provetta contenente il singolo filamento DNA1 (LEFt lato) mostra una fluorescenza verde brillante, e l'immagine di DNA1_DNA2 a doppio filamento (lato destro) mostra fluorescenza rossa durante l'eccitazione da un palmare lampada UV a 366 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo mostra la procedura completa di etichettare DNA post-sinteticamente tramite CuAAC dai coloranti fluorescenti azide modificati. Questo include la sintesi dei coloranti e il DNA alchino modificato così come la procedura di etichettatura.
La sintesi dei coloranti segue quattro fasi. Tutti i prodotti possono essere ottenuti da un piuttosto semplice precipitazione causa della loro carica positiva e non è necessaria tempo cromatografia su colonna. L'introduzione delle funzionalità azide prima delle fasi di accoppiamento centrali accorcia le sintesi dei coloranti a quattro invece di cinque stadi di reazione consecutivi. L'applicazione di 1,3-diiodopropano invece di 3-iodopropanol per la fase di alchilazione, la reazione Appel e le seguenti reazioni Finkelstein per convertire la funzione ossidrilica in funzionalità iodo stati evitati. Queste modifiche rispetto alle procedure pubblicate ci permettono di sintetizzare i coloranti in scala più ampia e più brevi periodi di tempo.
DNA1 è etichettato dalla tintura 1, il colorante dei donatori, e DNA2 da tintura 2, il colorante accettore. Quando DNA1 e DNA2 sono ricotti entrambi i coloranti entrare in stretta vicinanza. Un trasferimento di energia efficiente si osserva quando colorante 1 è eccitata. In linea di principio, l'interazione tra i due eccitonico coloranti può interferire con un trasferimento di energia efficiente, in quanto quest'ultimo processo richiede la disaccoppiato ed eccitared tintura 1 e tintura disaccoppiato 2. eccitazione dei coloranti accoppiati avrebbe avviato diversi percorsi fotofisiche. 14 I nostri studi precedenti 9,15 rivelato che la disposizione applicata 3'-5'-diagonale di coloranti fornisce la base strutturale per solo piccole interazioni tra eccitoniche I coloranti e trasferimento di energia efficiente.
L'alta efficienza del trasferimento di energia dimostrata consente una precisa lettura della fluorescenza in vitro e in vivo. Questo offre una vasta gamma di applicazioni, tra cui la visualizzazione di ibridazione DNA in beacon molecolare, legame di molecole bersaglio in aptameri acido nucleico basato nonché la visualizzazione dell'integrità di piccoli RNA interferenti (siRNA) all'interno delle cellule. La limitazione principale è l'obbligo di etichettare entrambi i filamenti di DNA. In futuro ci proponiamo di concentrare il nostro lavoro sullo sviluppo di sonde oligonucleotidiche marcate doppiamente recanti entrambi i coloranti in un unico filone.
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Acknowledgments
Il sostegno finanziario dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), la ricerca di formazione Gruppo GRK 2039 (finanziato dalla DFG) e kit ringraziano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
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