Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fænotypisk og funktionel analyse af Aktiverede Regulatory T celler isoleret fra kronisk lymfatisk choriomeningitisvirus-inficerede mus

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54138
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

Abstract

Regulatoriske T (T reg) celler, som udtrykker Foxp3 som en transskriptionsfaktor, er delmængder af CD4 + T-celler. T reg celler spiller afgørende roller i immun tolerance og homeostase vedligeholdelse ved at regulere immunresponset. Den primære rolle af T reg celler er at undertrykke proliferationen af effektor-T (T eff) celler og produktionen af cytokiner, såsom IFN-γ, TNF-α og IL-2. Det er blevet påvist, at T reg cellers evne til at inhibere funktionen af T eff celler forstærkes under vedvarende patogen infektion og cancerudvikling. For at tydeliggøre funktionen af T reg celler under hvilende eller betændte tilstande, en række forskellige in vitro suppression assays under anvendelse af muse eller human T reg celler er blevet udtænkt. Hovedformålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til at sammenligne forskellene i fænotype og undertrykkende funktion mellem hvilende og aktiverede T regceller. For at isolere aktiverede T reg celler blev mus inficeret med lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stamme af LCMV. T reg celler isoleret fra milten fra LCMV CL13-inficerede mus udviste både den aktiverede fænotype og forøget undertrykkende aktivitet sammenlignet med hvilende T reg celler isoleret fra naive mus. Her beskriver vi den grundlæggende protokol for ex vivo fænotype-analyse for at skelne aktiverede T reg celler fra hvilende T reg celler. Desuden beskriver vi en protokol til måling af den undertrykkende aktivitet fuldt aktiverede T reg celler.

Introduction

Regulatoriske T (T reg) celler udtrykker forkhead kasse P3 (Foxp3) som en transskription faktor for deres udvikling og funktion 1. Derudover T reg celler udtrykker forskellige andre molekyler, såsom CD25 2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) 3, glucocorticoidinduceret tumornekrosefaktorreceptor 4, og cytotoksisk T-lymfocyt-associeret protein 4 (CTLA-4) 5 på deres overflade eller intracellulære område. Under kronisk infektion med forskellige former for patogener såsom vira 6,7, bakterier 8,9 og parasitter 10-12, eller i løbet af kræft udvikling 13,14, bliver T reg celler differentieret i aktiverede celler, viser forbedret undertrykkende funktion målretning effektor CD4 + og CD8 + T-celler. En række papirer har antydet, at ekspanderede og aktiverede T reg celler bidrager til de forringede CD8 + T-celle-response under ven retrovirus (FV) infektion 15-17. FV-inducerede T reg celler inhiberer IFN-γ eller granzym B-ekspression og cytotoksisk reaktivitet af CD8 + -T-celler 15-17. Desuden er der i en herpes simplex virus infektion model, blev det rapporteret, at udtømningen af CD4 + CD25 + -T-reg-celler resulterede i en udvidelse af virus-specifikke CD8 + T-celler og alvorlig vævsbeskadigelse ved infiltration af immunopathogenic CD4 + -T-celler 18-20.

Mus inficeret kronisk med klonen 13-stammen af lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV CL13) 21-24 er ofte blevet brugt til at karakterisere fænotypen og funktion af effektor T-celler (T EFF) og T reg celler under kronisk virusinfektion. Under vedvarende LCMV-infektion, virus-specifikke T eff celler gradvist mister deres effektorfunktion og blive udmattet T (Texh) celler. På den anden side, Treg celler styrke deres evne til at undertrykke virus-specifikke T-celle respons 25. Faldet i funktion kapacitet af T eff celler kan forklares ved adskillige faktorer, såsom opregulering af inhiberende receptorer på T eff celler, ændret funktion af antigen-præsenterende celler, produktion af immunregulatoriske cytokiner, og øget frekvens eller forstærket funktion af T reg celler 26. Blandt de er involveret i T-celle-suppression faktorer, programmeret celledød protein-1 (PD-1) udtrykkende Texh celler og T reg celler er blevet bredt betragtes som kendetegnende for antigen persistens og undertrykkende miljø. For nylig blev det rapporteret, at blokade af PD-1-vejen og ablation af T reg celler føre til øget T-cellefunktion og nedsat viral belastning under LCMV kronisk infektion 27. Desuden er T reg celler aktiveres under kronisk infektion af mus med LCMV 23,25 25. PD-1 er overudtrykt på T reg celler såvel som Texh celler, og niveauet af PD-1 udtrykt af T reg celler korrelerer med styrken af deres supprimerende funktion at inhibere T-celleproliferation 25.

Her beskriver vi en metode til at sammenligne egenskaberne af aktiverede T reg celler isoleret fra mus inficeret med LCMV CL13 og hvilende T reg celler isoleret fra naive mus. Endvidere forklarer vi en række processer til at adskille aktiverede T reg celler og undersøger deres ex vivo fænotype, samt måle deres supprimerende aktivitet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne undersøgelse blev mus holdt i en SPF-facilitet i Yonsei Laboratory Animal Research Center i Yonsei Universitet. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de koreanske Food and Drug Administration retningslinjer hjælp protokoller er godkendt af International Animal Care og brug Udvalg Yonsei Laboratory Animal Research Center ved Yonsei Universitet.

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Forbered 2% RPMI medier ved fortynding føtalt bovint serum (FBS) til 2% og penicillin-streptomycin til 1% i RPMI
  2. Forbered komplet RPMI medier. Til RPMI medier tilsættes 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% L-glutamin og 50 uM 2-mercaptoethanol.
  3. Forbered fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) buffer. For at gøre dette, supplere phosphatpufret saltvand (PBS) med 2% af FBS.
  4. Forbered T-celle isolation buffer. For at gøre dette, supplerer PBS med 2% af FBS og 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid.

2. Isolering af miltlymfocytter

  1. Fjern milten fra naive eller LCMV CL13-inficerede mus som beskrevet tidligere 19 og placere dem i 60 mm x 15 mm petriskåle indeholdende 10 ml 2% RPMI medier.
    BEMÆRK: I dette studie eksperimenter, 5 til 6 uger gamle C57B1L / 6J hunmus modtaget 2 x 10 6 plaque-dannende enheder (pfu) af LCMV CL13 gennem intravenøs injektion via halevenen. Sacrifice musene på dag 16 efter infektion (16 d pi) 25. Analyser ge-matchede naive mus var den samme dag.
  2. Placer en celle si i en 50 ml rør og skyl det med 2 ml 2% RPMI medier. Placer milten på 70 um cellefilter og male hjælp stempel en sprøjte. Skyl cellesigte med 2 ml 2% RPMI medier og fjerne det fra 50 ml rør.
  3. Fyld røret med 2% RPMI-medium og centrifugeres ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og resuspendercellepelleten i 1 ml ACK lyseringsbuffer. Inkuber prøverne ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
    BEMÆRK: Mængden af ​​ACK lyseringsbuffer ovenfor angivne er for en milt. Opskalere overensstemmelse hermed for puljede milt prøver.
  4. Fyld røret med 2% RPMI-medium og centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i en tæthed på 1 x 10 7 celler / ml i komplet RPMI-medier.
    BEMÆRK: For levende celletælling, bejdse celler med trypanblåt og tæller kun levende celler, der ikke er farvet ved hjælp af hæmocytometer.

3. Fænotypebestemmelse af Milt Konventionel T (T conv) Celler og T reg celler

BEMÆRK: Inden T reg celle isolation, undersøge fænotype miltlymfocytter isoleret fra naive eller inficerede mus ved farvning af cellerne med forskellige antistoffer og analysere dem ved flowcytometri.

  1. Overfør 50 pi af cellerne(5 x 10 5 celler) blandt de samlede miltlymfocytter i hver brønd i en ny plade med U-bund 96 brønd og add 150 pi FACS buffer per brønd. Centrifugeres ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C.
  2. Supernatanten kasseres. Omrør cellepelleten og der tilsættes 200 pi FACS buffer per brønd. Centrifugeres ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C (2 gange).
  3. Forbered antistofcocktail til farvning celleoverflademarkører i 50 pi FACS buffer per brønd med følgende antistoffer og reagenser. Anti-CD4 violet farvestof, Anti-CD25 grønt farvestof, Anti-PD-1 violet farvestof, Anti-CD8 PerCP-Cy5.5 farvestof og cellernes levedygtighed detektionsreagens nær-infrarødt (IR) fluorescerende reaktivt farvestof.
    BEMÆRK: For yderligere at analysere fænotype af aktiverede T reg celler, kan anti-CD103 23,25 tilføjes til celleoverfladen-markør farvning.
  4. Resuspender cellepelleten med 50 ul antistof cocktail per brønd. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellerne to gange medFACS buffer ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C.
  5. Efter den sidste vasketrin, dekanter supernatanten og fikseres cellerne i 20 minutter i mørke ved 4 ° C med 100 pi fiksering puffer fremstillet ifølge producentens protokol.
  6. Vask cellerne to gange med den permeabilisering vaskebuffer (fremstillet ifølge producentens protokol) ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C.
  7. Forbered antistoffet løsning til intracellulær Foxp3 farvning, og resuspender cellepelleten med 50 ul Anti-Foxp3 antistof løsning.
    BEMÆRK: For yderligere at analysere fænotyper af T conv og T reg celler, anti-CTLA kan tilføjes på dette trin.
  8. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C, og gentag trin 3.6. Efter den sidste vasketrin resuspendere cellepelleten i 200 pi FACS buffer og undersøge fænotypen af cellerne ved flowcytometer 25.
  9. Gate den levende celler befolktion. At analysere fænotyper af T conv celler under LCMV CL13 infektion, undersøge hyppigheden af Foxp3 - PD-1 + celler blandt CD4 + eller CD8 + T-celler.
    BEMÆRK: Baseret på eksperimentelle resultater, procentdelen af Foxp3 - PD-1 + er mere end 50% i både CD4 + og CD8 + T-cellepopulationer ved 16 d pi med LCMV CL13.
    1. For at analysere hyppigheden og fænotyper af T reg celler, undersøge hyppigheden af Foxp3 + eller Foxp3 + PD-1 + celler blandt CD4 + T-celler.
      BEMÆRK: Baseret på eksperimentelle resultater, den procentdel af Foxp3 + eller Foxp3 + PD-1 + celler er mere end 20% i CD4 + T-celle population, hhv.

4. Isolering af CD4 + CD25 + T reg Celler

BEMÆRK: De mængder af alle reagenser er angivet nedenfor er for enbegyndende celletal på 1 x 10 7 totale splenocytter.

  1. Forbered cellerne som beskrevet i afsnit 2 ved hjælp af naive og LCMV kronisk inficerede mus. Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml t celleisolering buffer. Centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes fuldstændigt og resuspender cellepelleten i 40 pi buffer.
  2. For CD4 + T-celle berigelse benyttes magnetisk celleseparation systemet, tilsættes 10 pi biotin-antistof cocktail og bland godt. Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Tilsæt 30 pi puffer, 20 pi anti-biotin mikroperler til mærkning af ikke-CD4 + T-celler og 10 pi CD25-PE-antistof til fluorescerende mærkning af CD25 + -celler. Bland godt og inkuberes i 15 minutter i mørke.
  4. Tilsæt 2 ml buffer og passerer cellerne gennem en 40 um cellefilter i et nyt 50 ml rør for at fjerne cellerester. Vask cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.Supernatanten fjernes fuldstændigt og resuspender cellepelleten i 500 pi puffer ved en densitet på op til 1,25 x 10 8 celler.
  5. Påfør cellerne på søjlen og indsamle de umærkede celler, der passerer gennem søjlen. Kolonnen udvaskes ved tilsætning af 2 ml puffer og centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes fuldstændigt og resuspender de isolerede CD4 + -T-celler i 90 pi buffer.
  6. Til magnetisk mærkning af CD25 + celler, tilsættes 10 pi anti-PE mikroperler, bland godt, og inkuberes i 15 minutter i mørke ved 4 ° C.
  7. Tilsæt 2 ml buffer og vask cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes fuldstændigt og resuspender cellepelleten i 500 pi puffer ved en densitet på op til 1 x 10 8 celler.
  8. For at berige CD4 + CD25 + T reg celler, anvender cellerne på søjlen for positiv selektion, og vask Column ved tilsætning af 2 ml puffer. Gentag vask tre gange.
  9. Når søjlen er tom efter den endelige vasketrin tilsættes 1 ml buffer på søjlen, og skyl den magnetisk mærkede CD4 + CD25 + celler ved anvendelse af stemplet.
  10. Gentag trin 4,8-4,9 at forbedre renheden af de isolerede CD4 + CD25 + -T-reg-celler. Vask cellerne med FACS-buffer ved centrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og resuspender isolerede CD4 + CD25 + T reg celler ved en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml i komplet RPMI-medier.
  11. For at kontrollere renheden af de isolerede-CD4 + CD25 + T reg celler, bruge 2 x 10 5 celler fra de samlede isoleret-CD4 + CD25 + T reg celler. Farv cellerne med 50 gi FACS buffer indeholdende anti-CD4 FITC og cellelevedygtighed påvisningsreagens nær-IR fluorescerende reaktivt farvestof.
    BEMÆRK: CD25 blev allerede mærket med PE under isolering.
  12. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellerne med FACS-buffer ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C. Efter vask, resuspenderes cellepellet i 100 pi FACS buffer og tjekke renhed ved flowcytometri.
  13. Gate live-cellepopulation. For at analysere renheden af T reg celler, bekræfter procentdelen af CD4 + CD25 + celler.
    BEMÆRK: Baseret på eksperimentelle resultater, procentdelen af CD4 + CD25 + celler blandt oprensede celler er over ca. 80%.

5. Isolering af CD8 + T-celler og mærkning af CD8 + T-celler

BEMÆRK: De mængder af alle reagenser er angivet nedenfor er for en start celle antal 1 x 10 7 totale splenocytter.

  1. Forbered celler som beskrevet i afsnit 2 ved hjælp af naive mus. Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml t celleisolering buffis. Centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes fuldstændigt, og resuspender cellepelleten i 40 pi buffer.
  2. For CD8 + T-celle isolation benyttes magnetisk celleseparation systemet, tilsættes 10 pi biotin-antistof cocktail for ikke-CD8 + T mærkning celle og bland godt. Der inkuberes i 5 minutter ved 4 ° C.
  3. Tilsæt 30 pi buffer og 20 pi anti-biotin mikroperler. Bland godt og inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C.
  4. Påfør cellerne på søjlen og indsamle de umærkede celler, der passerer gennem søjlen. Kolonnen udvaskes ved tilsætning af 2 ml puffer tre gange.
  5. Centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes fuldstændigt og resuspender isolerede CD8 + T-celler i 2 ml buffer.
  6. For at kontrollere renheden af ​​de isolerede celler, forberede 50 pi antistofopløsning i FACS-buffer. Resuspendere 2 x 10 5 celler blandt isolerede CD8 + T cells i 50 pi antistofopløsning.
    BEMÆRK: For at forberede antistof løsning, tilføjer anti-CD8 FITC, og afsløring cellernes levedygtighed reagens (nær-IR fluorescerende reaktivt farvestof) i FACS-buffer.
  7. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C. Vask cellerne med FACS-buffer ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C. Efter vask, resuspenderes cellepellet i 100 pi FACS buffer og kontrollere renheden af ​​cellerne ved flowcytometri.
  8. Gate live-cellepopulation. For at kontrollere renheden af CD8 + T-celler, bekræfter procentdelen af CD8 + T-celler.
    BEMÆRK: Baseret på eksperimentelle resultater, procentdelen af CD8 + -celler blandt oprensede celler er over ca. 90%.
  9. Tilføj PBS til de isolerede CD8 + T-celler. Centrifugeres ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten kasseres. Resuspendere isolerede CD8 + T-celler i en koncentration på 1 x 10 7 celler / ml i PBS.
  10. For at mærke CD8 + T ceLLS til in vitro suppression bestemmelsen fortyndes celleproliferation sporing violet farvestof i PBS til opnåelse af en koncentration på 5 uM ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: De omtrentlige excitation og emission toppe af celledeling sporing violet farvestof anvendt i undersøgelsen er 405 og 450 nm.
  11. Bland godt lige store volumener af celleproliferation sporing violet farvestof (5 uM) og cellesuspensionen (1 x 10 7 celler / ml CD8 + T-celler) i et 15 ml rør, og der inkuberes ved 20 minutter ved 37 ° C. Vortex røret hver 10 min.
  12. Fyld røret med koldt komplet RPMI medier, og efterlade røret i 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes fuldstændigt, og cellerne resuspenderes i en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml med forvarmet komplet RPMI medier. Inkubér cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur.

6. Opsætning af In Vitro Suppression Assay Brug CD4 + CD25 + T <sub> reg og CD8 + -T-celler

  1. Til fremstilling anti-CD3 / CD28-overtrukne perler, overføre det passende volumen af magnetiske perler til et 15 ml rør (2,5 ul / 1 x 10 5 celler). Tilføj en tilsvarende mængde PBS og blandes. Vask ved centrifugering ved 300 xg i 2 minutter ved 4 ° C og supernatanten. Fortynd de magnetiske perler i komplette medier (50 pl / brønd).
  2. Alikvote 50 pi CD4 + CD25 + T reg celler pr brønd af pladen med U-bund med 96 brønde (1 x 10 5 celler / brønd). Tilsæt 50 pi af CD8 + T-celler som responder T (T resp) celler per brønd (1 x 10 5 celler / brønd). Der tilsættes 50 pi fortyndet anti-CD3 / CD28-overtrukne perler i hver brønd.
    BEMÆRK: I dette trin, mærke og oprette kontrolbrønde som følger: "ikke-stimuleret CD8 + T kun celle" uden anti-CD3 / CD28-belagte perler; "Kun CD8 + T-celle" med anti-CD3 / CD28-overtrukne perler; Kun "CD8 + T-celle"Med anti-CD3 / CD28-overtrukne perler". T reg celle kun "med anti-CD3 / CD28-overtrukne perler T reg celler kan fortyndes af komplette medier og co-dyrket med T Resp celler i et forskelligt forhold mellem T Resp celler: T reg celler (1: 0,25-1: 1).
  3. Tilføj 50 pi eller passende volumen af ​​medier i alle hullerne til samlet volumen på 200 pi. Dæk pladen med folie og inkuber i en CO2-inkubator ved 37 ° C i 72 timer.

7. Analyse af CD8 + T-celleproliferation & cytokinproduktion fra CD8 + -T-celler

  1. For cytokinproduktionen analyse, efter 3 dages dyrkning, adskille supernatanten fra hver brønd i en anden plade og udføre enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
    BEMÆRK: Supernatanten kan alikvoteret og opbevaret ved -70 ° C. I dette forsøg blev anti-muse IFN-γ antistof-coatede plade anvendes til at detektere IFN-γ produktion according til fabrikantens protokol. For at bestemme IFN-γ produktion af prolifererende CD8 + T-celler på en enkelt celle niveau, kan intracellulær cytokin-farvning udføres.
  2. Efter adskillelse af supernatanten fra hver brønd, vask pladen indeholdende cellerne med FACS-buffer og centrifugeres ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C (3 gange).
  3. Efter vask, supernatanten. Resuspender cellepelleten med 50 ul antistof cocktail til farvning af prolifererede CD8 + T-celler. Der inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
    BEMÆRK: For at forberede antistof cocktail, tilføje anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5, og afsløring cellernes levedygtighed reagens (nær-IR fluorescerende reaktivt farvestof) i FACS-buffer.
    BEMÆRK: Antistoffer mod forskellige markører, såsom CD44 eller CD69 kan kombineres med andre antistoffer til at bekræfte aktivering af CD8 + -T-celler. Husk, at CD8 + T-celler allerede er blevet mærket med celleproliferation sporing violet farvestof i trin 5.10.
  4. Vask to gange ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C. Efter den sidste vask trin, kasseres supernatanten, og fikseres cellerne i 20 min i mørke ved 4 ° C med 100 ul fiksering buffer.
  5. Vask to gange ved centrifugering ved 300 xg i 2 min ved 4 ° C. Resuspender cellerne med 200 pi FACS buffer og måle proliferationen af celleproliferation sporing violet farvestofmærkede CD8 + T-celler ved flowcytometri.
    1. Gate CD8 + T-celle population blandt de levende celler. Mål procentdele af opdelte og udelte celler ifølge fortyndingen af celleproliferation sporing violet farvestof og CD8 + T-celle fortynding efter følgende ligning. % Inhibering = [(% af prolifererede CD8 + T-celler i fravær af T reg celler -% af prolifererede CD8 + T-celler i nærvær af T reg celler) / (% af prolifererede CD8 + T-celler ifravær af T reg celler)] x 100. Yderligere analysere data ved hjælp af flowcytometri software 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi genererede mus med vedvarende virusinfektion ved at indsprøjte dem med 2 x 10 6 pfu af LCMV CL13 intravenøst. For at undersøge de fænotypiske ændringer i T reg celler og T conv celler under kronisk virusinfektion, blev milt-lymfocytter opnået fra naive og inficerede mus farvet med forskellige antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Ved 16 d pi, blev PD-1 opreguleres i både Foxp3 - CD4 + T conv (figur 1A, øvre panel) og Foxp3 - CD8 + T conv (figur 1B, øvre panel) celler. Hyppigheden af Foxp3 + CD4 + T-reg-celler var to gange højere i LCMV CL13-inficerede mus end i naive mus (figur 1A). Især fleste Foxp3 + CD4 + T reg celler udviste den aktiverede fænotype, der udtrykker høje niveauer afPD-1 på dette tidspunkt (figur 1A).

Til in vitro suppression assay blev et betydeligt antal CD8 + T conv celler og CD4 + CD25 + T reg celler påkrævet. At opnå 1 x 10 7 celleproliferation sporing violet farvestofmærkede CD8 + T-celler blev splenocytter fra to milt fra naive mus poolet. At opnå 2 x 10 6 eller 3 x 10 6 af CD4 + CD25 + T reg celler, mindst tre milt fra naive og LCMV CL13-inficerede mus, henholdsvis blev samlet. CD8 + T-celler som T Resp celler blev separeret med succes uden væsentlig forurening med andre immunceller (figur 2A). T reg celler kunne også isoleres, med en dominerende population af CD25 + CD4 + T-celler med mere end 80% renhed (figur 2B).

At sammenligne undertrykkende funktion af naive og kroniske T reg celler, blev det isolerede T reg og T Resp celler inkuberet sammen under stimulering med anti-CD3 / CD28-overtrukne perler ved 37 ° C i 3 dage. % Inhibering af CD8 + T resp celleproliferation blev forøget i en T reg celle Dese-afhængig måde (figur 3A). Når CD8 + T Resp-celler co-dyrket med kronisk T reg celler i et forhold på 1: 1, blev proliferation af CD8 + T-celler Resp signifikant inhiberet (figur 3B). IFN-γ-produktion ved CD8 + T-celler Resp var også signifikant inhiberet, når CD8 + -T Resp celler blev co-dyrket med aktiverede T reg celler fra kronisk inficerede mus frem for med hvilende T reg celler fra naive mus i en T reg (figur 3C).

figur 1
Figur 1: fænotyper af CD4 + og CD8 + T-celler i milten af naive mus eller LCMV CL13-inficerede mus ved 16 d pi (A) Ekspression af PD-1 eller CD25 på Foxp3 - CD4 + T conv og Foxp3 + CD4 + T reg cells. (B) Ekspression af PD-1 eller CD25 på Foxp3 - CD8 + T-conv celler. Miltlymfocytter blev farvet med antistoffer mod CD4, CD8, CD25, PD-1, og Foxp3. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Panel A har været ændret siden 25 som reference. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Renheder af T-Resp celler isoleret fra naive mus og T reg celler isoleret fra naive eller LCMV CL13-inficerede mus (A) Procent af CD8 + T-celler efter isolering.. (B) Procentdel af CD25-udtrykkende CD4 + T-reg celler efter isolering. Hver kvadrant i (B) blev bestemt ved ekspressionsniveauerne af CD4 og CD25. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

les / ftp_upload / 54.138 / 54138fig3.jpg "/>
Figur 3: Virkning af aktiverede T reg celler på CD8 + T-cellerespons (A)% inhibering af CD8 + T-celler co-dyrket med T reg celler i en T reg celle dosisafhængig måde.. (B) Proliferation af CD8 + T-celler co-dyrket med T reg celler i forholdet 1: 1. (C) IFN-γ produktion af CD8 + T-celler co-dyrket med T reg celler i en T reg celle dosisafhængig måde. Proliferation af CD8 + -T-celler blev målt ved fortynding af celleproliferation sporing violet farvestof i prolifererede CD8 + T-celler og IFN-γ-sekretion blev bedømt ved ELISA. Celleproliferation sporing violet farvestofmærkede CD8 + T-celler blev stimuleret med anti-CD3 / CD28-overtrukne perler i 3 dage i fravær eller nærvær af T + T-celler co-dyrket med og uden T reg celler. Fyldte grå toppe i histogrammet angiver proliferation af CD8 + T-celler co-dyrket uden T reg celler. Hver gruppe blev udformet i tre eksemplarer. Søjlerne repræsenterer middelværdi + SEM. Dette tal er blevet ændret fra 25 som reference. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom der findes kun et lille antal af T reg celler i mus og mennesker, er det vigtigt at forstå deres funktion som de spiller en afgørende rolle i reguleringen af immunresponset og opretholdelse immuntolerance. Antallet og undertrykkende funktioner T reg celler stiger i løbet af en kronisk virusinfektion 15-20 samt kræft progression 13,14. Dette er sandsynligvis på grund af fortsat antigenstimulering. At evaluere T reg celler fungerer under antigen persistens og sygdomsudvikling, behov deres supprimerende aktivitet, der skal måles.

Her beskriver vi en protokol til at analysere ex vivo fænotypen af T reg celler og måle deres supprimerende aktivitet under anvendelse af en in vitro co-dyrkningssystemet ifølge CD8 + T-celler og T reg celler. Kritiske trin i den nuværende protokol er analyse og isolering af T reg celler. Levende og frisk isolerede T in vitro. Vi undersøgte også fænotyper af T conv og T reg celler under en kronisk virusinfektion. T CONV celler, dvs. Foxp3 - viste CD4 + og CD8 + T-celler en formindskelse i cellulær aktivitet efter kronisk virusinfektion (figur 1). PD-1-ekspression blev opreguleret i både T conv cellepopulationer. Stigning i T reg celleantal og opregulering af PD-1-ekspression er kendetegnende for immunrespons under en kronisk virusinfektion. Derudover kan anti-organer for andre inhibitoriske receptorer, såsom TIM-3 og CTLA-4 anvendes i kombination med PD-1 for at undersøge T-celle fænotype ved FACS efter choric virusinfektion.

For at undersøge den undertrykkende aktivitet, T Resp celler og T reg-celler blev co-dyrket i et forhold på 1 til 1. Co-kultur med T regceller fra kronisk inficerede mus signifikant reduceret CD8 + T-celleproliferation og IFN-γ-sekretion sammenlignet med T reg celler fra naive mus. Dette indebærer, at proliferation og cytokinproduktion af CD8 + T-celler co-dyrket med T reg celler omvendt er relateret til den undertrykkende funktion af T reg celler. Selv om denne protokol anbefaler brug af en magnetisk celle separation system til T reg celle isolation, forurening med ikke-T reg celler kan ikke udelukkes. De T reg celler opnået fra Foxp3-GFP reporter mus 28-30 er bedre kandidater til nøjagtigt at undersøge funktionen af T reg celler end magnetisk celleseparation anlægget, da CD25 ofte overudtrykkes på aktiverede CD4 + -T conv samt T reg celler.

Den undertrykkende funktion af T reg celler er blevet evalueret af forskellige in vitroundertrykkelse assays 16,28,31-34. Fordelen ved in vitro suppression assay er, at den evaluerer den direkte virkning af T reg celler på hæmningen af CD8 + T-celle-respons, fordi kun T-Resp celler dyrkes sammen med T reg celler. Foruden CD8 + T-celler, CD25 - kan CD4 + T-celler anvendes i stedet for T Resp celler 25. Virkningerne af T reg eller T conv celler på immunceller såsom dendritiske celler eller naturlige dræberceller kan evalueres ved at variere de eksperimentelle betingelser.

Molekyler, såsom den CD103 35, LAG-3 36, et glycoprotein A gentagelser fremherskende 37, CD43 38, CD11a 38, eller killer celle lectin-lignende receptor underfamilie G medlem 1 38 har været anvendt som markører for aktiverede T reg celler i specifikke sygdomme. I denne protokol, vi brugte PD-1 som enindikator til at identificere aktiverede T reg celler under kronisk virusinfektion. Denne protokol kan bruges til mangefacetterede analyser (fænotypiske og funktionelle) af T reg celler under særlige betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Tags

Immunologi undertrykkende funktion, regulatoriske T-celler CD8 kronisk infektion lymfatisk choriomeningitisvirus
Fænotypisk og funktionel analyse af Aktiverede Regulatory T celler isoleret fra kronisk lymfatisk choriomeningitisvirus-inficerede mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J.… More

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter