Summary
يصف هذا البروتوكول الكمي السريع وحساسة للغاية من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بيانات الاستشعار باستخدام المحمولة محلل الحنق حسب الطلب. تم استخدام جهاز لكشف المالتوز ضمن نطاق درجة الحرارة الأهمية بمكان أن يزيد حساسية الكشف، مما يتيح تقييم عملي وفعال من محتوى السكر.
Abstract
التحسينات التي حدثت مؤخرا في فورستر نقل الطاقة الرنين مكنت (الحنق) أجهزة الاستشعار استخدامها للكشف عن جزيئات صغيرة مختلفة بما في ذلك الأيونات والأحماض الأمينية. ومع ذلك، فإن الفطرية ضعف كثافة إشارة من أجهزة الاستشعار الحنق هو التحدي الرئيسي الذي يمنع تطبيقها في مختلف المجالات، ويجعل من استخدام مكلفة، الراقية الفلورية اللازمة. سابقا، قمنا ببناء فعالة من حيث التكلفة وعالية الأداء محلل الحنق التي يمكن قياس على وجه التحديد نسبة اثنين من الانبعاثات العصابات الطول الموجي (530 و 480 نانومتر) لتحقيق حساسية الكشف عالية. وفي الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أن أجهزة الاستشعار الحنق مع البروتينات ملزمة محيط بالجبلة البكتيرية كشف بروابط مع أقصى قدر من الحساسية في نطاق درجات الحرارة الحرجة من 50 - 55 درجة مئوية. ويصف هذا التقرير بروتوكول لتقييم محتوى السكر في عينات المشروبات المتاحة تجاريا باستخدام لدينا المحمولة محلل الحنق مع جهاز استشعار الحنق-درجة حرارة معينة. وأظهرت نتائجنا أن التسخين الإضافيعملية استشعار الحنق يزيد بشكل كبير من الحنق نسبة الإشارة، إلى تمكين قياس أكثر دقة من محتوى السكر. طبقت الحنق محلل حسب الطلب وأجهزة الاستشعار بنجاح لقياس نسبة السكر في ثلاثة أنواع من المشروبات التجارية. ونحن نتوقع أن المزيد من خفض حجم وأداء تعزيز المعدات وتسهيل استخدام تحليل باليد في بيئات حيث المعدات الراقية لم يعد متوفرا.
Introduction
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) وقد استخدم على نطاق واسع الاستشعار البيومترية للكشف عن جزيئات صغيرة مثل السكريات، وأيونات الكالسيوم، والأحماض الأمينية 1-4. أجهزة الاستشعار الحنق تحتوي على البروتينات الفلورية، البروتينات الفلورية السماوي (CFPs)، والبروتينات الفلورية الصفراء (YFPs)، والتي تنصهر فيها لطرفي البروتينات ملزم محيط بالجبلة (PBPs). السكريات ربط لPBPs تقع في منتصف استشعار الحنق، مما تسبب في تغييرات هيكلية لأجهزة الاستشعار التي تغير بعد ذلك التوجه المسافة والانتقال ثنائي القطب من اثنين من البروتينات الفلورية إما في نهاية PBPs. هذا التغيير يسمح التحليل الكمي للمحتوى السكر عن طريق قياس نسبة انبعاث موجات من EYFP (530 نانومتر) وECFP (480 نانومتر). ونظرا لحساسية عالية، والنوعية، والقدرة على رصد في الوقت الحقيقي، وزمن الاستجابة السريعة لهذه الأجهزة الحنق، وتستخدم هذه المجسات على نطاق واسع في التطبيقات البيئية والصناعية والطبية 5. وعلاوة على ذلك، ratiomقياس etric باستخدام أجهزة الاستشعار الحنق له فوائد عملية مهمة، كما أنها يمكن أن تستخدم لقياس المكونات في العينات البيولوجية المعقدة حيث تركيز استشعار لا يمكن السيطرة عليها بسهولة ومضان الخلفية هي دائما موجودة.
وعلى الرغم من هذه المزايا من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالتصور الكمي، والتغيرات الهيكلية صغيرة مع نطاق ناقصة حركة نقل إلى البروتينات الفلورية تنتج ضعيفة بطبيعتها كثافة الإشارة. هذه الإشارة الضعيفة تحد من تطبيق الاستشعار مقرها الحنق لفي المختبر أو في تحليل الجسم الحي (6). ونتيجة لذلك، فإن معظم الحنق أجهزة الاستشعار تتطلب استخدام معدات باهظة الثمن وحساسة للغاية. سابقا، وضعنا محلل الحنق غير مكلفة والمحمولة مع قدرات مماثلة لتلك التي تحليل مضان القائمة 7. في هذا الجهاز، وغير مكلفة 405 نانومتر الفرقة فوق البنفسجية التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED) كان يستخدم كمصدر للضوء أن يسبب الإثارة من اله إشارة مضان، لتحل محل مصباح مكلفة أو الليزر. نظام الكشف عن محلل تركز بكفاءة إشارة تشتيت مضان على اثنين من أجهزة الاستشعار البصرية مع الثنائي الضوئي السيليكون. في دراسة حديثة، أظهرنا أن التحسين من درجة حرارة كشف في 50 - 55 درجة مئوية يمكن أن تضخيم كبير في ratiometric إشارة الحنق 8. هذا التعزيز إشارة درجة حرارة معينة، جنبا إلى جنب مع الحنق محلل حسب الطلب، يمكن استخدام أجهزة الاستشعار الحنق في التطبيقات التشخيصية أكثر عمومية مع حساسية السريعة والعالية.
في هذا البروتوكول، أثبتنا انطباق العام للمحلل الحنق في ظل ظروف درجة الحرارة المثلى الحنق عن طريق قياس كمية السكر من المشروبات المتاحة تجاريا. وينص هذا البروتوكول على تفاصيل العملية جهاز الحنق، وكذلك وصفا موجزا من أجهزة الاستشعار وإعداد العينات. ونحن نتوقع أن هذا التقرير سيعزز إمكانية تطبيق المحمولةمحلل في بيئات المختبرات الصغيرة وتوفير أساس لمزيد من تطوير جهاز غير مكلف في الموقع التشخيص مع أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد جهاز الاستشعار البيولوجي
- بناء البلازميد pET21a (+) - الحراجية المعتمدة ب ب-YFP-His6 باتباع بروتوكول المعمول به سابقا-2.
- تطعيم 5 مل من مرق لوريا (LB) مع مستعمرة واحدة من سلالة كولاي DE3 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز.
- نقل 1 مل من O / N الثقافة في قارورة 500 مل تحتوي على 100 مل LB واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) تصل 0.5 (حوالي 3 ساعات).
- حصاد الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل بواسطة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية بسرعة في كل أنبوب بالماء 50 مل الجليد الباردة المقطر (DW) وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من DW-الجليد الباردة مع 10٪ (ت / ت) الجلسرين من قبل يحوم بلطف حتى الحل (خلايا electrocompetent) تصل إلى 600 OD
- وضع خليط من خلايا electrocompetent (50 ميكرولتر من الخلايا في أحد OD 600 من 100) و 10 نانوغرام من البلازميد pET21a (+) - الحراجية المعتمدة ب ب-YFP-His6 في كفيت electroporation المثلج في جهاز Electroporation للوelectroporate خليط (18 كيلو فولت / سم، 25 μF).
- بسرعة إضافة 1 مل SOC المتوسط وكفيت وresuspend الخلايا برفق، تليها الانتعاش عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز لطيف في 15 مل أنبوب جولة القاع.
- انتشار الخلايا على لوحة LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
- عزل مستعمرة واحدة باستخدام حلقة وتطعيم مستعمرة في 10 مل من LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند 37 درجة مئوية في شاكر لمدة 12 ساعة.
- إضافة 5 مل من ثقافة البذور إلى 500 مل من LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية اهتزاز الحاضنة.
- إضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-thiogalactoside (IPTG) عند الروافد OD 6000.5 واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية اهتزاز الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- الطرد المركزي الخلايا في 4500 × ز لمدة 20 دقيقة (4 درجة مئوية) وإزالة بلطف طاف.
- Resuspend وبيليه في 5 مل العازلة ملزمة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم PMSF، 0.5 ملي EDTA، و1 ملم DTT).
- يصوتن الخلايا على الجليد مع ستة انفجارات 10 ثانية على 200-300 W، بعد كل انفجار مع 10 ثانية من التبريد.
- الطرد المركزي المحللة في 10000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوي. نقل طاف (البروتين القابلة للذوبان) في أنبوب المجموعة الجديدة.
- لتحقيق تنقية تقارب من البروتينات استشعار الحنق، تحميل 4 مل من المحللة خلية مسح على عمود النسب ني NTA (حجم 5 مل) وإجراء فحص اللوني باستخدام بروتين سريع اللوني السائل (FPLC) 18.
- غسل العمود مرة واحدة مع خمسة مجلدات عمود من غسل العازلة الأول (50 ملي العازلة الفوسفات، و 300 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 7.0).
- كرر الخطوة غسل مع خمسة مجلدات عمود من غسل العازلة الثاني (50 ملي العازلة الفوسفات، و 300 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 7.0).
- أزل البروتين الاستشعار مع خمسة مجلدات عمود من شطف العازلة (50 ملي العازلة الفوسفات، و 300 ملي كلوريد الصوديوم، و 500 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 7.0).
- على التركيز وتحلية العينة مزال، وملء المكثف (حجم الغشاء من 10،000 ميجاوات) مع ما يصل إلى 20 مل من عينة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 × ز. إعادة ملء المكثف مع المالحة الفوسفات 0.8٪ (PBS). كرر هذه الخطوة مرتين، أولا ملء المكثف مع 20 مل من العينة، ومن ثم إعادة تعبئتها مع برنامج تلفزيوني.
- استعادة المركز والمملحة دي البروتين أجهزة الاستشعار وتخزينه في -80 درجة مئوية.
2. قياس محتوى السكر باستخدام محلل الحنق
ملاحظة: تفاصيل بناء محلل الحنق وصفت في عملنا السابق 7.
- إعداد محلول الكشف عن 0.8٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2ميكرومتر من البروتينات الاستشعار.
- تشغيل محلل الحنق. اضغط على زر "UP" لمدة 2 ثانية لمعايرة درجة الحرارة المثلى. ضبط درجة الحرارة إلى 53 درجة مئوية باستخدام الزرين و "UP" "القاعدة" واضغط على زر "SET".
- لمعايرة، اضغط مع الاستمرار على "UP" وأزرار "القاعدة" في وقت واحد لمدة 2 ثانية. تأكد من أن يعرض لوحة LED "CALIB" واضغط على زر "SET".
- وضع 12.5 × 12.5 × 45 ملم (طول × عرض × ارتفاع) مستطيلة سفينة متوازي (كوفيت) تحتوي على برنامج تلفزيوني فقط العازلة في حامل كوفيت للمحلل واضغط على زر "SET".
- استبدال كفيت واحدة تحتوي فقط على حل كشف (انظر 2.1) بدون سكر (المالتوز / السكروز) واضغط على زر "SET" لمعايرة الأساس.
- استبدال كفيت مع واحدة تحتوي على الحل الكشف مع 10 ملي السكر والضغط على "SET"زر.
- لتحديد محتوى السكر لعينة المشروبات، ووضع 1 مل شراب عينة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 16000 × ز لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: قياس مضان المستند إلى مستشعر-الحنق لديه ميزة لا تتطلب الخاصة قبل المعالجة من العينة لأن 1٪ فقط (ت / ت) من العينة يتم تضمينها في الحجم الكلي. ومع ذلك، فإننا نوصي إزالة أي مواد قد تؤثر على قياس مضان (على سبيل المثال، خلايا، جزيئات غير قابلة للذوبان، الدهون، والدهون، أو أي مادة مع تألق ذاتي). وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان حمض قوي، وقاعدة قوية، عامل التنظيف (المنظفات)، أو وكيل الاستحلاب (مستحلب) موجود بتركيز عالي و قد تؤثر على خصائص أجهزة الاستشعار البيولوجي الحنق، يجب إزالته باستخدام المذيبات العضوية أو التعادل. على سبيل المثال، عندما يتم التخلص من الدهون ومنتجات الألبان والمستحلبات من الوجبات الخفيفة المجمدة، وطرد العينات في أنبوب microfuge في 16000 × ز لمدة 30 دقيقة، وبين هذا وذاك السائلن يتم استخراج رواسب القاع والطبقة العليا من الدهون الألبان. ثم يتم إضافة مبلغ مساو من الهكسان، تليها الطرد المركزي في 15000 × ز لمدة 30 دقيقة للقضاء على الدهون. - إزالة طاف مع حقنة 1 مل وتصفية من خلال مرشح حقنة (حجم المسام 0.2 ميكرون).
- ضع 0.1 مل تصفيتها عينة المشروبات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 0.9 مل برنامج تلفزيوني ودوامة بلطف.
ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن نعمل على تخفيف عينة المشروبات بشكل صحيح. في هذه الحالة، تم تنفيذ التخفيف 1000 أضعاف ذلك أن تركيز السكر تندرج ضمن النطاق الديناميكي للجهاز. نوصي تقدير تركيز السكر الهدف في وقت مبكر عن طريق اشارة الى محتوى السكر في التسمية من المشروبات. - إضافة 5 ميكرولتر من عينة المشروبات المخفف (1٪، ت / ت) لكفيت تحتوي على 0.495 مل من محلول الكشف.
- ضع كفيت في حامل كوفيت للمحلل الحنق وتسخين محلول العينة إلى 53 درجة مئوية.
- اضغط على زر "SET" لقياس محتوى السكر.
ملاحظة من الممكن لتقييم قياس الحنق باستخدام قارئ لوحة multilabel أو معمل مضان مجهزة مع جهاز بلتيير التحكم في درجة حرارة من خلال قراءة هذه النسبة 488/535 نانومتر 7،8. للكشف عن السكروز، اتبع الخطوات 1،1-2،12 مع جهاز استشعار CSY-LH 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإجراء التحليل الكمي للمحتوى السكر باستخدام محلل الحنق، فمن الضروري لبناء منحنى المجهزة تقدير تركيز السكر الهدف من نسبة الحنق ملاحظتها. السماح ص تحديد نسبة كثافة انبعاث CFP في 480 نانومتر، وكثافة الانبعاثات من YFP ولدت في 530 نانومتر (المعادلة 1).
منحنى الاستجابة للجرعة من جهاز الاستشعار البيولوجي الحنق (CMY-BII في 53 ° C) يمكن أن تتولد من خلال مراقبة نسبة الحنق، ص، في تركيزات السكر المختلفة. ويمكن بعد ذلك أن أعرب عن منحنى كما منحنى السيني على شكل S على النحو التالي:
= "1"> حيث r ماكس و r دقيقة تمثل نسبة الإشارة مع تركيزات السكر 0 والمشبعة (1000 ميكرومتر)، على التوالي في الصفحة؛ العاشر 0 يمثل تركيز السكر في استجابة 50٪. ويمثل ص المنحدر من الاستجابة، التي هي قريبة إلى 1 أو -1. في هذه الدراسة، ص كحد أقصى، ص دقيقة، س 0، و p هي 4.256، 2.672، 71.779، و 1 على التوالي. تم استخدام مجموعة تركيز من 1 ميكرومتر إلى 1000 ميكرومتر في النموذج المناسب.
باستخدام معادلات 1 و 2، وكان كميا محتوى السكر من المشروبات commercially- المتاحة مع محلل الحنق. تم فحص اثنين من أجهزة الاستشعار الحنق المالتوز لاختبار إشارة، ص، اعتمادا على مختلف درجات الحرارة 2،8. أجهزة الاستشعار الحنق الأول، CMY-0، هو استشعار القائم على الحنق الأساسية التي تتكون من CFP، ملزم المالتوز بروتين (ب ب)، وYFP، مع نس الببتيدات رابط. أجهزة الاستشعار الثاني، CMY-BII، ويحتوي على رابط سر والارجنتين بين MBP واثنين من البروتينات مضان 2. كما يبين الشكل 1A، ليس لوحظ CMY-0 في درجات الحرارة قياس أقل من 50 درجة مئوية، كما لا يوجد فرق إشارة بين 0 و 1 ملي تركيز المالتوز. الخلافات إشارة كل من الحنق وتعظيم أجهزة استشعار ما بين 50 و 55 درجة مئوية (الشكل 1) 8. من أجل تحديد كمية السكر من ثلاثة أنواع من المشروبات المتاحة تجاريا، وإنشاء منحنى الاستجابة للجرعة من أجهزة الاستشعار CMY-BII في 53- درجة مئوية وقد تم تحديد (الشكل 2A) ومحتوى مالتوز من العينات الثلاث تحويل نسبة الحنق في تركيز المالتوز.
كما يتم أخذ عينات من الحبوب مثل الأرز والشعير، والتي هي مصادر المالتوز الهامة، كان من المتوقع أن تحتوي على محتوى مالتوز عالية نسبيا العينة (متوسط 11،892 جم / 235 مل) ( 
الشكل 1. الحنق الإشارة الفرق بين 0 و 1 ملم المالتوز باستخدام محلل الحنق في درجات الحرارة المختلفة. (A) وأظهر استشعار CMY-0 لا فرق إشارة بتركيزات مختلفة المالتوز في درجات حرارة أقل من 50 درجة مئوية. (ب) CMY-BII كان قادرا على تمييز الفرق إشارة الحنق بين المالتوز 0 و 1 ملم في مجموعة واسعة من درجات الحرارة أجهزة الاستشعار. في كلتا الحالتين، والفرق إشارة زادت بشكل كبير في درجة حرارة تتراوح معين (50-55 درجة مئوية). البريدالحانات rror تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
وكميا الشكل 2. المالتوز الكمي المحتوى في المتاحة تجاريا المشروبات. (A) منحنى ثلاثة الجرعة والاستجابة لCMY-BII. (ب) محتوى مالتوز من ثلاث عينات المشروبات. لاحظ أن "السكر الكلي" يشير إلى كمية من كل السكر (بما في ذلك المالتوز) ذكرت من قبل الشركة المصنعة المشروبات على الملصق المشروبات. شريط خطأ يشير الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح هذا البروتوكول الكمي السريع والفعال للمحتوى السكر في عينات المشروبات، وذلك باستخدام حسب الطلب الحنق محلل 7 في درجة حرارة مثلى لأجهزة الاستشعار الحنق. وقد تم تصميم محلل مع الآونة الأخيرة نموا، وغير مكلفة 405 نانومتر الفرقة الأشعة فوق البنفسجية الصمام كمصدر للضوء واثنين من أجهزة الاستشعار البصرية مع الثنائي الضوئي السيليكون. هذا الجهاز هو أكثر من الفلورية مقارنة الآخر فعالة من حيث التكلفة. أظهر الجهاز حساسية الكشف عالية، وتحديدا عند قياس نسبة شريطين الطول الموجي الانبعاثات (530 نانومتر و 480 نانومتر) في مجموعة ودرجة الحرارة المثلى لأجهزة الاستشعار الحنق. كانت حساسيته وشدة في الكشف عن السكريات المختلفة متفوقة على تلك جهاز مضان طيفي 7.
الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لدعم تطبيق واسع من أجهزة الاستشعار القائم على الحنق مع الحنق محلل حسب الطلب. بينما محلل يقيس بشكل غير مباشر محتوى السكر عن طريق أجهزة استشعار الحنق، طر من الواضح أن الجهاز يتضمن عددا من الفوائد من أجهزة الاستشعار الحنق، بما في ذلك تمديد نطاق واسع خصوصية وراثيا يجند، تصميم وحدات، وإشارات مستقلة تركيز أجهزة الاستشعار، والاستهداف الدقيق للجزيئات صغيرة التحت خلوية. وتستخدم أجهزة استشعار الحنق فعلا للكشف عن مجموعة واسعة من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك أيونات 9، الهيم 10، وغيرها. وعلاوة على ذلك، أكثر من 20 نوعا من بنيات الحنق يمكن العثور عليها بسهولة، وأمرت من خلال الإيداع غير ربحية AddGene 11.
وعلى الرغم من تطبيق واسع للمحلل الحنق، هناك نوعان من القضايا الرئيسية مع تشغيل الجهاز. أولا، لأن تشغيل الجهاز هي بسيطة نسبيا، عينة تجهيزها هو الخطوة الحاسمة التي تؤثر على نوعية الكشف، إلا في حالات عطل الجهاز. في هذا البروتوكول، وكانت خطوة واحدة (عينة تمييع) كافية لمعالجة العينات السائلة التي كانت شفافة بشكل واضح ولا تحتوي على أي حزب غير قابلة للذوبانجسيمات. ومع ذلك، وعينات أخرى قد تتطلب معالجة إضافية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان، مثل المكونات الخلوية أو الدهون. أي الجسيمات autofluorescent التي يمكن أن تؤثر على إشارة الحنق كما ينبغي إزالتها، كما لوحظ التالية الخطوة 2.7. ثانيا، لا بد من التصدي لها، كما هو الحال مع جميع أنواع نقطة الرعاية السريرية (POCT) الأدوات 12 مراقبة الجودة والربط التواصل مع نظم المعلومات المستشفى. منذ جودة الإشارة للمحلل الحنق يعتمد إلى حد كبير على نوعية من أجهزة الاستشعار الحنق وعلى خطوات تجهيزها، يطلب تفتيش منتظمة لمراقبة الجودة لضمان قياسات تبقى ضمن نطاق الإشارة القياسية لتحليل البيانات ومراقبة الجودة العادية. وينبغي التحقيق في استقرار استشعار الحنق وفترة التخزين، وكلاهما ضروري لمزيد من التطبيقات الموثوقة، خلال عمليات التفتيش ومراقبة الجودة. يمكن وضع مبادئ توجيهية وتطوير البرمجيات المناسبة أيضا أن أتطرق إلى الحد الاتصال. الإصدارات الحالية منوقد تم تجهيز محلل الحنق مع اتصال RS232 للسيطرة على سطر الأوامر عن بعد، لكن الاتصالات اللاسلكية قد تكون سمة من سمات الإصدار التالي من محلل، والتي سيكون لها واجهة محسنة لنظم المعلومات المستشفى.
ومع ذلك، فقد تم تصميم أجهزة الاستشعار الحنق لخصوصية الركيزة، وهو نهج يسمح عادة أوسع خصوصية 2. وبالتالي، فإن إشارة الحنق قد تواجه تدخلا غير مقصود من المكونات الأخرى، بما في ذلك أنواع أخرى من السكريات في المشروبات التجارية. يجب أن التحقيقات مزيد من استكشاف كيفية استشعار الحنق الرد على خليط من مختلف السكر لتحديد دقيق لكمية من السكر. وبالتعاون مع الشركات التي تنتج المشروبات تساعد على تأكيد محتوى السكر لمعايرة للمحلل الحنق.
ومن المتوقع أن الجهاز الحنق المحمولة المقترحة مع مختلف أجهزة الاستشعار الحنق وسوف تستخدم في تطبيقات POCT. يستخدم POCT لتقييم الحمل، والدممستويات الجلوكوز والبروتينات العلامات البيولوجية والبكتيريا المعدية، والفيروسات المعدية. طرق POCT لها مهل سريعة وعموما يحمل معدلات الخطأ منخفضة نظرا لقلة عدد خطوات المعالجة. وهذه هي مزايا هامة من POCT على نهج اختبار المختبر المركزي. وقد جذبت أجهزة POCT المحمولة باليد، مثل الجهاز الموصوفة هنا، اهتماما متزايدا بسبب التطبيقات المحتملة في تقييم الأغذية ومراقبة نسبة السكر في الدم. على وجه الخصوص، ورصد الجلوكوز من عينات الدم في المرضى الذين يعانون من مرض السكري يتطلب السريع، ودقيقة، وفعالة من حيث التكلفة طريقة POCT 13. بعد فريق البحث أميس وضعت أول السكر في الدم شريط الاختبار في عام 1965 (باستخدام الشريط الذي يحتوي على الجلوكوز أوكسيديز)، واقترحت العديد من التقنيات لأغراض مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم 12. محلل الحنق متاح أيضا للكشف عن الجلوكوز في عينات الدم مع تجهيزها المناسب من الدم ومحيط بالجبلة protei ملزم الجلوكوزن (MglB) 14 المستندة الحنق البروتين.
وهناك حاجة بسيطة، طرق سريعة لتقييم جودة الأغذية. ويرتبط استهلاك المشروبات التي تحتوي على السكر مع مجموعة متنوعة من الأمراض والمتلازمات، مثل مؤشر زيادة كتلة الجسم في الطفولة 15، والسمنة لدى الأطفال 16، وخطر السكتة الدماغية 17. فهم هذا الصدد يتطلب القياس الدقيق لمكونات السكر في المشروبات. ولذلك، فإن الجلوكوز والفركتوز تركيزات من المشروبات ذات أهمية للعلماء المعنية بصحة الإنسان. يوضح هذا البروتوكول أداء حساسة للغاية للمحلل الحنق مع التحكم في درجة الحرارة المثلى. ويمكن استخدام الجهاز مع مختلف أجهزة استشعار للكشف عن الحنق molecules- صغيرة مختلفة بما في ذلك الجلوكوز والفركتوز 14،15. لدينا جهاز محمول والقابلة لإعادة الشحن، والتي لها عمر البطارية من 10-20 ساعة، اعتمادا على بروتوكول التدفئة، ينطبق على POCT. البسيط ماك بروتوكول تنفيذيوفاق الجهاز وسهلة الاستخدام، ويلغي الحاجة لتدريب الموظفين تعقيدا. مع التحسينات التقنية، بما في ذلك الحد من حجم المعدات، والتقليل من خطوات المعالجة، وتحديد المتطلبات العملية للاستخدام الميداني، وهذا الجهاز تعزيز التنمية أبحاث مقرها الحنق في بيئات المختبرات على نطاق صغير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مركز علم الأحياء الاصطناعية الذكية من المشروع العالمي الحدودي (2011-0031944) وبرنامج مبادرة بحوث KRIBB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).
