Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54138
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

Abstract

Регуляторные Т (Т р) клетки, которые выражают Foxp3 как транскрипционный фактор, являются подмножествами CD4 + Т - клеток. Т - клетки играют Reg критическую роль в иммунной толерантности и поддержания гомеостаза путем регуляции иммунного ответа. Основная роль клеток Т рег является подавление пролиферации эффекторных Т (Т эфф) клеток и выработку цитокинов , таких как IFN-gamma, TNF-alpha и IL-2. Было показано , что способность Т Reg клеток к ингибировать функцию Т - клеток эфф усиливается во время хронической инфекции патогеном и развития рака. Для уточнения функции клеток Т рег под покоящихся или воспаленных условиях, разнообразие лабораторных анализов подавления в с помощью мыши или человека Т - клетки REG были изобретены. Основной целью данного исследования является разработка метода для сравнения различий в фенотип и супрессивной функции между отдыхавших и активированные Т регклетки. Для выделения активированные Reg Т - клеток, мышей инфицировали вирусом лимфоцитарного хореоменингита (LCMV) клона 13 (CL13), хроническое напряжение LCMV. Клетки Т рег , выделенные из селезенки LCMV CL13-инфицированных мышей обнаруживалось как активированный фенотип и повышенную активность по сравнению с супрессивной покоящихся клеток Т - Reg , выделенных из нативных мышей. Здесь мы опишем базовый протокол для анализа экс естественных условиях фенотипа , чтобы отличить активированные клетки Т - REG от покоя Т рег клеток. Кроме того, мы опишем протокол для измерения подавляющей активности полностью активированных клеток Т рег.

Introduction

Регуляторные Т (Т р) клетки экспрессируют Forkhead коробки P3 (FOXP3) в качестве фактора транскрипции для их развития и функции 1. Кроме того, клетки Т - Reg выражают различные другие молекулы , такие как CD25 , 2, ген-лимфоцитами активации 3 (LAG-3) 3, индуцированной глюкокортикоидами фактор некроза опухоли рецепторов 4, и цитотоксические Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA-4) 5 на их поверхности, или внутриклеточной области. При хронической инфекции с различными видами патогенов , таких как вирусы, бактерии 6,7 8,9 и паразитов 10-12, или в процессе развития рака 13,14, клетки Т рег дифференцируются в активированных клетках, демонстрируя повышенную функцию подавляющий нацеливание эффекторных CD4 + и CD8 + Т - клеток. Ряд работ предположили , что расширенные и активированные Т - клетки рег способствуют обесцененных RESPONS CD8 + Т - клетоке во друга ретровируса (FV) инфекции 15-17. FV-индуцированных Т рег клетки ингибируют IFN-gamma или экспрессию гранзимом и цитотоксическую реактивность CD8 + Т - клеток 15-17. Кроме того, в модели вирусной инфекции простого герпеса, сообщалось , что истощение клеток CD4 + CD25 + Т рег привело к расширению вирус-специфических CD8 + Т - клеток и повреждения тяжелой ткани за счет инфильтрации immunopathogenic CD4 + Т - клеток 18-20.

Мыши инфицированных хронически штаммом вируса лимфоцитарного хориоменингита клон 13 (LCMV CL13) 21-24 широко используются для характеристики фенотипа и функции эффекторных Т - клеток (Т EFF) и Т - клеток рег при хронической вирусной инфекции. Во время хронической инфекции LCMV, вирус-специфические Т эфф клетки постепенно теряют свою функцию эффекторной и разрядиться T (T л.д.) клетки. С другой стороны, Tрег клетки усиливают их способность подавлять реакцию вирус-специфических Т - клеток 25. Снижение в функционировании емкости ЕФФ Т - клеток можно объяснить несколькими факторами , такими как повышающей регуляции ингибиторных рецепторов на эфф Т - клеток, измененную функцию антиген-представляющих клеток, продукции иммунорегуляторных цитокинов и увеличение частоты или расширенной функции Т рег 26 клетки. Среди факторов , участвующих в подавлении Т - клеток, программируемая гибель клеток белок-1 (ПД-1) -expressing клетки EXH Т и Т - клетки , Reg широко рассматривается в качестве признаков антигена персистенции и ингибирующее среды. Недавно было сообщено о том, что блокада PD-1 и пути абляции клеток Т рег приводить к усилению функции Т - клеток и снижение вирусной нагрузки во время LCMV хронической инфекции 27. Кроме того, клетки Т рег активируются при хронической инфекции мышей с LCMV 23,25 25. PD-1 сильно экспрессируется на Т рег клеток, а также Т - клетки EXH, а уровень PD-1 , выраженное рег Т - клеток коррелирует с силой , подавляющей функции ингибировать пролиферацию Т - клеток на 25.

Здесь мы опишем метод для сравнения характеристик активированных Т - клеток , выделенных из рег мышей , инфицированных LCMV CL13 и клеток покоящихся Т рег , выделенных из наивных мышей. Кроме того, мы объясняем ряд процессов , чтобы отделить активированные клетки Т - REG и проверяет их ех естественных фенотипа, а также измерить их подавляющую активность в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В этом исследовании мышей содержали в определенной патогена объекта животного научно-исследовательского центра Йонсейского Лаборатория Йонсей. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами корейской пищевых продуктов и медикаментов с использованием протоколов, утвержденных Международной уходу и использованию животных комитета научно-исследовательского центра Йонсейского лабораторных животных в Йонсей путем.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 2% RPMI носитель путем разбавления эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) до 2% и пенициллин-стрептомицина до 1% в RPMI
  2. Подготовка полной среды RPMI. Для RPMI СМИ добавляют 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина, 1% L-глутамина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола.
  3. Подготовить флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS) буфер. Для этого, добавка забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с 2% FBS.
  4. Приготовьте T буфер выделения клеток. Для этого дополнения PBS с 2% FBS и 2 мМ ethylenediaminetetraacetic кислоты.

2. Выделение лимфоцитов селезенки

  1. Удалить селезенке из наивных или LCMV CL13-инфицированных мышей , как описано выше 19 и поместить их в 60 мм х 15 мм чашки Петри , содержащие 10 мл 2% RPMI СМИ.
    Примечание: В данном исследовании экспериментов, от 5 до 6 - недельного возраста C57B1L / 6J самок мышей получали 2 × 10 6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) из LCMV CL13 через внутривенные инъекции через хвостовую вену. Жертвоприношение мышей на 16 день после инфицирования (16 d Pi) 25. Анализ GE-совпадающая наивные мыши были в тот же день.
  2. Поместите клеточный фильтр в 50 мл пробирку и промыть его с 2 мл 2% RPMI сред. Поместите селезенку на клеточный фильтр 70 мкм и растереть, используя поршень шприца. Промыть фильтр грубой очистки клеток с 2 мл 2% RPMI СМИ и удалить его из 50 мл трубки.
  3. Заполните трубку с помощью 2% RPMI сред и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируютОсадок клеток в 1 мл ACK лизирующего буфера. Инкубируйте образцы при комнатной температуре (КТ) в течение 5 мин.
    Примечание: Объем ACK лизирующего буфера было указано выше для одного селезенки. Расширить объем соответственно для объединенных пробах селезенки.
  4. Заполните трубку с помощью 2% RPMI сред и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют при плотности 1 х 10 7 клеток / мл в полной среды RPMI.
    Примечание: Для подсчета живых клеток, пятно клеток с трипановым синим и рассчитывать только живые клетки, которые не окрашивали с использованием гемоцитометра.

3. Фенотипирование селезеночной обычных Т (Т конв) клетки и Т - клеток рег

Примечание: Перед изоляции Т рег клеток, исследовать фенотип лимфоцитов селезенки , выделенных из нативных или инфицированных мышей путем окрашивания клеток с различными антителами и анализировать их с помощью проточной цитометрии.

  1. Передача 50 мкл клеток(5 х 10 5 клеток) среди общего количества лимфоцитов селезенки в каждую лунку нового U-дном 96-луночного планшета и добавляют 150 мкл буфера FACS в каждую лунку. Центрифуга при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  2. Удалите супернатант. Перемешайте осадок клеток и добавляют 200 мкл буфера FACS в каждую лунку. Центрифуга при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С (2 раза).
  3. Готовят смесь антител для окрашивания маркеров клеточной поверхности в 50 мкл буфера FACS на лунку со следующими антителами и реагентами. Анти-CD4 фиолетовый краситель, анти-CD25-зеленый краситель, анти-PD-1-фиолетовый краситель, анти-CD8 PerCP-Cy5.5 реагент обнаружения жизнеспособность красителя и клеток в ближней инфракрасной (ИК) люминесцентная реактивный краситель.
    Примечание: Для дальнейшего анализа фенотип активированных Т - клеток рег, анти-CD103 23,25 могут быть добавлены для клеточной поверхности габаритного окрашивания.
  4. Ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл коктейля антител на лунку. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Вымойте клетки дваждыFACS-буфер путем центрифугирования при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  5. После заключительной стадии промывки, сливают надосадочную жидкость и фиксации клеток в течение 20 мин в темноте при 4 ° С со 100 мкл буфера для фиксации, полученных в соответствии с протоколом производителя.
  6. Вымойте клетки дважды с пермеабилизации промывочного буфера (полученного в соответствии с протоколом производителя) центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С.
  7. Готовят раствор антител к внутриклеточным Foxp3 окрашивания, и ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл раствора антител против Foxp3.
    Примечание: Для дальнейшего анализа фенотипы Т конв и Т - клеток Reg, анти-CTLA могут быть добавлены на данном этапе.
  8. Инкубировать в течение 20 минут в темноте при 4 ° С и повторите шаг 3.6. После заключительной стадии промывки, ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл буфера FACS и исследовать фенотип клеток с помощью проточной цитометрии 25.
  9. Ворота клетка насе живойции. Для анализа фенотипов T CONV клеток во время LCMV CL13 инфекции, изучить частоту Foxp3 - PD-1 + клеток среди CD4 + или CD8 + Т - клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент Foxp3 - PD-1 + более чем на 50% в популяции как CD4 + и CD8 + Т - клеток в 16 г пи с LCMV CL13.
    1. Для анализа частоты и фенотипы клеток Т рег, исследовать частоты Foxp3 + или Foxp3 + PD-1 + клеток среди CD4 + Т - клеток.
      Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент Foxp3 + или + PD-1 + клеток Foxp3 составляет более 20% в популяции CD4 + Т - клеток, соответственно.

4. Выделение клеток рег CD4 + CD25 + Т

Примечание: Объемы всех реагентов указаны ниже длястартовый номер ячейки 1 х 10 7 общих спленоцитов.

  1. Подготовьте клетки, как описано в разделе 2, используя наивные и LCMV хронически инфицированных мышей. Промывают клетки путем добавления 10 мл Т буфера выделения клеток. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант полностью и ресуспендируют осадок клеток в 40 мкл буфера.
  2. Для обогащения CD4 + Т - клеток с использованием системы магнитного разделения клеток, добавляют 10 мкл биотин-антитело коктейлем и хорошо перемешать. Инкубировать в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  3. Добавьте 30 мкл буфера 20 мкл анти-биотин микро шарики для маркировки не-CD4 + Т - клеток и 10 мкл CD25-PE антитела для флуоресцентного мечения CD25 + клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин в темноте.
  4. Добавляют 2 мл буфера и передать клетки через 40 мкм клеточный фильтр с в новый 50 мл трубку для удаления остатков клеток. Промыть клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° C.Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера при плотности до 1,25 х 10 8 клеток.
  5. Применение клеток на колонку и собирают немеченых клеток, которые проходят через колонку. Промывают колонку добавлением 2 мл буфера и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендирования изолированных CD4 + Т - клеток в 90 мкл буфера.
  6. Для магнитной маркировки CD25 + клеток, добавляют 10 мкл анти-PE микрошариков, хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С.
  7. Добавляют 2 мл буфера и промыть клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера при плотности до 1 х 10 8 клеток.
  8. Для того, чтобы обогатить клетки CD4 + CD25 + Т рег, нанесите клетки на колонку для положительного отбора, и мыть Columп добавлением 2 мл буфера. Повторите для стирки три раза.
  9. Когда колонна пуст после последней стадии промывки, добавляют 1 мл буфера на колонку, и вымывать магнитно помечены CD4 + CD25 + клеток , используя поршень.
  10. Повторите шаги 4,8-4,9 для повышения чистоты выделенных клеток CD4 + CD25 + Т рег. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют изолированных клеток CD4 + CD25 + Т - Reg в концентрации 2 х 10 6 клеток / мл в полной среды RPMI.
  11. Чтобы проверить чистоту клеток изолированной CD4 + CD25 + Т рег, с помощью 2 х 10 5 клеток от общего числа клеток , изолированных-CD4 + CD25 + Т рег. Пятно клеток с 50 мкл буфера FACS, содержащего анти-CD4 FITC и жизнеспособность клеток обнаружения реагента ближней ИК флуоресцентного реакционноспособного красителя.
    Примечание: CD25 уже метят PE во время изоляции.
  12. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После промывки, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера FACS и проверить чистоту с помощью проточной цитометрии.
  13. Ворота население живых клеток. Для анализа чистоты клеток Т - Reg, подтверждают , процент CD4 + CD25 + клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент CD4 + CD25 + клеток среди очищенных клеток составляет более 80%.

5. Выделение CD8 + Т - клеток и этикетирование CD8 + Т - клеток

Примечание: Объемы всех реагентов указаны ниже для исходного числа клеток 1 × 10 7 спленоцитов общего.

  1. Приготовьте клетки, как описано в разделе 2 с помощью наивных мышей. Вымойте клеток путем добавления 10 мл изоляции Т-клеток нагишомэ. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант полностью, и ресуспендируют осадок клеток в 40 мкл буфера.
  2. Для выделения CD8 + Т - клеток с использованием системы магнитного разделения клеток, добавляют 10 мкл биотин-антитело коктейль для маркировки не-CD8 + Т - клеток и хорошо перемешать. Выдержите в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  3. Добавьте 30 мкл буфера и 20 мкл анти-биотин микрогранул. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° C.
  4. Применение клеток на колонку и собирают немеченых клеток, которые проходят через колонку. Промывают колонку добавлением 2 мл буфера, в три раза.
  5. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают полностью и ресуспендирования изолированных CD8 + Т - клеток в 2 мл буфера.
  6. Для проверки чистоты выделенных клеток, готовят 50 мкл раствора антител в буфере FACS. Ресуспендируют 2 х 10 5 клеток среди изолированных CD8 + Т - CELLs в 50 мкл раствора антител.
    Примечание: Для приготовления раствора антител, добавить анти-CD8 FITC, и реагент обнаружения жизнеспособность клеток (ближней ИК люминесцентная активный краситель) в буфер FACS.
  7. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С. Промывают клетки с буфером FACS центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После промывки, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл буфера FACS и проверить чистоту клеток с помощью проточной цитометрии.
  8. Ворота население живых клеток. Для проверки чистоты CD8 + Т - клеток, подтверждают , процент CD8 + Т - клеток.
    Примечание: На основании экспериментальных результатов, процент CD8 + клеток среди очищенных клеток составляет более примерно 90%.
  9. Добавить PBS к изолированным CD8 + Т - клеток. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют Выделенную CD8 + Т - клеток в концентрации 1 × 10 7 клеток / мл в PBS.
  10. Для того, чтобы пометить CD8 + T CELLS для анализа подавления в пробирке, разбавленные пролиферации клеток трекинга краситель в фиолетовую PBS с получением концентрации 5 мкМ при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительные возбуждения и эмиссии пики пролиферации клеток отслеживания фиолетового красителя, используемого в исследовании, 405 и 450 нм соответственно.
  11. Хорошо перемешайте равные объемы клеточной пролиферации трекинга фиолетовой красителем (5 мкМ) и суспензию клеток (1 × 10 7 клеток / мл CD8 + Т - клеток) в 15 мл пробирку, и инкубируют при 20 мин при 37 ° С. Вихре трубку каждые 10 мин.
  12. Заполните трубу с холодной полной RPMI СМИ, и оставить трубку в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают полностью, и клетки вновь суспендируют при концентрации 2 х 10 6 клеток / мл с предварительно нагреты полной среды RPMI. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.

6. Настройка In Vitro Подавление Пробирной Использование CD4 + CD25 + T <к югу> р и CD8 + Т - клеток

  1. Для подготовки анти-CD3 / CD28 покрытием шарики, передают соответствующий объем магнитных шариков до 15 мл трубки (2,5 мкл / 1 × 10 5 клеток). Добавить равный объем PBS и перемешать. Промыть центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С и отбросить супернатант. Развести магнитных шариков в полной среде (50 мкл / лунку).
  2. Алиготе 50 мкл клеток CD4 + CD25 + Т рег на лунку U-дно 96-луночного планшета (1 х 10 5 клеток / лунку). Добавляют 50 мкл CD8 + Т - клеток в качестве иммунокомпетентных Т (Т соответственно) клеток на лунку (1 × 10 5 клеток / лунку). Добавляют 50 мкл разведенной анти-CD3 / CD28 бусин покрытием в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге этикетки и установить контрольные лунки следующим образом : "только не стимулированных CD8 + Т - клеток" без анти-CD3 / CD28 бисером покрытием; "Только CD8 + Т - клеток" анти-CD3 / CD28-покрытием бусин; Только "CD8 + Т - клеток"Анти-CD3 / CD28-покрытием бусин;". Т рег Клеточные только "анти-CD3 / CD28-покрытием бусин клетки Т - рег может быть разбавлен полной среды и культивировали совместно с Т соотв клеток в различном соотношении Т RESP клетки: Т рег - клетки (1: 0,25-1: 1).
  3. Добавьте 50 мкл или соответствующий объем носителя во все лунки до общего объема 200 мкл. Закройте планшет фольгой и инкубировать в СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 72 ч.

7. Анализ CD8 + Т - клеточной пролиферации и продукции цитокинов из CD8 + Т - клеток

  1. Для анализа продукции цитокинов, после 3-х дней культивирования отделяют супернатант каждой лунки в другую тарелку и выполнять твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
    Примечание: Супернатант может быть аликвоты и хранили при -70 ° С. В этом эксперименте, анти-мышиного IFN-γ пластины покрытых антителами использовали для обнаружения IFN-gamma производства согласияING с протоколом производителя. Для того, чтобы определить , производство IFN-gamma пролиферирующих CD8 + Т - клеток на уровне одной клетки, внутриклеточное окрашивание цитокинов может быть выполнена.
  2. После того, как отделение надосадочной жидкости из каждой лунки, промойте пластину, содержащую клетки с FACS буфера и центрифуге при 300 мкг в течение 2 мин при температуре 4 ° С (3 раза).
  3. После промывки отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток с 50 мкл коктейля для антител окрашивания пролиферирующих CD8 + Т - клеток. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при температуре 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления коктейля антител, добавить анти-CD4 FITC, анти-CD8 PerCP-Cy5.5, и реагент обнаружения жизнеспособность клеток (ближней ИК люминесцентная активный краситель) в буфер FACS.
    Примечание: Антитела против различных маркеров , таких как CD44 или CD69 можно комбинировать с другими антителами , чтобы подтвердить активацию CD8 + Т - клеток. Следует помнить , что CD8 + Т - клетки уже были помечены пролиферации клеток отслеживания Violet красителя на шаге 5.10.
  4. Промыть два раза центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. После заключительной стадии промывки, отбросить супернатант, и зафиксировать клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° С со 100 мкл буфера для фиксации.
  5. Промыть два раза центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клеток с 200 мкл буфера FACS и измеряют пролиферацию клеточной пролиферации трекинга фиолетовых красителя меченных CD8 + Т - клеток с помощью проточной цитометрии.
    1. Ворота популяция CD8 + Т - клеток среди живых клеток. Измерить процентное содержание разделенных и неразделенных клеток в соответствии с разбавлением клеточной пролиферации трекинга фиолетового красителя и клеточного разведения CD8 + Т -в соответствии со следующим уравнением. % Ингибирования = [(% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток в отсутствие клеток Т - REG -% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток в присутствии Т рег клеток) / (% от пролиферирующих CD8 + Т - клеток вотсутствие Т рег клеток)] х 100. Далее анализ данных с помощью проточной цитометрии программного обеспечения 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы получили мышей с персистирующей вирусной инфекцией, вводя их с 2 х 10 6 БОЕ LCMV CL13 внутривенно. Для того, чтобы исследовать фенотипические изменения в клетках рег Т и Т Conv ​​клеток при хронической вирусной инфекции, лимфоцитов селезенки , полученные от наивных и зараженных мышей окрашивали различными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии. На 16 - й пи, PD-1 в обоих повышающей регуляции Foxp3 - CD4 + Т - конв (рис 1А, верхняя панель) и Foxp3 - CD8 + Т конв (рис 1B, верхняя панель) клеток. Частота клеток Foxp3 + CD4 + Т рег был в LCMV CL13-инфицированных мышей в два раза выше , чем у нативных мышей (рис 1А). В частности, большинство клеток рег CD4 + T + Foxp3 отображается активированный фенотип, экспрессирующие высокие уровниPD-1 в этот момент времени (Рис . 1А)

Для анализа подавления в пробирке, требовалось значительное количество клеток CONV CD8 + Т - клеток и CD4 + CD25 + Т рег. Для получения 1 х 10 7 клеток отслеживания пролиферации фиолетовых красителя меченных CD8 + Т - клеток, были объединены спленоциты от двух селезенке наивных мышей. Для получения 2 х 10 6 или 3 × 10 6 клеток CD4 + CD25 + Т рег, по крайней мере три селезенку от наивных и LCMV CL13-инфицированных мышей, соответственно, были объединены. CD8 + Т - клетки , как клетки Т соотв были успешно разделены без значительного загрязнения другими иммунными клетками (фиг.2А). Клетки Т - рег также могут быть выделены, с доминирующей популяции CD25 + CD4 + Т - клеток с более чем 80% чистоты (Фигура 2В).

Для сравнения функции подавляющий наивных и хронических Т рег клеток, изолированный Т р и Т - клетки RESP инкубировали вместе при стимуляции с анти-CD3 / CD28 покрытием шариков при 37 ° С в течение 3 -х дней. % Ингибирование пролиферации CD8 + Т - клеток , соответственно была увеличена в Т рег клетки деше-зависимым образом (фиг 3A). Когда клетки CD8 + Т - RESP совместно культивировали с хроническим Т рег клеток в соотношении 1: 1, пролиферацию клеток , CD8 + Т - соотв были значительно ингибировали (фигура 3В). Производство IFN-γ клетками CD8 + Т соотв также были значительно ингибируется , когда клетки CD8 + Т - RESP совместно культивировали с активированными Т - клетками от рег хронически инфицированных мышей , а не с покоя Reg Т - клеток от мышей в наивным Т рег (рис 3C).

Рисунок 1
Рисунок 1: фенотипы CD4 + и CD8 + Т - клеток в селезенке наивных мышей или LCMV CL13-инфицированных мышей через 16 д пи (A) Экспрессия PD-1 или CD25 на Foxp3 - CD4 + Т - конв и Foxp3 + CD4 + клетки Т рег. (B) Выражение PD-1 или CD25 на Foxp3 - конв клетки CD8 + Т. Лимфоцитов селезенки окрашивали антителами против CD4, CD8, CD25, PD-1 и Foxp3. Данные представляют из трех независимых экспериментов. Панель А было изменено с 25 в качестве ссылки. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: чистота Т - клеток , выделенных из соотв наивных мышей и Т - клеток , выделенных из рег наивных или LCMV CL13-инфицированных мышей (А) процент CD8 + Т - клеток после выделения.. (B) Процент CD25-экспрессирующих клеток CD4 + Т рег после выделения. Каждый квадрант в (В) определяли уровни экспрессии CD4 и CD25. Данные являются репрезентативными из трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ле / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Влияние активированных Т рег клеток на ответ CD8 + Т - клеток (А)% ингибирования CD8 + Т - клеток культивировали совместно с Т рег клеток в зависимости от дозы Т рег клеток.. (Б) Пролиферация CD8 + Т - клеток культивировали совместно с регистрационным Т - клеток в соотношении 1: 1. (C) , ИФН-γ производство CD8 + Т - клеток культивировали совместно с Т рег клеток в зависимости от дозы Т рег клеток. Пролиферация CD8 + Т - клеток измеряли путем разбавления клеточной пролиферации трекинга фиолетового красителя в пролиферирующих CD8 + Т - клеток и секрецию IFN-gamma оценивали с помощью ELISA. Клеточной пролиферации трекинга фиолетового меченных CD8 + Т - клетки стимулировали анти-CD3 / CD28 бисером покрытием в течение 3 -х дней в отсутствие или в присутствии Т + Т - клеток культивировали совместно с и без Т рег клеток, соответственно. Заполненные серые пики в гистограмме указывают на пролиферацию CD8 + Т - клеток культивировали совместно без Т рег клеток. Каждая группа была разработана в трех экземплярах. Столбики представляют среднее + SEM. Эта цифра была изменена с 25 в качестве ссылки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на то, лишь небольшое число клеток Т - рег существуют у мышей и человека, важно , чтобы понять их функцию , поскольку они играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и поддержания иммунной толерантности. Номерные и подавляющие функции Т рег клеток увеличивается во время хронической вирусной инфекции 15-20, а также прогрессирования рака 13,14. Это, вероятно, из-за продолжающейся стимуляции антигеном. Для оценки Т рег клетки функционировать при антигенной настойчивостью и развития болезни, их подавляющих активность должна быть измерена.

Здесь мы опишем протокол для анализа ех естественных условиях фенотип клеток Т рег и измерить их подавляющую активность , используя систему совместного культивирования в пробирке CD8 + Т - клеток и Т - клеток рег. Критические шаги в текущем протоколе являются анализ и выделение Т рег клеток. Живые и свежевыделенные T в пробирке. Мы также исследовали фенотипы Т конв и Т - клеток рег во время хронической вирусной инфекции. Конв клетки Т, т.е. FOXP3 - CD4 + и CD8 + Т - клетки показали снижение активности клеток после хронической вирусной инфекции (Рисунок 1). Выражение PD-1 усиливает свою активность в обеих популяциях T CONV клеток. Увеличение числа Т рег клеток и повышающей регуляции ПД-1 экспрессии являются отличительными чертами иммунного ответа при хронической вирусной инфекции. Кроме того, анти-тела для других ингибирующих рецепторов, таких как ТИМ-3 и CTLA-4 могут быть использованы в комбинации с PD-1, чтобы исследовать фенотип Т-клеток путем FACS после choric вирусной инфекции.

Для того чтобы исследовать подавляющий активность, клетки RESP Т и Т - клетки рег совместно культивировали в соотношении 1 к 1. Co-культуры с Т регКлетки из хронически инфицированных мышей значительно уменьшается пролиферацию клеток CD8 + и IFN-gamma секреции, по сравнению с клетками Т рег от наивных мышей. Это означает , что производство и распространение цитокин CD8 + Т - клеток культивировали совместно с Т рег клеток обратно пропорциональны функции подавляющих клеток Т рег. Хотя этот протокол рекомендует использовать системы магнитной сепарации клеток для выделения клеток Т рег, загрязнение с регистрационным нелитиевыми-T не может быть исключена. Т - клетки , полученные Reg из Foxp3-GFP мышей репортер 28-30 являются лучшими кандидатами для точного исследования функции Т рег клеток , чем системы магнитной сепарации клеток, а CD25 , часто избыточно экспрессируется на активированных клетках Т рег CD4 + T CONV, а также.

Функция подавляющих клеток Т рег оценивали различные в пробиркеподавление анализы 16,28,31-34. Преимущество в пробирке подавления анализа является то , что он оценивает прямое действие Т - клеток регистрационная ингибирование реакции CD8 + Т - клеток, так как только клетки , Т - RESP являются совместно культивировали с Т рег клеток. В дополнение к CD8 + Т - клеток, то к CD25 - CD4 + Т - клетки могут быть использованы вместо клеток 25 соотв Т. Эффекты Т рег или Т - клеток CONV на иммунные клетки , такие как дендритные клетки или естественных клеток - киллеров может быть оценена путем изменения условий эксперимента.

Молекулы , такие как CD103 35, LAG-3 36, гликопротеина A повторы преобладающими 37, CD43 38, CD11a 38, или клеток - киллеров лектин-подобный рецептор подсемейства G элемент 1 38 были использованы в качестве маркеров активированных клеток Т рег в конкретных заболеваний. В этом протоколе, мы использовали PD-1 в качествеИндикатор для идентификации активированных клеток Т - REG при хронической вирусной инфекции. Этот протокол может быть использован для многогранных анализа (фенотипических и функциональных) РЭГ Т - клеток в конкретных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Tags

Immunology выпуск 112 подавляющий функции, регуляторные Т-клетки CD8 хронические инфекции лимфобластный хореоменингита вирус
Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J.… More

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter