Abstract
Regulatoriska T (T reg) celler, vilka uttrycker Foxp3 som en transkriptionsfaktor, är undergrupper av CD4 + T-celler. T reg celler spelar avgörande roller i immuntolerans och homeostas underhåll genom att reglera immunsvaret. Den primära rollen av T-reg-celler är att undertrycka proliferationen av effektor-T (T eff) celler och produktionen av cytokiner såsom IFN-γ, TNF-α, och IL-2. Det har visats att T reg cellernas förmåga att inhibera funktionen av T-eff celler förstärks under ihållande patogen infektion och utveckling av cancer. För att förtydliga funktionen av T-reg celler under vila eller inflammerade villkor, ett flertal in vitro-undertrycknings analyser med användning av mus eller humant T reg-celler har uppfunnits. Huvudsyftet med denna studie är att utveckla en metod för att jämföra skillnaderna i fenotyp och undertryckande funktion mellan vilande och aktiverade T regceller. För att isolera aktiverade T-reg-celler, möss infekterade med lymfocytär koriomeningitvirus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stam av LCMV. T reg-celler isolerade från mjälten hos LCMV CL13-infekterade möss uppvisade både den aktiverade fenotypen och förbättrad suppressiv aktivitet jämfört med vilande T reg celler som isolerats från naiva möss. Här beskriver vi den grundläggande protokollet för ex vivo fenotyp analys att skilja aktiverade T-reg-celler från vilande T reg-celler. Dessutom beskriver vi ett protokoll för mätning av den undertryckande aktiviteten hos helt aktiverade T-reg-celler.
Introduction
Regulatoriska T (T reg) celler uttrycker forkhead box P3 (Foxp3) som en transkriptionsfaktor för deras utveckling och funktion 1. Dessutom T reg-celler uttrycker olika andra molekyler såsom CD25 2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) 3, glukokortikoid-inducerad tumömekrosfaktor-receptor 4, och cytotoxisk T-lymfocyt-associerat protein 4 (CTLA-4) 5 på sin yta eller intracellulära regionen. Under kronisk infektion med olika typer av patogener, såsom virus 6,7, bakterier 8,9 och parasiter 10-12, eller i samband med cancerutveckling 13,14, blir T reg-celler differentieras till aktiverade celler, visar förbättrad undertryckande funktion inriktnings effektor CD4 + och CD8 + T-celler. Ett antal artiklar har föreslagit att expanderade och aktiverade T-reg-celler bidrar till osäkra CD8 + T-cells response under vän retrovirus (FV) infektion 15-17. FV-inducerade T reg-celler inhiberar IFN-γ eller granzym B-uttryck och cytotoxiska reaktivitet av CD8 + T-celler 15-17. Dessutom i ett herpes simplex-virus infektionsmodell, rapporterades det att utarmning av CD4 + CD25 + T-reg-celler resulterade i expansion av virusspecifika CD8 + T-celler och allvarlig vävnadsskada genom infiltrering av immunopathogenic CD4 + T-celler 18-20.
Möss infekterade kroniskt med klon 13-stammen av lymfocytisk koriomeningitvirus (LCMV CL13) 21-24 har ofta använts för att karakterisera fenotypen och funktionen av effektor-T-celler (T eff) och T reg-celler under kronisk virusinfektion. Under ihållande LCMV infektion, virus-specifika T eff celler förlorar gradvis sin effektorfunktion och blir utmattad T (T exh) celler. Å andra sidan, Treg-celler förstärker deras förmåga att undertrycka virusspecifikt T-cellsvar 25. Minskningen i den fungerande kapacitet av T eff celler kan förklaras av flera faktorer, såsom uppreglering av hämmande receptorer på T eff celler, förändrad funktion av antigenpresenterande celler, produktion av immunregulatoriska cytokiner, och ökad frekvens eller ökad funktion av T-reg celler 26. Bland de faktorer som är involverade i T-cellundertryckning, programmerad celldöd protein-1 (PD-1) uttryckande T EXH celler och T-reg-celler har allmänt betraktas som kännetecken av antigen uthållighet och undertryckande miljö. Nyligen rapporterades det att blockaden av PD-1 vägen och ablation av T-reg-celler leder till förbättrad funktion T-cell och minskad virusbelastning under LCMV kronisk infektion 27. Vidare är T reg-celler aktiveras under kronisk infektion av möss med LCMV 23,25 25. PD-1 uttrycks kraftigt på T reg-celler såväl som T EXH celler, och nivån på PD-1 uttrycks av T reg-celler korrelerar med styrkan av sin suppressiva funktionen att inhibera T-cellsproliferation 25.
Här beskriver vi en metod för att jämföra egenskaperna hos aktiverade T-reg-celler som isolerats från möss infekterade med LCMV CL13 och vilande T reg celler som isolerats från naiva möss. Dessutom förklarar vi en rad processer för att separera aktiverade T-reg-celler och undersöka deras ex vivo fenotyp, samt mäta deras undertryckande aktivitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denna studie gavs möss hölls i en specifik patogen-fri anläggning av Yonsei Laboratory Animal Research Center av Yonsei University. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de riktlinjer som koreanska Food and Drug Administration med hjälp av protokoll som godkänts av International Animal Care och användning kommitté Yonsei Laboratory Animal Research Center vid Yonsei University.
1. Beredning av lösningar
- Förbereda 2% RPMI medier genom att späda fetalt bovint serum (FBS) till 2% och penicillin-streptomycin till 1% i RPMI
- Förbered komplett RPMI-medium. Till RPMI-medium tillsätt 10% av FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamin och 50 | aM 2-merkaptoetanol.
- Förbereda fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) buffert. För att göra detta, komplettera fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2% FBS.
- Förbereda T-cellisoleringsbuffert. För att göra detta, komplettera PBS med 2% FBS och 2 mM ethylenediaminetetraacetic syra.
2. Isolering av mjältlymfocyter
- Ta bort mjälten från naiva eller LCMV CL13-infekterade möss som beskrivits tidigare 19 och placera dem i 60 mm x 15 mm petriskålar innehållande 10 ml av 2% RPMI-medium.
OBS: I denna studie experiment, 5 till 6 veckor gamla C57B1L / 6J honmöss erhöll 2 x 10 6 plackbildande enheter (pfu) av LCMV CL13 genom intravenös injektion via svansvenen. Offra möss vid dag 16 efter infektion (16 d pi) 25. Analysera ge matchade naiva möss på samma dag. - Placera en cellfilter in i ett 50 ml rör och skölj den med 2 ml 2% RPMI-medium. Placera mjälten på 70 | im cellfilter och mala med hjälp av kolven i en spruta. Skölj cell sil med 2 ml 2% RPMI-medium och ta bort den från 50 ml rör.
- Fyll röret med 2% RPMI-medium och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och resuspenderacellpelleten i 1 ml ACK lyserings-buffert. Inkubera proverna vid rumstemperatur (RT) under 5 min.
OBS: Volymen av ACK lyseringsbuffert som anges ovan är för en mjälte. Skala upp volymen följaktligen för samlings mjälte prover. - Fyll röret med 2% RPMI-medium och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna vid en densitet av 1 x 10 7 celler / ml i komplett RPMI-medium.
OBS: För levande cellräkning, fläck celler med trypanblått och räkna endast levande celler som inte färgas med hemocytometer.
3. fenotypning av mjälten Konventionell T (T conv) celler och T reg-celler
OBS! Innan T reg cellisolering, undersöka fenotypen av mjältlymfocyter isolerade från naiva eller infekterade möss genom färgning av cellerna med olika antikroppar och analysera dem genom flödescytometri.
- Överföra 50 | il av cellerna(5 x 10 5 celler) bland totala mjältlymfocyter in i varje brunn av en ny U-bottnad 96-brunnsplatta och lägga 150 | il FACS-buffert per brunn. Centrifugera vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten. Agitera cellpelleten och tillsätt 200 | il FACS-buffert per brunn. Centrifugera vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C (2 gånger).
- Förbered antikropp cocktail för färgning cellytmarkörer i 50 | il FACS-buffert per brunn med följande antikroppar och reagens. Anti-CD4-violett färg, anti-CD25 grönt färgämne, anti-PD-1 violett färg, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 färgämne och cellviabiliteten detektionsreagens nära infraröda (IR) fluorescerande reaktivt färgämne.
OBS: För att ytterligare analysera fenotypen av aktiverade T-reg-celler, kan anti-CD103 23,25 läggas till för cellytan markerings färgning. - Resuspendera cellpelleten med 50 pl antikropps cocktail per brunn. Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C. Tvätta cellerna två gånger medFACS-buffert genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- Efter den sista tvättsteget, dekantera supernatanten och fixera cellerna under 20 min i mörker vid 4 ° C med 100 pl av fixeringsbuffert framställda enligt tillverkarens protokoll.
- Tvätta cellerna två gånger med permeabilization tvättbuffert (framställd enligt tillverkarens protokoll) genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- Bered antikroppslösningen för intracellulär Foxp3 färgning och resuspendera cellpelleten med 50 pl anti-Foxp3 antikroppslösningen.
OBS: För att ytterligare analysera fenotyper av T omv och T-reg-celler, anti-CTLA kan tillsättas vid detta steg. - Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C och upprepa steg 3,6. Efter den sista tvättsteget, resuspendera cellpelleten i 200 | il FACS-buffert och undersöka fenotypen hos cellerna genom flödescytometern 25.
- Grind den levande cell population. Att analysera fenotyper av T CONV celler under LCMV CL13 infektion, undersöka frekvensen av Foxp3 - PD-1 + celler bland CD4 + eller CD8 + T-celler.
OBS: Baserat på experimentella resultat, den procentuella andelen av Foxp3 - är PD-1 + mer än 50% i både CD4 + och CD8 + T-cellpopulationer vid 16 d pi med LCMV CL13.- För att analysera frekvensen och fenotyper av T-reg-celler, undersöka frekvenserna av Foxp3 + eller Foxp3 + PD-1 + -celler bland CD4 + T-celler.
OBS: Baserat på experimentella resultat, är andelen Foxp3 + eller foxp3 + PD-1 + celler mer än 20% i CD4 + T-cellpopulation, respektive.
- För att analysera frekvensen och fenotyper av T-reg-celler, undersöka frekvenserna av Foxp3 + eller Foxp3 + PD-1 + -celler bland CD4 + T-celler.
4. Isolering av CD4 + CD25 + T-reg-celler
OBS: Volymerna av alla reagenser som anges nedan är för enbörjar mobilnummer av 1 x 10 7 totalt splenocyter.
- Förbered celler som beskrivs i avsnitt 2 med naiva och LCMV kroniskt infekterade möss. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml av T-cellisoleringsbuffert. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt och resuspendera cellpelleten i 40 pl buffert.
- För CD4 + T-celler berikning med magnetcellseparationssystemet, tillsätt 10 pl biotin-antikropp cocktail och blanda väl. Inkubera i 10 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 30 | il buffert, 20 | il av anti-biotin mikropärlor för märkning av icke-CD4 + T-celler och 10 pl CD25-PE-antikroppen för fluorescerande märkning av CD25 + celler. Blanda väl och inkubera under 15 min i mörker.
- Tillsätt 2 ml buffert och passera cellerna genom en 40 | im cellfilter in i ett nytt 50 ml rör för att avlägsna celldebris. Tvätta cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.Kassera supernatanten fullständigt och resuspendera cellpelleten i 500 | il buffert vid en densitet av upp till 1,25 x 10 8-celler.
- Applicera cellerna på kolonnen och samla in de omärkta celler som passerar genom kolonnen. Tvätta kolonnen genom att tillsätta 2 ml buffert och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt och suspendera de isolerade CD4 + T-celler i 90 | il buffert.
- För magnetisk märkning av CD25 + celler, tillsätt 10 pl anti-PE mikrokulor, blanda väl och inkubera i 15 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tillsätt 2 ml buffert och tvätta cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt och resuspendera cellpelleten i 500 | il buffert vid en densitet av upp till 1 x 10 8-celler.
- Att berika CD4 + CD25 + T reg-celler, tillämpa cellerna i kolonnen för positiv selektion och tvätta kolonnn genom att tillsätta 2 ml buffert. Upprepa tvätta tre gånger.
- När kolonnen är tom efter det slutliga tvättsteget, tillsätt 1 ml av buffert på kolonnen, och spola ut det magnetiskt märkta CD4 + CD25 + celler med hjälp av kolven.
- Upprepa steg 4,8-4,9 för att förbättra renheten hos de isolerade CD4 + CD25 + T-reg-celler. Tvätta cellerna med FACS-buffert genom centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera de isolerade CD4 + CD25 + T-reg-celler vid en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml i komplett RPMI-medium.
- För att kontrollera renheten hos de isolerade-CD4 + CD25 + T reg-celler, använda 2 x 10 5 celler från den totala isolerade-CD4 + CD25 + T reg-celler. Färga cellerna med 50 | il FACS buffert innehållande anti-CD4 FITC och cellviabiliteten detekteringsreagenset nära IR fluorescerande reaktivt färgämne.
OBS: CD25 var redan har märkts med PE under isolering. - Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C. Tvätta cellerna med FACS-buffert genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Efter tvättning resuspendera cellpelleten i 100 pl FACS-buffert och kontrollera renhet genom flödescytometri.
- Gate live-cellpopulationen. För att analysera renheten av T-reg-celler, bekräftar andelen CD4 + CD25 + celler.
OBS: Baserat på experimentella resultat, är den procentuella andelen av CD4 + CD25 + celler bland renade celler över ca 80%.
5. Isolering av CD8 + T-celler och märkning av CD8 + T-celler
OBS: Volymerna av alla reagenser som anges nedan är för en startcellantal av 1 x 10 7 totalt splenocyter.
- Förbered celler som beskrivs i avsnitt 2 med naiva möss. Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml av T-cellisolering buffer. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt, och resuspendera cellpelleten i 40 pl buffert.
- För CD8 + T-cellisolering med hjälp av magnetisk cellseparationssystemet, tillsätt 10 pl av biotin-antikroppscocktail för icke-CD8 + T-cellmärkning och blanda väl. Inkubera under 5 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 30 pl buffert och 20 pl anti-biotin mikropärlor. Blanda väl och inkubera under 10 minuter vid 4 ° C.
- Applicera cellerna på kolonnen och samla in de omärkta celler som passerar genom kolonnen. Tvätta kolonnen genom att tillsätta 2 ml buffert tre gånger.
- Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt och suspendera de isolerade CD8 + T-celler i 2 ml buffert.
- För att kontrollera renheten hos de isolerade cellerna, förbereda 50 pl antikroppslösning i FACS-buffert. Resuspendera 2 x 10 5 celler bland isolerade CD8 + T cells i 50 fil antikroppslösning.
OBS: För att bereda antikropplösning, tillsätt anti-CD8 FITC och cellviabiliteten detektionsreagens (nära-IR fluorescerande reaktivt färgämne) i FACS buffert. - Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C. Tvätta cellerna med FACS-buffert genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Efter tvättning resuspendera cellpelleten i 100 | il FACS-buffert och kontrollera renheten hos cellerna genom flödescytometri.
- Gate live-cellpopulationen. Att kontrollera renheten hos CD8 + T-celler, bekräftar den procentuella andelen CD8 + T-celler.
OBS: Baserat på experimentella resultat, är den procentuella andelen CD8 + -celler bland renade celler över ca 90%. - Lägga PBS till de isolerade CD8 + T-celler. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten. Resuspendera isolerade CD8 + T-celler vid en koncentration av 1 x 10 7 celler / ml i PBS.
- Att märka CD8 + T cells för undertryckandet in vitro-analysen, utspädd cellproliferation spårnings violett färgämne i PBS för att erhålla en koncentration av 5 pM vid RT.
OBS: De ungefärliga excitations- och emissionstoppar av cellproliferation spårnings violett färgämne som används i studien är 405 och 450 nm, respektive. - Blanda väl lika stora volymer av cellproliferation spårnings violett färgämne (5 | iM) och cellsuspension (1 x 10 7 celler / ml av CD8 + T-celler) i ett 15 ml rör, och inkubera vid 20 min vid 37 ° C. Vortexa röret var 10 min.
- Fyll röret med kallt komplett RPMI media, och lämna röret under 10 minuter vid RT. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT. Kassera supernatanten fullständigt, och återsuspendera cellerna i en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml med förvärmda komplett RPMI-medium. Inkubera cellerna i 15 min vid RT.
6. Installera In Vitro Suppression analys Använda CD4 + CD25 + T <sub> reg och CD8 + T-celler
- För att framställa anti-CD3 / CD28-belagda pärlor, överföra lämplig volym av magnetiska pärlor till en 15 ml rör (2,5 l / 1 x 10 5 celler). Tillsätt en lika volym av PBS och blanda. Tvätta genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Späd de magnetiska pärlorna i fullständigt medium (50 | j, l / brunn).
- Alikvot 50 pl av CD4 + CD25 + T-reg celler per brunn i U-bottnad 96-brunnars platta (1 x 10 5 celler / brunn). Tillsätt 50 | il av CD8 + T-celler som responder T (T resp) celler per brunn (1 x 10 5 celler / brunn). Tillsätt 50 pl utspätt anti-CD3 / CD28-belagda pärlor i per brunn.
OBS: I detta steg, etikett och upprätta kontrollbrunnar på följande sätt: "ostimulerade CD8 + T-celler endast" utan anti-CD3 / CD28-belagda pärlor; "CD8 + T-cell endast" med anti-CD3 / CD28-belagda pärlor; Endast "CD8 + T-cell"Med anti-CD3 / CD28-belagda pärlor;". T reg cell endast "med anti-CD3 / CD28-belagda pärlor T reg-celler kan spädas med komplett medium och samodlades med T resp celler i en annan proportion av T resp celler: T reg-celler (1: 0,25-1: 1). - Tillsätt 50 l eller lämplig volym av media i alla brunnar till total volym av 200 pl. Täck plattan med folie och inkubera i en CO2-inkubator vid 37 ° C under 72 timmar.
7. Analys av CD8 + T-cellförökning och cytokinproduktion från CD8 + T-celler
- För analys av cytokinproduktion, efter 3 dagars odling, separera supernatanten från varje brunn till en annan platta och utför enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA).
OBS: Den överstående vätskan kan alikvoter och lagrades vid -70 ° C. I detta experiment, var anti-mus-IFN-γ-antikropp-belagda plattan används för att detektera IFN-γ produktion according tillverkarens s protokoll. För att bestämma IFN-γ produktion av prolifererande CD8 + T-celler på en enda cell nivå, kan utföras intracellulär cytokin färgning. - Efter separering av supernatanten från varje brunn, tvätta plattan innehållande cellerna med FACS-buffert och centrifugera vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C (3 gånger).
- Efter tvätt, kasta supernatanten. Resuspendera cellpelleten med 50 pl antikroppscocktail för färgning av förökade CD8 + T-celler. Inkubera i 20 minuter i mörker vid 4 ° C.
OBS: För att förbereda antikropp cocktail, lägga till anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5, och cellviabiliteten detektionsreagens (nära-IR fluorescerande reaktivt färgämne) i FACS buffert.
OBS: Antikroppar mot olika markörer såsom CD44 eller CD69 kan kombineras med andra antikroppar för att bekräfta aktiveringen av CD8 + T-celler. Kom ihåg att CD8 + T-celler har redan märkts med celltillväxt spårning violet färgämne i steg 5,10. - Tvätta två gånger genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Efter den sista tvättsteget, kassera supernatanten, och fixera cellerna under 20 min i mörker vid 4 ° C med 100 pl av fixeringsbuffert.
- Tvätta två gånger genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Resuspendera cellerna med 200 | il FACS-buffert och mäta proliferationen av cellproliferationsspårnings violett färgämnesmärkta CD8 + T-celler genom flödescytometri.
- Gate CD8 + T-cellpopulationen bland de levande celler. Mäta den procentsats av uppdelade och odelade celler i enlighet med spädningen av cellproliferation spårnings violett färgämne och CD8 + T-cellutspädning enligt följande ekvation. % Inhibering = [(% av prolifererade CD8 + T-celler i frånvaro av T-reg-celler -% av prolifererade CD8 + T-celler i närvaro av T reg celler) / (% av prolifererade CD8 + T-celler iavsaknad av T-reg-celler)] x 100. Ytterligare analysera data med hjälp av flödescytometri programvara 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genererade möss med motståndskraftigt virus infektion genom att injicera dem med 2 x 10 6 PFU av LCMV CL13 intravenöst. För att undersöka de fenotypiska förändringar i T reg-celler och T conv celler under kronisk virusinfektion, var mjältlymfocyter erhållna från naiva och infekterade möss färgades med olika antikroppar och analyserades med flödescytometri. Vid 16 d pi, var PD-1 uppregleras i både Foxp3 - CD4 + T omv (Figur 1A, övre panelen) och Foxp3 - CD8 + T omv (Figur 1B, övre panelen) celler. Frekvensen av Foxp3 + CD4 + T-reg-celler var två gånger högre i de LCMV CL13-infekterade möss än i de naiva mössen (Figur 1A). I synnerhet, de flesta av de Foxp3 + CD4 + T-reg celler uppvisade den aktiverade fenotypen, som uttrycker höga nivåer avPD-1 vid denna tidpunkt (Figur 1A).
För undertryckande in vitro-analysen, var ett betydande antal av CD8 + T-CONV-celler och CD4 + CD25 + T-reg-celler krävs. För att få en x 10 7 celler spridning spårning violett färgämnesmärkta CD8 + T-celler, splenocyter från två mjältar av naiva möss samman. För erhållande av 2 x 10 6 eller 3 x 10 6 av CD4 + CD25 + T-reg-celler, åtminstone tre mjältar från naiva och LCMV CL13-infekterade möss, respektive, slogs samman. CD8 + T-celler liksom T resp celler separerades med framgång utan signifikant kontaminering med andra immunceller (Figur 2A). T reg-celler kunde också isoleras, med en dominerande population av CD25 + CD4 + T-celler med mer än 80% renhet (Figur 2B).
Att jämföra den undertryckande funktionen hos naiva och kroniska T reg-celler, var den isolerade T reg och T resp celler inkuberades tillsammans under stimulering med anti-CD3 / CD28-belagda pärlor vid 37 ° C under 3 dagar. % Hämning av CD8 + T resp cellsproliferation ökades i en T reg cell dese beroende sätt (figur 3A). När CD8 + T resp celler samodlades med kroniska T reg-celler i ett förhållande av 1: 1, proliferation av CD8 + T resp celler inhiberades signifikant (figur 3B). IFN-γ-produktion genom CD8 + T resp celler var också signifikant inhiberade när CD8 + T resp celler samodlades med aktiverade T reg-celler från kroniskt infekterade möss snarare än med vilande T reg-celler från naiva möss i en T reg (figur 3C).
Figur 1: fenotyper av CD4 + och CD8 + T-celler i mjälten av naiva möss eller LCMV CL13-infekterade möss vid 16 d pi (A) Expression av PD-1 eller CD25 på Foxp3 - CD4 + T conv och Foxp3 + CD4 + T reg-celler. (B) Uttryck av PD-1 eller CD25 på Foxp3 - CD8 + T CONV celler. Mjältlymfocyter färgades med antikroppar mot CD4, CD8, CD25, PD-1, och Foxp3. Data är representativa för tre oberoende experiment. Panel A har ändrats från 25 som referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: renhet av T-resp celler som isolerats från naiva möss och T reg-celler som isolerats från naiva eller LCMV CL13-infekterade möss (A) Andel av CD8 + T-celler efter isolering.. (B) Procent av CD25-uttryckande CD4 + T-reg-celler efter isolering. Varje kvadrant i (B) bestämdes genom de expressionsnivåer av CD4 och CD25. Data är representativa för tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Figur 3: Effekt av aktiverade T reg celler på CD8 + T-cellssvar (A)% inhibition av CD8 + T-celler samodlade med T reg-celler i en T reg cell dosberoende sätt.. (B) Proliferation av CD8 + T-celler samodlade med T reg-celler i 1: 1-förhållande. (C) IFN-γ produktion av CD8 + T-celler samodlade med T reg-celler i en T reg cell dosberoende sätt. Proliferation av CD8 + T-celler mättes genom utspädning av cellproliferation spårnings violett färgämne i prolifererade CD8 + T-celler och IFN-γ-utsöndring utvärderades genom ELISA. Cellproliferationsspårnings violett färgämnesmärkta CD8 + T-celler stimulerades med anti-CD3 / CD28-belagda pärlor i 3 dagar i frånvaro eller närvaro av T
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om det finns bara ett litet antal av T-reg-celler i möss och människor, är det viktigt att förstå deras funktion eftersom de spelar en avgörande roll i regleringen av immunförsvaret och bibehålla immuntolerans. Siffer och undertryckande funktioner T reg celler ökar under en kronisk virusinfektion 15-20 samt cancerutveckling 13,14. Detta är troligen på grund av fortsatt antigenstimulering. För att utvärdera T reg celler fungera under antigen uthållighet och sjukdomsutveckling, behöver deras undertryckande aktivitet som skall mätas.
Här beskriver vi ett protokoll för att analysera ex vivo fenotypen av T-reg-celler och mäta deras undertryckande aktivitet med användning av en in vitro samodlingssystemet av CD8 + T-celler och T-reg-celler. Kritiska steg i det nuvarande protokollet är analys och isolering av T-reg-celler. Live och nyisolerade T
För att undersöka den undertryckande aktiviteten, T resp celler och T-reg-celler samodlades i ett förhållande av 1 till 1. Samodling med T regceller från kroniskt infekterade möss signifikant minskade CD8 + T-cellproliferation och IFN-γ-utsöndring i jämförelse med T reg-celler från naiva möss. Detta innebär att proliferationen och cytokinproduktion av CD8 + T-celler samodlade med T reg celler är omvänt relaterad till den undertryckande funktionen av T-reg-celler. Även om detta protokoll rekommenderar användning av en magnetisk cellseparationssystem för T reg cellisolering, förorening med icke-T-reg-celler kan inte uteslutas. De T reg celler erhållna från Foxp3-GFP-reporter möss 28-30 är bättre kandidater för att noggrant undersöka funktionen hos T reg celler än magnetisk cellseparationssystem, såsom CD25 ofta överuttrycks på aktiverade CD4 + -T-conv liksom T reg-celler.
Den undertryckande funktionen av T-reg-celler har utvärderats av olika in vitroundertryckande analyser 16,28,31-34. Fördelen med den in vitro undertryckande analysen är att den utvärderar den direkta effekten av T reg-celler på hämning av cellsvar på CD8 + T, eftersom endast T resp celler samodlade med T reg-celler. Förutom CD8 + T-celler, CD25 - kan CD4 + T-celler användas i stället för T resp celler 25. Effekterna av T reg eller T-CONV celler på immunceller såsom dendritiska celler eller naturliga mördarceller kan utvärderas genom att variera de experimentella betingelserna.
Molekyler såsom den CD103 35, LAG-3 36, ett glykoprotein A upprepningar dominerande 37, CD43 38, CD11a 38, eller mördarcell lektin-liknande receptorunderfamiljen G medlem 1 38 har använts som markörer för aktiverade T-reg-celler i specifika sjukdomar. I detta protokoll använde vi PD-1 som enindikator för att identifiera aktiverade T-reg-celler under kronisk virusinfektion. Protokollet kan användas för mångfacetterade analyser (fenotypiska och funktionella) t reg celler under särskilda villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | |
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Cell strainer, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Cell strainer, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml | Gibco | 10378-016 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0.5 M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R.
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
