Introduction
ガラスまたはビーズ表面に係留大きなDNA分子の可視化DNA基質、1,2および高分子物理学上のDNAタンパク質相互作用、タンパク質の動力学を調査するために利用されてきた。3,4-単一係留大型DNA分子のためのプラットフォームは、いくつかの異なるを有します他のDNA固定化方法に比べて利点が5まず、表面につなが大きいDNA分子は、その結合部位を認識するDNA結合タンパク質のための非常に重要であるせん断流れずに自然なランダムコイルコンフォメーションを有します。第二に、フローチャンバー内の一連の酵素反応のためのDNA分子の周りの化学的環境を変更することは非常に簡単です。第三に、マイクロ流体せん断流がDNA分子、このような表面固定化6及びナノチャネルの狭窄などの代替的なDNA伸長手法を用いて達成することは非常に困難である完全な輪郭の長さの100％にまで延伸を誘発する。7 A完全stretcheDのDNA分子は、ゲノムマップ上の酵素の動きを監視するために有用であることができる位置情報を提供します。
それにもかかわらず、DNAテザリングアプローチは、YOYO-1のような挿入色素は、一般的に容易に蛍光励起光によって破壊される係留DNA分子を引き起こすという重大な欠点を有しています。一般的に、大規模なDNA分子は蛍光顕微鏡下で可視化のための蛍光色素で染色されなければなりません。これらの色素は、それらが二本鎖DNAにインターカレートしたときにのみ蛍光を発するので、この目的のために、YOYO-1または他のTOTO系色素が主に使用されている。8しかし、ビス-インターカレート色素があるため、光誘導されるDNA光切断を引き起こすことがよく知られています蛍光体のインターカレーション。9更に、表面につなが蛍光染色されたDNA分子は、剪断流れが自由にDNA分子の移動の力を壊す発揮することができるため、より脆弱です。したがって、我々は新たなDとFP-DBPを開発しました表面に係留大型DNA分子を画像化するためのNA-染色タンパク質色素。 FP-DBPを使用する利点は、それが結合するDNA分子の光開裂を起こさないことである。加えて、10のビス-インターカレート色素は輪郭長さを増加しながら、FP-DBPは、DNAの輪郭の長さを増加させません約33％です。
このビデオ方式は、PEG-ビオチン表面に大きなDNA分子を係留するための実験的アプローチを紹介する。 図1は、平滑末端および付着末端を有するDNAを係留の異なるアプローチを示しています。したがって、この染色方法は、DNA分子の任意のタイプに適用することができる。 図2は、DNA分子を伸長するだけでなく、化学的および酵素をロードするためにせん断流を生成するために、シリンジポンプによって制御することができるフローチャンバアセンブリの概略図を示していますソリューション。 図3は、PEGylatにつなが完全に伸張したDNA分子の顕微鏡写真を示していますエド面11とFP-DBPで染色しました。
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Protocol
1. DNAビオチン化
- ターミナルトランスフェラーゼを使用して平滑末端DNAのビオチン化酵素（TdT）
注：平滑末端DNAで使用T4 DNA（166 kbpの）を、。- 2.5mmののCoCl 2、10×反応緩衝液5μl、10mMのビオチン-11-dUTPを0.5μlの、ターミナルトランスフェラーゼの0.5μlの（10単位）、およびT4 DNA0.5μlの（0.5μgの/μl）を5μLを追加反応混合物。水38.5μLを添加することによって50μlの最終容積にしてください。
- 1時間37℃で反応混合物をインキュベートします。
注：延長反応時間、 すなわち 、二重係留DNAを得ることができ、ビオチンが両端にタグ付けされていることが可能です。 - 0.5 M EDTA、pHが8の5μLを加えて反応を停止します。
- 4℃でチューブを保管してください。
- DNAリガーゼを用いて粘着性のエンドDNAのビオチン化
注意：使用λDNA（48.5 kbpの）、粘着末端のDNAです。 <オール> - T4 DNAリガーゼを1μl、10×ライゲーションバッファー5μlの、25 ngの/μlのλファージDNAを1μlを追加し、50μlの最終容量を作るために水の43μlを添加します。
- 4℃でチューブを保管してください。
2.官能の表面誘導体化
注： 図1に示すように、ガラス表面上のDNA分子の末端をつなぐためには、第1級アミン基をビオチンPEGコーティングに続いてカバースリップ上にシラン化され、このPEG化プロセスがあるため、単一分子DNAの画像化のために重要です。著しく表面上の望ましくない分子の結合によって作成されたランダムノイズを低減することができます。
- ピラニアクリーニング
注：ピラニア・ソリューションは、したがって、それは適切な安全ガイドラインに従って、取り扱いに注意する必要があり、有機物質と激しく反応します。- 場所は、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）ラックにカバースリップ、およびbはそれらを保持しますyのPTFE長手方向シールテープ、ラックの表面のエッジと半分に半分。ラッピングした後、洗浄手順の間にラックを処理するためのテープの長い一片（〜5センチ）のままにします。
- SO H 2 O 2の4および150mlをヒュームフード内でピラニア溶液を作製するためにH 2 350 mlを1 Lのガラスビーカーを埋めます。 2時間ピラニア溶液中でラックを配置します。
- ビーカー内の水のpHになるまで脱イオン水で完全に空のビーカーからのピラニア溶液およびリンスカバースリップを中性に達します。 pH試験紙ストリップを使用してください。
- 30分間、水を含有するビーカーにカバースリップのラックを超音波処理。ビーカーからわずかアミノシラン化の前に空の水。ガラス基板をきれいにし、誘導体化するために超音波処理電力の75 Wを使用してください。
- ガラス表面にAminosilanization
- N 2 mlを加え- [3-（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミン及び200mlまで氷酢酸10mlaminosilanization溶液を調製するための清浄なポリプロピレン容器中でメチルアルコール。
- ポリプロピレン容器中で洗浄カバースリップを置きます。 30分間100rpmで、室温でそれらを振ります。
- W.は、少なくとも30分間、100rpmで、室温でそれらを振る75で15分間、誘導体化されたカバースリップを入れたビーカーを超音波処理します。
- エチルアルコールで二回ビーカーからの溶液を空にし、メチルアルコールで一回、慎重にカバースリップをすすぎ、と。ストアエチルアルコール中のカバースリップとは、2週間以内にそれらを使用しています。
- カバーガラスのPEG化
- 0.1 M炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3）の10ミリリットルを加えます。 0.22μmのシリンジフィルターで溶液をフィルタリングします。
- ビオチンPEGスクシンイミジルカーボネート（ビオチン-PEG-SC）およびNaHCO 3の350μlの中のPEGスクシンイミジル吉草酸80mgの（MPEG-SVG）の2ミリグラムを溶かします。光保護管を使用してください。
- 1激しくチューブをボルテックス0秒、および気泡を除去するために1分間10,000×gで、それを遠心します。
- エチルアルコールですすぎ、続いてアセトンでスライドガラスを、洗浄します。完全に空気乾燥にスライドを許可します。
- きれいなガラススライド上のPEG溶液の滴（50μl）を配置します。任意の気泡を発生させることなく、アミノシラン化カバースリップで軽く滴をカバーしています。
- 3時間のための場所のスライドは一晩暗所で、室温で湿潤チャンバーを十分に平らにします。底に水で、チャンバとして空のピペットチップホルダーを使用します。チューブ内の残留PEG溶液を密封し、4℃で保管してください。
- 脱イオン水で十分にペグ化されたカバースリップを洗い流します。使用するまで暗く乾燥した場所に保管してください。
3.フローチャンバーの組み立て
- 図2のように、パンチアクリルホルダーを製作。チューブインサートの直径は0.762ミリメートルであることを確認し、一つの孔を指定すると、入口であり、他方はであり、アウトレット（ 図2）。
- 任意のチャンネル穴を摂動ない、入口と出口の穴に垂直に整列させ、アクリルホルダー（ 図2）に両面粘着テープ片（幅5〜6ミリメートル）を配置します。チャンバーを作るために、マルチチャネル壁としてこれらのテープストリップを使用してください。ピペットチップを使用してテープをスクラブ。
- フェイスダウンPEG化側で、フローチャンバーを作るために上にPEG化されたカバースリップを置きます。
- 漏れる任意の溶液を防ぐために、両面テープが配置されている領域の上にカバーガラスの上部を押します。上部にある、ボトム（ 図2の黄色）でチャンバのエッジを閉じるには速乾エポキシ接着剤を追加します。
- ガスタイトシリンジにチューブ（外径、OD、0.042 "）の短い断片（2.5センチ）を接続し、エポキシ接着剤で接合部をシールします。
- 注射器にリンクされているチューブに、エポキシ接着剤で接合部をシールする：長いフレキシブルチューブ（0.03 "OD）を接続します。
- TUBI塗りつぶしngのDI水で注射器にリンクされています。空気の泡がないことを確認してください。
- エポキシ接着剤で封止しフローチャンバーの穴にチューブを挿入します。
- 貯水池などの他の穴に黄色の先端部（200μlの先端）を配置します。
フローチャンバー内に4.サンプルのロード
注：ニュートラアビジンは、ストレプトアビジンのような他のアビジンのタンパク質で置き換えることができます。それは言及されない限り、全ての反応は、室温で行うことができます。黄色の先端に試料液を取り、アクリルホルダーの穴（ 図2b）上に溶液で先端をインストールします。
- 50μl/分でシリンジポンプの流量を設定します。負荷アビジンタンパク質の20μlの（T50溶液中の25μgの/ mlで、10mMトリス、50mMのNaClを、pHを8）は、10分間それを維持します。
- 負荷ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド（1×TE中100μM）を20μl、10分間それを維持します。ターミナルトランスフェラーゼを使用する場合は、ロードをスキップオリゴデオキシヌクレオチドの。
- 10μl/分の流速でフローチャンバーへのステップ1からの負荷のDNA溶液20μlを、30分間それを維持します。
- 1×TEとフローチャンバーを洗浄し、FP-DBP 10（〜80 nM）を40μlのをロードします。
- 60X対物レンズに1×TEで染色する分子の連続的な流れと蛍光顕微鏡下でDNAを観察します。 FP（EGFP）-dbpの励起に488nmの固体レーザーを使用してください。 DNA分子の完全なストレッチのために、使用されるDNAの長さに応じて異なる流量を適用します。例えば、T4 DNAの166 kbpのためのλDNAの48.5 kbpの、そして100μl/分を50μl/分を適用します。
- アクリルホルダーのリサイクルのため、家庭用洗剤溶液12で組み立てフローチャンバーを浸します。かみそりの刃でテープとエポキシを削除し、それらを完全にオフに取るために手でこすります。注射針で穴を邪魔を除きます。さらに使用するまで脱イオン水にホルダーを保管してください。
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Representative Results
図1は、DNA分子の末端構造に応じて2つの異なるDNAテザリング方法を示している。 図1aは、スティッキーエンドのDNA分子は、アビジン被覆PEG表面上に固定化された補完的なビオチン化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている様子を示す。 図1bは、の追加を示していますビオチン化のddNTPまたはターミナルトランスフェラーゼによって平滑末端DNAの3 '水酸基へのdNTP。我々は、DNA分子とビオチン間の柔軟なリンカーを追加しました。これは、反応に十分なスペースを提供するために、連結およびアビジン-ビオチン結合効率を増加させた。 図1cはアビジンコートPEG表面上のDNAテザリングのための全体的な概略図を示しています。
図2は、アクリルホルダーと一緒にフローチャンバのアセンブリを示しています。 GLASに比べてS /石英スライドガラス、カスタムメイドのアクリルホルダーはエピ蛍光顕微鏡検査のためのフローチャンバの製造を単純化する。12フローチャンバは、酵素反応のための緩衝条件の瞬時変化を可能にする6およびDNA分子を延伸します。
図3は、FP-DBPで染色したシングル係留DNAとT4λDNAを示しています。マイクロ流体せん断は、次のような16.5ミクロンはと56.4ミクロン（T4 DNAが0.34nmでのxは166キロバイト）（48.5キロバイトλDNAは0.34nmでのX）全輪郭の長さにまで伸長し、単一のDNA分子を流れます。私たちは光開裂を起こさないFP-DBPを利用するので、私たちは、長時間（ 例えば、半時間）の間、DNAストレッチとリラクゼーションを複数回繰り返すことができました。
DNAテザリングの1模式図を図。 A）■tickyエンドのDNAをビオチン化相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせます。トリエチレングリコールは、オリゴヌクレオチドとビオチン間の柔軟なリンカーである。b）のビオチン化dNTPはターミナルトランスフェラーゼによって、二本鎖DNAの平滑末端に付加されています。ポリカーボンスペーサ（11原子）を共有ガラス表面に結合したビオチン化されたPEGに連結されているアビジンタンパク質に固定されたdNTP及びビオチン。C）ビオチン化DNAとの間の柔軟なリンカーです。通常のPEGへのビオチン化PEGの比率が0.025（1：40）であった。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2.フローチャンバー図。 A）アクリル酸系樹脂のホルダーからなるフローチャンバー、両面テープ、PEG化のストリップは、スリップカバー。寸法76ミリメートル×26ミリメートル×5ミリメートル（L×幅×H）のアクリルホルダーは、レーザー切断で作製したb）のフローチャンバーのサイドビューは：。穴は黄色の先端がためにインストールされている入口ポートであるパンチバッファ容器、シリンジポンプによって制御されるチューブに接続された出口ポート。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FP-DBPで染色し、延伸DNA分子の3蛍光顕微鏡画像を図。 a）は、バクテリオファージλDNAビオチン化相補的オリゴヌクレオチドとのライゲーション後の表面に繋留（48.5 kbpの）。b）のバクテリオファージT4 DNA（166 kbpの）ターミナルトランスフェラーゼを用いてビオチンを追加した後、表面につなが。示された矢印は、DNA moleculを表示しますESは、その全輪郭長T4 DNA用などのλDNAのための16.5ミクロンおよび56.4ミクロンまで延伸しました。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、表面上に固定するためにビオチン化長いDNA分子を可視化するためのプラットフォームを提示します。私たちは、ビオチン化ウシ血清アルブミンとアビジンタンパク質コーティングされた表面上の係留DNA分子のためのアプローチを報告している。6以前のアプローチでは、我々は上の係留DNA分子を染色ビス-インターカレーション染料によって引き起こされるDNAの光開裂の重要な問題を発見しました表面。これらの連続的励起フルオロフォアは、DNAリン酸骨格を攻撃する高い確率を有するように、9励起光のパワーは、光開裂を避けるために最小化されなければなりませんでした。
この不便さを克服するために、我々は、光開裂することなく、DNAを染色するためのDNA結合能（FP-DBP）で遺伝子操作された蛍光タンパク質を開発しました。10我々は、アビジン被覆タンパク質表面上の信頼性のDNA染色を観察しました。それにもかかわらず、このプラットフォームは、上の蛍光タンパク質の望ましくない凝集の別の問題がありました増加したバックグラウンドノイズを生じるタンパク質表面、。バックグラウンドからのDNAおよびタンパク質のコントラストを向上させるために単一分子DNA分析のため、このランダムノイズを最小化することが必須です。 FP-DBPの使用は、したがって、表面に吸着されるの蛍光タンパク質を防止するために、表面パッシベーションが必要です。 PEGは、この目的のための強力な候補である可能性があります。12したがって、我々は、表面上に係留FP-DBP染色されたDNA分子をイメージングするための劇的向上ビオチン化PEG、信号対雑音比を用います。
より高い収率のために、この方法にはいくつかの重要なステップと注意事項があります。ガラス表面上のDNA分子の末端をつなぐために、第一級アミン基は、図1に示すように、ビオチンPEGコーティングに続いてカバースリップ上にシラン化される。この表面パッシベーションプロセスがあるため、単一分子DNAのイメージングのために重要です大幅に表面上のノイズを発生するランダムな吸着を減少させることができます。そのため、一晩aminosilanizationおよびPEG化を強くお勧めします。また、ピラニア溶液でスライドガラスと同様にカバーガラスを清掃することはさらに、バックグラウンドノイズを低減することができます。
ビオチン化オリゴヌクレオチドは、大きなDNA分子の水酸基3 'にリンクするために、5'末端にリン酸基を有していなければなりません。ビオチン化オリゴヌクレオチドの配列は、5'-P-GGGCGGCGACCT-TEGビオチン-3 'λDNAテザリングのためです。 λDNA溶液はλDNAは、多くの場合、長期保存してコンカテマーを形成するために、（1.1を参照）λDNA溶液を調製した後すぐにロードされなければなりません。このようなT4 DNAなどの平滑末端DNAの場合は、ターミナルトランスフェラーゼは、任意の特異性なしに、DNAの両端にビオチン化dUTPsを追加することができます。したがって、ターミナルトランスフェラーゼ反応時間は、そうでなければ延長反応（ すなわち 、両端がビオチンで標識されている）、二重標識されたDNAを得ることができる、慎重に約1時間調整しなければなりません。アドオンでそのようなλとT4、DNAの任意の種類は、このプラットフォームで利用することができるようにウイルスDNAにition。しかし、そのようなのSwaIかのNotIなどのレアカッター制限酵素によって消化した後に巨大なゲノムDNAからの断片を使用することをお勧めします。
異なる流量は、DNAの異なる長さに適用されます。通常、より長いDNA分子は、完全に正確な輪郭長に一致するように、DNA分子を伸長する速い流速を必要とします。例えば、λDNAは、x 48502 bpの0.34 nmでの計算値に相当する、16.5ミクロンまで伸ばすことができます。
新鮮にすべての材料、タンパク質およびPEGの特にすべてを準備することは非常に重要です。例えば、ニュートラは容易にそれを希釈溶液として保存されている場合、ビオチンに結合するその機能を失います。 PEG溶液の場合、pHは、第一級アミンとN-ヒドロキシ官能基を結合させることが重要です。したがって、新鮮に毎週少なくともすべての材料を準備することをお勧めします。
表面につながれ、大きなDNA分子の可視化は、ゲノミクス、エピゲノミクス、DNAとタンパク質相互作用、および高分子物理学研究のための生化学的研究など様々な用途に適用される汎用性の高いプラットフォームです。しかしながら、このアプローチは、現在、ウイルスゲノムのような比較的単純でよく知られているDNA分子を用いてシステムをモデル化するためにのみ限定されます。ヒトゲノムとエピゲノムに拡張するためには、実用的な使用のために、堅牢で信頼性が高く、シンプルなプラットフォームを確立することが非常に重要です。光誘起DNAの光開裂を克服し、表面に蛍光タンパク質のランダムな吸着を防止することにより、このプラットフォームは、したがって、せん断流れと伸長DNAのための明確かつ高コントラストの画像を提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulfuric acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95% Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35% in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99% Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9% Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9% Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99% Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76 mm x 26 mm x 1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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