Abstract
In dit protocol tonen we een werkwijze voor de synthese van 2'-alkyn gemodificeerd desoxyribonucleïnezuur (DNA) strengen door geautomatiseerde vaste fase synthese onder toepassing van standaard fosforamidietchemie. Oligonucleotiden worden post-synthetisch gelabeld door twee nieuwe photostable cyaninekleurstoffen met behulp van koper-gekatalyseerde click-chemie. De synthese van donor en acceptor kleurstof wordt beschreven en wordt uitgevoerd in drie opeenvolgende stappen. Het DNA als de omringende architectuur, beide kleurstoffen energieoverdracht ondergaan wanneer zij door hybridisatie dicht bij elkaar worden gebracht. Daarom is annealen van twee enkelstrengs DNA strengen zichtbaar gemaakt door een verandering van fluorescentie kleur. Deze kleurverandering wordt gekenmerkt door fluorescentiespectroscopie maar kunnen ook direct worden waargenomen met behulp van een handheld ultraviolet (UV) lamp. Het concept van een dubbele fluorescentiekleur uitlezing maakt deze oligonucleotideprobes uitstekende instrumenten voor moleculaire beeldvorming vooral bij de beschreven photostable kleurstoffen worden gebruikt. Daardoor wordt fotobleken van de beeldvormende sondes voorkomen en biologische processen in real time worden waargenomen voor een langere tijdsperiode.
Introduction
Moleculaire beeldvorming is een fundamentele techniek voor het begrijpen van biologische processen in levende cellen. 03/01 De ontwikkeling van fluorescerende nucleïnezuur gebaseerde probes voor dergelijke chemische-biologische toepassingen is een groeiende onderzoeksveld geworden. Deze fluorescerende probes nodig hebt om een paar eisen te voldoen om een geschikte tool voor cell imaging geworden. Ten eerste moet de toegepaste kleurstoffen fluorescentie met hoge kwantumopbrengsten vertonen grote Stokes verschuivingen en vooral hoge photostabilities langdurige in vivo beeldvorming mogelijk. En ten tweede moeten ze een betrouwbare fluorescentie uitlezing te tonen. Conventionele chromofoor-quencher-systemen zijn gebaseerd op het uitlezen van een enkele fluorescentie kleur door eenvoudige veranderingen in fluorescentie-intensiteiten. 4 Deze benadering draagt het risico van vals positieve of vals negatieve resultaten als gevolg van autofluorescentie van intracellulaire componenten of lage signaal-ruisverhouding door ongewenste uitdoving door andere comonderdelen. 4
We hebben onlangs gemeld op het begrip "DNA verkeerslichten 'die dubbele fluorescentiekleur uitlezingen tonen door twee verschillende chromoforen. 5-6 Het concept is gebaseerd op de energieoverdracht (ET) vanaf de donorkleurstof de acceptor kleurstof waarvan de fluorescentie verandert kleur (zie figuur 1). Dit maakt een meer betrouwbare uitlezing en verschaft daardoor een krachtig hulpmiddel voor fluorescentie beeldvorming probes. Etikettering van oligonucleotiden met fluorescerende kleurstoffen kan worden bereikt door twee verschillende benaderingen. Kleurstoffen kunnen tijdens de chemische DNA synthese worden opgericht op een vaste fase met overeenkomstige gemodificeerde fosforamidiet bouwblokken. 7 Deze werkwijze is beperkt tot kleurstoffen die stabiel onder standaard fosforamidiet en deprotectie omstandigheden. Als alternatief werden post-synthetische modificatie methoden vastgesteld oligonucleotide chemie. Hier tonen we de synthese van een van onze nieuwe foto'stabel energieoverdracht paren 8,9 en de post-synthetische labeling van DNA door het gebruik van koper-gekatalyseerde 1,3-cycloadditie tussen aziden en alkynen (CuAAC). 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Verscheidene van de chemicaliën die in deze syntheses zijn toxisch en carcinogeen. Gebruik alle nodige veiligheidsvoorschriften die doorgaans in de organische chemie laboratoria, zoals het dragen van een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen zijn vereist.
1. Synthese van de kleurstoffen
Opmerking: Beide kleurstoffen kunnen worden gesynthetiseerd door dezelfde soorten reacties Figuur 2 toont een overzicht van deze reacties..
- Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-iumjodide (kleurstof 1)
- Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylpyridine-1-iumjodide (Figuur 2A, stap a)
- Oplossen 466 mg 4-picoline en 5,91 g 1,3-diiodopropane in 10 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje en sluit goed door een septumdop.
- Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een roterende verdamper.
- Voeg 20 ml ethylacetaat van de resterende olie en behandelen van het mengsel in een 120 w ultrasoon bad gedurende 3 min.
- Verzamel het gevormde neerslag door filtratie en wassen vijfmaal met ethylacetaat. Droog het vaste product onder vacuüm O / N.
- Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridine-1-ium (Figuur 2A, stap b)
- Oplossen 900 mg 1- (3-joodpropyl) -4-methylpyridine-1-iumjodide in 12 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje, voeg 376 mg natriumazide en lekvrij afsluiten van een septumdop.
- Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
- Voeg 15 ml dichloormethaan aan het residu.
- Filter uit en gooi het verkregen neerslag.
- Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotary verdamper waarbij het product als bruine olie.
- Synthese van 1-methyl-1H-indool-3-carbaldehyde (Figuur 2A, stap c)
- Onder inert gas (argon), los 1,45 g indool-3-carbaldehyde, 1,52 g kaliumcarbonaat en 2,70 g dimethylcarbonaat in 10 ml absolute dimethylformamide in een 50 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler.
- Roer het mengsel bij 130 ° C gedurende 19 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, giet het mengsel op ijs.
- Extraheer de waterige laag driemaal met 150 ml ethylacetaat.
- Combineer de organische lagen, was met water, drogen boven natriumsulfaat en verwijdering van het oplosmiddel bij 50 ° C onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
- Koppeling met 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridine-1-iumjodide (kleurstof 1) (Figuur 2A, stap d)
- Werken onder argon en onder uitsluiting van vocht. Dissolve 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylpyridine-1-ium en 48 mg 1-methyl-1H-indool-3-carbaldehyde in 4 ml ethanol in een 20 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler.
- Voeg 0,07 ml piperidine en verhit tot 80 ° C gedurende 4 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Verzamel het verkregen neerslag door filtratie en was driemaal met diethylether.
- Voeg diethylether aan het supernatant en het verzamelen van het verkregen precipitaat door filtratie. Was driemaal uit met diëthylether.
- Combineer de precipitaten.
- Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylpyridine-1-iumjodide (Figuur 2A, stap a)
- Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-fenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinoline-1-iumjodide (dye 2)
- Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylchinoline-1-iumjodide (figuur 2B, stap a)
- Oplossen 715 mg 4-methyl quinoline en 5,91 g 1,3-diiodopropane in 10 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje en sluit goed door een septumdop.
- Warmtetot 85 ° C gedurende 16 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
- Voeg 20 ml ethylacetaat aan de rest van de olie en behandelen van het mengsel in een 120 w ultrasoon bad gedurende 3 min.
- Verzamel het gevormde neerslag door filtratie en wassen vijfmaal met ethylacetaat. Droog het vaste product onder vacuüm O / N.
- Synthese van 1- (3-azidopropyl) -4-methylchinoline-1-ium (figuur 2B, stap b)
- Oplossen 900 mg 1- (3-joodpropyl) -4-methylchinoline-1-iumjodide in 12 ml acetonitril in 20 ml bovenruimte flesje, voeg 333 mg natriumazide en lekvrij afsluiten van een septumdop.
- Verwarm tot 85 ° C gedurende 16 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens werd het oplosmiddel verwijderd onder verlaagde druk met een rotatieverdamper.
- Voeg 15 ml dichloormethaan aan het residu.
- Filter uit en gooi het verkregen neerslag.
- Verwijder het oplosmiddel under verlaagde druk met een rotatieverdamper om het product als bruine olie.
- Synthese van 1-methyl-2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde (figuur 2B, stap c)
- Onder inert gas (argon), los 1,45 g 2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde, 0,996 g kaliumcarbonaat en 1,77 g dimethylcarbonaat in 10 ml absolute dimethylformamide in een 50 ml rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler.
- Roer het mengsel bij 130 ° C gedurende 19 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur, giet het mengsel op ijs.
- Extraheer de waterige laag driemaal met 150 ml ethylacetaat.
- Combineer de organische lagen, was met water, drogen boven natriumsulfaat en het oplosmiddel verwijderd onder gereduceerde druk gebruikmakend van een roterende verdamper.
- Koppeling met 1- (3-azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe nyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinoline-1-iumjodide (figuur 2B, stap d)
- Werken onder argop en onder uitsluiting van vocht. Los op 90 mg 1- (3-azidopropyl) -4-methylchinoline-1-ium en 59,7 mg 1-methyl-2-fenyl-1H-indool-3-carbaldehyde in 4 ml ethanol in een 20 ml rondbodemkolf uitgerust met terugvloeikoeler.
- Voeg 0,06 ml piperidine en verhit tot 80 ° C gedurende 4 uur.
- Laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Verzamel het verkregen neerslag door filtratie en wassen met diethylether driemaal.
- Voeg diethylether aan het supernatant en het verzamelen van het verkregen precipitaat door filtratie. Was driemaal uit met diëthylether.
- Combineer de precipitaten.
- Synthese van 1- (3-joodpropyl) -4-methylchinoline-1-iumjodide (figuur 2B, stap a)
2. Synthese van de DNA-strengen
Noot: De synthese van de DNA-strengen wordt uitgevoerd volgens de fosforamidiet methode op een vaste fase, zoals beschreven door M. Caruthers 11 op een DNA synthesizer. Het functioneren van de synthesizer wordt getest voordat de synthetische procedure en reagentia worden verlengd wanneernoodzakelijk.
- Prearrangements
- Ontbinding van de in de handel verkrijgbare 2'-O-propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (CU) in 1,2 ml amidiet verdunner (extra droog acetonitrile). Beweeg oplossing in de flacon met een synthesizer flacon en schroef in synthesizer.
- Voer een "lektest" (volgens de instructies van de fabrikant) om ervoor te zorgen dat er geen argon gaslek bestaat. Als de "lektest" faalt, schroef in de flacon strakker.
- Prime De CU-oplossing door het vullen van de buis die wordt aangesloten op de vaste fase synthese kamer.
- Was alle lijnen met acetonitril.
- Synthese van DNA-strengen
- Met de computer verbonden aan de DNA sequentie en koppelingswerkwij voeren de aanwijzingen van protocol van de fabrikant. De koppelingsstap van de CU bouwsteen duurt 168 sec met 7 pulsen (elke puls 16 ui) in vergelijking met 40 sec met 7 pulsen voor een conventioneelfosforamidiet als bouwstenen.
- Monteer de kolom met de CPG (glas met geregelde poriën) als vaste fase die is gemodificeerd met 1 pmol van de eerste basis (DNA-synthese wordt uitgevoerd van 3 'naar 5') in de synthesizer.
- Start de synthese van de DNA synthesizer 11.
- Opwerking van de gesynthetiseerde DNA-strengen
- Droog de kolommen met de gesynthetiseerde DNA strengen onder vacuüm O / N.
- Gebruik een tang om de kolom te openen en laat de CPG in een reactie flacon. Voeg 700 gl geconcentreerde waterige ammoniakoplossing het oligonucleotide deprotecteren en laat de DNA-streng van het CPG.
- Sluit het vat en breng een security deksel op het reactievat om te voorkomen dat barsten, en verhit tot 50 ° C gedurende 18 uur.
- Verwijderen ammoniak door centrifugering onder verminderde druk (100 mbar) bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
- Begin filtratie van CPG: Centrifuge vat bij 11.000 xg for 3 min. Neem supernatant en breng deze in een centrifugale apparaat met een poriegrootte van 0,45 urn. Centrifugeer bij 1000 g gedurende 4 min.
- Ondertussen voeg 300 gl dubbel gedestilleerd water aan het CPG, vortex gedurende 20 seconden en centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 3 min. Breng de bovenstaande in de centrifugale inrichting en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 4 min. Herhaal deze wasprocedure twee keer.
- Verwijder het water uit de gecombineerde waterige oplossingen door centrifugeren bij 0,1 mbar en 25 ° CO / N.
3. "klikken" Procedure
- Voeg 50 gl dubbel gedestilleerd water, 25 ui van een natriumascorbaat-oplossing (0,4 M in water), 34 gl tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ui van het azide (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) en 17 pi van een tetrakis (acetonitrile) koper (I) hexafluorfosfaat oplossing (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) het gevriesdroogde alkyn gemodificeerd DNA monster. Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 1,5 uur.
- Koel af tot RT.
- Voeg 150 ul Na2 EDTA (0,05 M in water) en 450 ul natriumacetaat (0,3 M in water) om de DNA-monster overgebracht in een 10 ml buis.
- Voeg 10 ml ethanol (100%) en laten -32 ° C gedurende 16 uur.
- Centrifuge vat gedurende 15 minuten bij 1000 xg en verwijder supernatant.
- Wassen DNA-pellet met 2 ml koude ethanol (80%).
- Droge pellets onder verlaagde druk.
4. HPLC Zuivering
Opmerking: Voor het scheiden van de DNA-strengen ervoor zorgen dat de HPLC goed werkt, voldoende oplosmiddel beschikbaar is en de kolom is schoon. Spoel kolom met de uitgangsconcentratie van buffer / acetonitril.
- Los de ruwe DNA-pellet in 250 ui dubbel gedestilleerd water en breng een HPLC flesje.
- Begin HPLC run van 45 min met een gradiënt van 0% acetonitril tot 15% acetonitril voor kleurstof 1 en een Gradi ent van 0% acetonitril tot 17% acetonitril voor kleurstof 2. Bewaken van de run door het controleren van 260 nm (DNA absorptie) en 459 nm (kleurstof 1) of 542 nm (kleurstof 2). Verzamel de fracties die de absorptie vertonen in beide golflengtekanalen.
- Controleer de verzamelde fracties voor de juiste massa door MALDI (MALDI) massaspectrometrie met behulp van een matrix die bestaat uit 3-hydroxypicolinezuur (3hPa) en diammoniumhydrogencitrate.
- Bereid de matrix door het mengen van 900 ui van een verzadigde 3-HPA-oplossing in 1: 1-mengsel van acetonitril en water met 100 ui van een diammoniumhydrogencitrate oplossing (100 g / l) in water.
- Pipet 1-2 ul van de DNA-probe op het doel en laat het drogen aan de lucht.
- Voeg 0,2 ul van het 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate matrix om het monster en meng tot kristalliseert.
- Voer MALDI massaspectrometrie.
- Combineer die HPLC-fracties die de juiste massa vertonen.
Opmerking: De concentratie wordt bepaald door meting van de absorptie bij 260 nm met een UV / Vis spectrofotometer, gebaseerd op de extinctiecoëfficiënten (ε 260) van de DNA-basen en de kleurstof.
- Los het DNA in 100-200 gl dubbel gedestilleerd water.
- Breng 1 pl DNA-oplossing op de UV / Vis spectrofotometer.
- Meet de absorptie bij 260 nm. Herhaal dit drie keer.
- Neem de gemiddelde waarde voor de concentratie van de oplossing te berekenen. Voor de berekening van de extinctie-coëfficiënten gebruikt ε 260 nm van de vier natuurlijke basen 12 en ε 260 nm van de gekochte bouwsteen Cu (zogenaamde natuurlijke uridine) 12 op ε 260 nm van de gehele DNA-streng te verkrijgen. Kleurstof 1, gebruik ε = 260nm 10.200 L * mol * -1 cm -1 en kleurstof 2, gebruik ε = 260nm 13.100 L * mol <sup> -1 * cm -1. Bereken de concentratie van de oplossing volgende Lambert-Beers ', ontleend aan het uitsterven coëfficiënten en gemeten absorpties. 13
6. Monstervoorbereiding en Spectroscopie
- Bereiding van de monsters enkele streng
- Bereid afzonderlijk 1 ml 2,5 pM oplossing van elk van de gemodificeerde DNA1 en DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7.
- Voorbereiding van de streng monsters double
- Bereid 1 ml van een oplossing die 2,5 uM en 2,5 uM DNA1 van DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7 in een reactievat.
- Bevestig de deksel met een veiligheidsdop en verhit tot 90 ° C gedurende 10 minuten. Schakel vervolgens het verwarmen en laat afkoelen tot RT O / N.
- absorptiespectroscopie
Opmerking: Om de golflengte van de fluorescentie-spec te bepalentroscopy absorptiespectra worden opgenomen.- Enkele streng metingen
- Neem een blanco meting met alleen 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7.
- Breng de bereide oplossing van DNA1 in een 1 cm kwartsglas cuvet en noteer de absorptie. Corrigeer de meting tegen de lege data. Bepaal de maximale waarde van de kleurstof absorptie.
- Herhaal dit voor DNA2.
- Enkele streng metingen
- fluorescentiespectroscopie
- Enkele streng metingen
- Neem een blanco meting met alleen 200 mM NaCl, 50 mM NaP i-buffer, pH = 7; met de excitatiegolflengte van kleurstof 1.
- Breng de DNA1 oplossing in een 1 cm kwartsglas cuvet.
- Noteer het fluorescentiespectrum.
- Dubbele streng meting
- Breng de dubbele streng oplossing in een kwartsglas cuvet. Noteer het fluorescentiespectrum met de excitatiegolflengte van kleurstof 1.
- Enkele streng metingen
- visualisatie experimenten
Let op: Juiste oogbescherming moet worden gedragen om UV-schade aan de ogen te voorkomen!- Om een beter begrip van wat de opgenomen spectra tonen krijgen, bestralen de cuvettes met handbediende UV-lampen (Figuur 5). Let op de verandering in fluorescentie kleur van de ene naar de dubbelstrengs DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Absorptie en fluorescentie spectra van de enkel- en dubbelstrengs DNA worden als getoond in figuur 4.
De geregistreerde absorptiespectra (figuur 4 rechts) tonen absorptiemaxima λ max bij 465 nm voor enkelstrengs DNA1 (kleurstof 1) en 546 nm voor enkelstrengs DNA2 (kleurstof 2). De gegloeide DNA1_2 (dye dye 1 & 2) toont maxima bij zowel 469 nm en 567 nm. Beide absorptiemaxima vertonen een bathochrome verschuiving, 4 nm kleurstof 1 en 21 nm kleurstof 2. Deze kleine spectroscopische veranderingen zijn het gevolg van interacties tussen de aangeslagen kleurstoffen in een dubbele helix DNA architectuur.
De bijbehorende fluorescentie spectra (figuur 4 links) vertonen maxima λ max bij 537 nm voor enkelstrengs DNA1 (kleurstof 1, excitatie bij 435 nm), bij 607 nm voor alleenstaande-stranded DNA2 (dye 2, excitatie bij 535 nm) en 615 nm voor gegloeid DNA1_2 (dye 1 & 2 verven, excitatie bij 435 nm). DNA1_2 toont alleen de maximale uitstoot van kleurstof 2 hoewel kleurstof 1 selectief opgewekt die bewijst dat de energie-overdracht plaatsvindt efficiënt van kleurstof 1 te verven 2. Dit geeft een emissie contrast ratio van 01:57.
Het verschil tussen enkele en dubbele streng is duidelijk door vergelijking van de emissiekleur van de cuvette tijdens excitatie met een standaard UV-lamp zoals weergegeven in figuur 5.
Figuur 1. basisconcept van een energie-overdracht in het DNA. De donor gemodificeerde DNA-streng (groen) geeft fluorescentie bij 535 nm bij bestraling bij 435 nm. Als het wordt gehybridiseerd met de acceptor-gemodificeerde teller streng (rood) de resulterende dubbele streng shows alleen de rode fluorescentie van de acceptor kleurstof bij 610 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Synthese overzicht kleurstof kleurstof 1 en 2. De synthese van beide cyaninekleurstoffen 1 (A) en 2 (B) wordt uitgevoerd in drie opeenvolgende stappen uitgevoerd. 9 (A) a) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 uur, 94%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 uur, 87%; c) K 2 CO 3, dimethylcarbonaat, DMF, 130 ° C, 19 uur, 89%; d) piperidine, EtOH, 80 ° C, 4 uur, 80%. (B) a) 1,3-diiodopropane, CH3CN, 85 ° C, 16 uur, 49%; b) NaN3, CH3CN, 85 ° C, 16 uur, 93%; c) K 2 CO 3, dimethylcarbonaat, DMF, 130 ° C, 19 uur, 98%; d) piperidine, EtOH, 80 ° C, 4 uur, 44%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Structuur Cu-bouwsteen, kleurstoffen 1 en 2 en sequenties van DNA1 en DNA2. De kleurstoffen 1 en 2 zijn verbonden positie van de ribose de 2 'van een triazool linker binnen de gegeven sequenties van DNA1 en DNA2. 9 klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Fluocerend van enkele en dubbele DNA-strengen (links) en de absorptie van enkele en dubbele DNA-strengen (rechts). Emissie spectra van DNA1 (zwart) aangeslagen bij 464 nm, DNA2 (rood), opgewekt bij 535 nm en 435 nm (roze ), en DNA1_DNA2 hybride (blauw), geëxciteerd bij 435 nm worden getoond. De absorptie spectra van de enkelstrengs DNA1 (zwart), DNA2 (rood), en de gehybridiseerde dubbele streng DNA1_DNA2 (blauw) getoond aan de rechterzijde laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Emissie kleur van het enkelstrengige DNA met donorkleurstof (links) en dubbelstrengs DNA met donor en acceptor kleurstof (rechts) bij excitatie door een UV-lamp. Het beeld van de cuvet met het enkelstrengs DNA1 (left zijde) toont heldere groene fluorescentie, en het beeld van dubbelstrengs DNA1_DNA2 (rechts) toont rode fluorescentie tijdens excitatie door een handheld UV-lamp bij 366 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol toont de volledige procedure te labelen DNA post-synthetisch via CuAAC by-azide gemodificeerde fluorescerende kleurstoffen. Dit omvat de synthese van de kleurstoffen en alkyn-gemodificeerd DNA en de werkwijze voor het merken.
De synthese van de kleurstoffen volgt vier stappen. Alle producten kunnen worden verkregen door een vrij eenvoudige neerslag als gevolg van hun positieve lading en geen tijdrovende kolomchromatografie nodig is. De invoering van het azide functionaliteiten voor de centrale koppeling inkort de synthese van de kleurstoffen vier in plaats van vijf opeenvolgende reactiestappen. De toepassing van 1,3-diiodopropane plaats van 3-joodpropanol voor de alkyleringsstap de appel-reactie en de volgende Finkelstein reacties op de hydroxylgroep om te zetten in de jood functionaliteiten vermeden. Deze veranderingen in vergelijking met de gepubliceerde procedures kunnen we de kleurstoffen synthetiseren grotere schaal en kortere tijdsperioden.
DNA1 wordt gemerkt door kleurstof 1, de donorkleurstof en DNA2 van kleurstof 2, de acceptor kleurstof. Wanneer DNA1 en DNA2 worden gegloeid beide kleurstoffen krijgen in de directe nabijheid. Een efficiënte energie-overdracht wordt waargenomen wanneer kleurstof 1 wordt opgewekt. In principe kan aangeslagen interactie tussen beide kleurstoffen interfereren met een efficiënte energie-overdracht, omdat de laatste proces vereist dat de ontkoppelde en prikkelend kleurstof 1 en ontkoppelde kleurstof 2. Excitatie van de gekoppelde kleurstoffen anders zou fotofysische trajecten initiëren. 14 Onze vorige studies 9,15 gebleken dat de toegepaste 3'-5'-diagonale plaatsing kleurstoffen verschaft de structurele basis voor weinig aangeslagen interacties tussen de kleurstoffen en efficiënte energie-overdracht.
Het hoge rendement van de gebleken energieoverdracht maakt een nauwkeurige fluorescentie aflezing in in vitro en in vivo experimenten. Dit biedt een breed scala aan toepassingen, waaronder de visualisatie van DNA hybridisatie in molecular beacons binding van doelmoleculen in nucleïnezuur gebaseerde aptameren en de visualisatie van de integriteit van kleine interfererende RNA (siRNA) in cellen. De belangrijkste beperking is de eis om beide DNA strengen labelen. In de toekomst willen we ons werk richten op de ontwikkeling van de dubbel gelabelde oligonucleotideprobes met zowel kleurstoffen in een streng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Financiële steun door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), de Research Training Group GRK 2039 (gefinancierd door de DFG) en KIT is dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I.
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
