Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer

Published: October 1, 2016 doi: 10.3791/54144
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver den raske og svært sensitive kvantifisering av Förster resonans energi overføring (FRET) sensordata ved hjelp av en skreddersydd bærbar FRET analysator. Anordningen ble benyttet for å detektere maltose innenfor et kritisk temperaturområde som maksimerer følsomhet, slik at praktisk og effektiv vurdering av sukkerinnhold.

Abstract

Nylige forbedringer i Förster resonans energi overføring (FRET) sensorer har aktivert deres bruk for å påvise ulike små molekyler inkludert ioner og aminosyrer. Imidlertid er medfødt svak signalintensiteten av FRET sensorer en stor utfordring som hindrer deres anvendelse på forskjellige områder, og gjør bruken av dyre, high-end fluorometers nødvendig. Tidligere har vi en kostnadseffektiv, høy ytelse FRET analysator som spesifikt måle forholdet mellom to bølgelengdebånd utslipp (530 og 480 nm) for å oppnå høy følsomhet. Mer nylig ble det oppdaget at FRET sensorer med bakteriell periplasmatiske bindingsproteiner påvise ligander med maksimal følsomhet i det kritiske temperaturområde på 50 - 55 ° C. Denne rapporten beskriver en protokoll for vurdering av sukkerinnhold i kommersielt tilgjengelige drikke prøver å bruke våre bærbare FRET analysator med en temperatur-spesifikk FRET sensor. Våre resultater viste at den ytterligere forvarmingFremgangsmåten ifølge fore FRET sensoren øker betydelig FRET forholdet signal, for å muliggjøre mer nøyaktig måling av sukkerinnhold. Den skreddersydde FRET analysator og sensor ble vellykket anvendt for å kvantifisere sukkerinnholdet i tre typer kommersielle drikker. Vi forventer at ytterligere størrelsesreduksjon og ytelse forbedring av utstyret vil forenkle bruken av håndholdte analysatorer i miljøer hvor high-end utstyr er ikke tilgjengelig.

Introduction

Förster resonans energioverføring (FRET) har blitt mye brukt som en biometrisk sensor for å detektere små molekyler slik som sukkere, kalsiumioner, og aminosyrer 1-4. FRET biosensorer inneholder fluorescerende proteiner, cyan fluorescerende proteiner (CFPS) og gul fluorescerende proteiner (YFPs), som er kondensert til begge ender av periplasmatiske bindende proteiner (PBP). Sukker binde til PBP som befinner seg i midten av FRET sensoren, forårsaker strukturelle endringer i den sensor som senere forandre avstanden og overgangen dipol orientering av de to fluorescerende proteiner ved hver ende av PBP. Denne endringen muliggjør kvantitativ analyse av sukkerinnhold ved å måle forholdet mellom emisjonsbølgelengder av EYFP (530 nm) og ECFP (480 nm). På grunn av den høye følsomheten, spesifisitet, sanntids overvåking kapasitet og rask responstid på FRET biosensorer, er disse sensorene mye brukt i miljømessige, industrielle og medisinske applikasjoner 5. Videre ratiomferometrisk måling ved hjelp av FRET biosensorer har viktige praktiske fordeler, ettersom den kan brukes til å måle komponenter i komplekse biologiske prøver hvor sensoren konsentrasjonen ikke lett kan kontrolleres og bakgrunnsfluorescens alltid er til stede.

Til tross for disse fordeler med FRET-baserte sensorer for kvantitativ visualisering, små strukturelle endringer med ufullstendig domene bevegelsesoverføring til de fluorescerende proteiner frembringe iboende svake signalintensitet. Det svake signalet begrenser anvendelsen av FRET-baserte sensorer for in vitro eller in vivo analyse 6. Følgelig har de fleste FRET biosensorer krever bruk av dyre og svært sensitivt utstyr. Vi har tidligere utviklet en rimelig og portabel FRET analysator med kapasiteter som ligner på de eksisterende fluorescens-analyse 7. I denne anordning, billig 405-nm bånd ultrafiolett lys-emitterende diode (LED) ble anvendt som lyskilde for å forårsake eksitasjon av the fluorescens signal, og erstatte en dyr lampe eller laser. Deteksjonssystemet på analysatoren fokuserer effektivt dissipating fluorescens signal på to photodetectors med en silisiumfotodiode. I en nyere studie viste vi at optimalisering av deteksjon temperatur på 50 - 55 ° C kunne gi en betydelig foredle proporsjonal FRET signal åtte. Denne temperaturen spesifikt signal forsterkning, sammen med skreddersydde FRET analysator, muliggjør bruk av FRET sensorer i mer generelle diagnostiske applikasjoner med rask og høy følsomhet.

I denne protokollen, demonstrerte vi den generelle anvendelighet av den FRET analysatoren under optimale FRET temperaturbetingelser ved å kvantifisere sukkerinnholdet i kommersielt tilgjengelige drikkevarer. Denne protokollen gir detaljene FRET anordning drift, samt en kort beskrivelse av sensor og prøvepreparering. Vi forventer at denne rapporten vil fremme potensialet anvendelsen av den bærbareanalysator i småskala laboratoriemiljøer og gi et grunnlag for videre utvikling av et billig på stedet diagnostisk enhet med FRET-baserte biosensorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Biosensor

  1. Konstruere plasmidet pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 ved å følge den tidligere etablerte protokoll 2.
  2. Inokulere 5 ml Luria-buljong (LB) med en enkelt koloni fra en Escherichia coli-stamme DE3 og inkuber ved 37 ° C i 16 timer med risting.
  3. Overføre 1 ml av O / N kultur til en 500 ml kolbe inneholdende 100 ml LB og inkuber ved 37 ° C i en risteinkubator inntil den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) når 0,5 (ca. 3 timer).
  4. Høste cellene i et 50 ml konisk rør ved sentrifugering ved 1000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
  5. Resuspender pelleten hurtig i hvert rør med 50 ml iskaldt destillert vann (DW) og sentrifuger ved 1000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
  6. Resuspender pelleten i 50 ul iskald DW med 10% (v / v) glycerol ved forsiktig virvling inntil oppløsningen (elektrokompetente celler) når en OD600
  7. Plasser blandingen av elektrokompetente celler (50 pl av cellene ved en OD 600 på 100) og 10 ng av plasmidet pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 i en iskald elektroporering kyvette i et electroporation anordning og electroporate blandingen (18 kV / cm, 25 uF).
  8. Raskt legge 1 ml SOC-medium til kyvetten og resuspender cellene forsiktig, fulgt av utvinning ved 37 ° C i 1 time med forsiktig risting i en 15 ml rundbunnet rør.
  9. Spre cellene på en LB-plate inneholdende 100 ug / ml ampicillin og inkubert ved 37 ° C i 12 timer.
  10. Isolere en enkeltkoloni ved hjelp av en løkke og inokulere kolonien i 10 ml LB inneholdende 100 ug / ml ampicillin ved 37 ° C i et risteapparat i 12 timer.
  11. Tilsett 5 ml av podekulturen på 500 ml LB inneholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes kulturen i en 37 ° C risteinkubator.
  12. Legg 0,5 mm isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG) når OD 600 delene0,5 og inkuberes kulturen i en 37 ° C rysteinkubator i 24 timer.
  13. Sentrifuger cellene ved 4500 x g i 20 minutter (4 ° C) og fjern supernatanten forsiktig.
  14. Resuspender pelleten i 5 ml bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA og 1 mM DTT).
  15. Sonikere cellene på is med seks 10-sekunder serier på 200-300 W, etter hver skur med 10 sek avkjøling.
  16. Sentrifuger løsningen ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for å pelletere cellerester. Overfør supernatanten (løselig protein) inn i en ny samling rør.
  17. For å oppnå affinitetsrensing av de FRET sensor proteinene, last 4 ml av erte cellelysat på en Ni-NTA affinitetskolonne (5-ml volum), og utføre en kromatografi-analyse ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) 18.
  18. Vask kolonnen en gang med fem kolonnevolumer av vaskebufferen I (50 mM fosfatbuffer, 300 mM natriumklorid, 10 mM imidazol, pH 7,0).
  19. Gjenta vasketrinn med fem kolonnevolumer av vaskebufferen II (50 mM fosfatbuffer, 300 mM natriumklorid, 20 mM imidazol, pH 7,0).
  20. Eluer sensor protein med fem kolonnevolumer av elueringsbuffer (50 mM fosfatbuffer, 300 mM natriumklorid, 500 mM imidazol, pH 7,0).
  21. Å konsentrere og avsalte den eluerte prøve, og fyll-konsentrator (membran størrelse på 10.000 MW) med opp til 20 ml av prøven og sentrifuger i 10 min ved 3000 x g. Refill konsentrator med 0,8% fosfat-bufret saltvann (PBS). Gjenta dette trinnet to ganger, først fylle konsentrator med 20 ml prøve, og deretter påfylling med PBS.
  22. Gjenopprette den konsentrerte og de-saltet sensor protein og lagre det ved -80 ° C.

2. Måling av sukkerinnhold ved hjelp av FRET Analyzer

MERK: Detaljene i FRET analysator byggingen ble beskrevet i vår tidligere arbeid 7.

  1. Forbered en deteksjon løsning på 0,8% PBS som inneholder 0,2uM av sensor proteiner.
  2. Slå på FRET analysator. Trykk på "UP" knappen i 2 sekunder for å kalibrere optimal temperatur. Still temperaturen til 53 ° C ved hjelp av "opp" og "ned" -knappene og trykk på "SET" knappen.
  3. For kalibrering, trykk og hold "UP" og "DOWN" knappene samtidig i 2 sek. Kontroller at LED skjermer "CALIB" og trykk på "SET" -knappen.
  4. Plasser en 12,5 × 12,5 × 45 mm (lengde x bredde x høyde) rektangulært parallellepiped fartøy (kyvette) som bare inneholder PBS buffer i en kyvette innehaver av analysatoren og trykk på "SET" -knappen.
  5. Bytt kyvetten med en som bare inneholder deteksjon løsning (se 2.1) uten sukker (maltose / sukrose), og trykk på "SET" for å kalibrere grunnlinjen.
  6. Bytt kyvetten med en som inneholder deteksjon løsning med 10 mM sukker og trykk på "SET"knapp.
  7. For å bestemme sukkerinnholdet av en drikk prøve, sette 1 ml drikk prøven i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 16 000 x g i 1 min.
    MERK: FRET sensorbaserte fluorescens måling har den fordel at ikke krever spesiell forbehandling av prøven fordi bare 1% (v / v) av prøven som inngår i det samlede volum. Vi anbefaler imidlertid å fjerne materiale som kan påvirke fluorescens målingen (f.eks celler, uoppløselige partikler, lipid, fett, eller noe materiale med autofluorescence). I tillegg, hvis en sterk syre, sterk base, rengjøring middel (rensemiddel) eller et emulgeringsmiddel (emulgator) er tilstede i en høy konsentrasjon og kan påvirke egenskapene til den FRET biologisk sensor, bør det fjernes ved hjelp av et organisk løsningsmiddel eller en Neutralizer. For eksempel, når meieri fett og emulgatorer er eliminert fra frosne snacks, ble prøvene sentrifugert i en mikrosentrifuge rør ved 16000 x g i 30 minutter, og væsken between bunnsedimentet og det øverste laget av meieri fett ekstraheres. En lik mengde heksan ble deretter tilsatt, etterfulgt av sentrifugering ved 15.000 x g i 30 min for å fjerne lipider.
  8. Fjern supernatanten med en 1 ml sprøyte og filtrere den gjennom et sprøytefilter (porestørrelse 0,2 um).
  9. Plassere 0,1 ml filtrert drikk prøven i et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 0,9 ml PBS og vortex forsiktig.
    MERK: Det er viktig å fortynne drikke prøven riktig. I dette tilfellet ble 1000-gangers fortynning utføres slik at sukkerkonsentrasjonen ville falle innenfor det dynamiske området til anordningen. Det anbefales å estimere målet sukkerkonsentrasjonen på forhånd ved å henvise til sukkerinnholdet i etiketten av drikkevaren.
  10. Tilsett 5 ul av den fortynnede drikk prøven (1%, v / v) til en kyvette inneholdende 0,495 ml av deteksjons løsning.
  11. Plasser kyvetten i en kyvetteholder av FRET analysatoren og forvarme prøveoppløsningen til 53 ° C.
  12. Trykk på "SET" for å måle sukkerinnhold.
    Merk Det er mulig å vurdere FRET måling ved hjelp av multilabel plateleser eller et fluorescens-spektrofotometer utstyrt med et Peltier anordning for temperaturstyring ved å avlese forholdet ved 488/535 nm 7,8. For sukrose deteksjon, følg trinnene fra 01.01 til 02.12 med en CSY-LH sensor 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å utføre kvantitativ analyse av sukkerinnhold ved bruk av FRET analysator, er det nødvendig å bygge en montert kurve estimere mål sukkerkonsentrasjonen fra den observerte FRET-forhold. La r definere forholdet mellom utslipps intensiteten av CFP ved 480 nm og emisjonsintensiteten YFP genereres ved 530 nm (Eq. 1).

ligning 1

Dose-respons kurven av FRET biosensor (CMY-BII ved 53 ° C) kan genereres ved å observere FRET-forholdet, r, ved forskjellige sukkerkonsentrasjoner. Kurven kan da uttrykkes som en S-formet sigmoidal kurve som følger:

ligning 2

r maks og min r representerer signal-forholdet med sukker konsentrasjoner på 0 og mettet (1,000 uM), respektivt; x 0 representerer sukkerkonsentrasjon på 50% reaksjon; og p representerer helningen av responsen, som er nær en eller -1. I denne studien, r max, r min, x 0, og p er henholdsvis 4,256, 2,672, 71,779 og en,. Konsentrasjonsområdet fra 1 uM til 1000 uM ble anvendt i modellen montering.

Ved hjelp av ligningene 1 og 2, ble sukkerinnholdet i commercially- tilgjengelige drikkevarer kvantifisert med nevnte FRET analysator. To maltose FRET sensorer ble undersøkt for å teste signal, r, avhengig av forskjellige temperaturer 2,8. Den første FRET sensor, CMY-0, er en grunnleggende FRET basert sensor bestående av CFP, maltose-bindende protein (MBP), og YFP, med no linker peptider. Den andre sensor, CMY-BII, har en Ser-Arg linker mellom MBP og de to fluorescens-proteinene 2. Som figur 1A viser, er CMY-0 ikke observert ved måle temperaturer under 50 ° C, så det er ikke noe signal forskjell mellom 0 og 1 mM maltose konsentrasjon. Signal forskjellene i både FRET sensorene ble maksimert mellom 50 og 55 ° C (figur 1) 8. For å kvantifisere sukkerinnholdet av de tre typer av kommersielt tilgjengelige drikkevarer, ble en dose-responskurve av det CMY-BII sensor ved 53- ° C ble generert (figur 2A) og maltose innholdet av de tre prøvene ble identifisert ved konvertere FRET forholdet inn i maltose konsentrasjon.

Som prøve A er laget av korn som ris og bygg, som er viktige maltose kilder, ble prøven ventes å inneholde relativt høyt innhold maltose (gjennomsnittlig 11,892 g / 235 ml) (

Figur 1
Figur 1. FRET Signal Forskjellen mellom 0 og 1 mM Maltose bruker FRET Analyzer ved forskjellige temperaturer. (A) CMY-0 sensor viste ingen signal forskjell på forskjellige maltose konsentrasjoner ved temperaturer under 50 ° C. (B) CMY-BII sensor var i stand til å skjelne den FRET signalforskjell mellom 0 og 1 mM maltose i et vidt temperaturområde. I begge tilfeller vil signalet forskjellen dramatisk økt i et bestemt temperaturområde (50 - 55 ° C). error stolper representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Maltose innhold Kvantifisering i tre kommersielt tilgjengelige Drikke. (A) En dose-responskurve for CMY-BII. (B) Maltose innhold av tre drikke prøvene ble kvantifisert. Merk at "totale sukker" indikerer mengden av alt sukker (inkludert maltose) som er rapportert av drikkevareprodusenten på drikkevaren etiketten. Feilen linjen viser standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen tillater rask og effektiv kvantifisering av sukkerinnholdet i drikkeprøver, ved hjelp av en skreddersydd FRET analysator 7 på en optimal temperatur for FRET sensorer. Analysatoren er designet med en nyutviklet, billig 405-nm bandet ultrafiolett-LED som lyskilde og to photodetectors med en silisiumfotodiode. Denne enheten er mer kostnadseffektivt enn andre sammenlign fluorometers. Innretningen viste høy følsomhet, spesielt ved måling av forholdet mellom to bølgelengdebånd utslipps (530 nm og 480 nm) i et optimalt temperaturområde for FRET sensorer. Dens følsomhet og intensitet i detekterer forskjellige sukkere var overlegen i forhold til en fluorescens-spektrofotometer anordning 7.

Hovedmålet med denne protokollen er å støtte den brede anvendelsen av gnage-baserte sensorer med skreddersydde FRET analysator. Mens analysatoren måler indirekte sukkerinnhold via FRET sensorer, jegt er klart at enheten inneholder en rekke av fordelene med FRET sensorer, inkludert mye uttrekk genmodifisert ligand spesifisitet, modulær design, sensorkonsentrasjonsuavhengig signaler, og nøyaktig målretting av subcellulære små molekyler. FRET sensorer er faktisk brukes til å detektere et bredt spekter av små molekyler, inkludert ioner 9, heme 10, og andre. Videre kan mer enn 20 typer FRET konstruksjoner være lett funnet og bestilt gjennom nonprofit depot Addgene 11.

Til tross for den brede anvendelse av FRET analysator, er det to store problemer med drift av anordningen. Først fordi driften av enheten er relativt enkelt, er prøven forbehandling det avgjørende skritt som påvirker kvaliteten på gjenkjenning, unntatt i tilfeller av feil på enheten. I denne protokollen, ett trinn (prøve fortynning) var tilstrekkelig til å behandle væskeprøver som var klart gjennomsiktig og inneholdt ingen uløselig partisykluser. Imidlertid kan andre prøver kreve ytterligere behandling for å fjerne uoppløselige materialer, slik som celledelte eller lipidkomponenter. Eventuelle autofluorescent partikler som kan påvirke FRET signal bør også fjernes, slik det fremgår følgende trinn 2.7. Dernest må kvalitetskontroll og tilkobling grensesnitt med sykehuset informasjonssystemer tas opp, som med alle typer point-of-care testing (POCT) verktøy 12. Siden signalkvaliteten til det FRET analysatoren i stor grad avhenger av kvaliteten på FRET sensoren og på preprosessering trinnene det jevnkvalitetskontroller er nødvendig for å sikre at målinger forblir innenfor den standard signalområdet for vanlig kvalitetskontroll av data analyse. Gnage sensor stabilitet og lagringsperiode, som begge er avgjørende for videre pålitelige applikasjoner, bør undersøkes i løpet av kvalitetskontroller. Lage retningslinjer og utvikle passende programvare kan også ta opp tilkobling begrensning. Nåværende versjoner avFRET analysator er utstyrt med RS232 tilkobling for ekstern kommandolinje kontroll, men trådløs kommunikasjon kan være en funksjon av den neste versjonen av analysatoren, som vil ha et forbedret grensesnitt for sykehuset informasjonssystemer.

Imidlertid har FRET sensorer er konstruert for substrat spesifisitet, en tilnærming som normalt gir bredere spesifisitet to. Følgelig kan gnage signal opplever uønsket interferens fra andre ingredienser, inkludert andre typer sukker i kommersielle drikker. Videre undersøkelser bør utforske hvordan FRET sensorer svare på ulike sukkerblandinger å nøyaktig kvantifisere mengden av sukker. Samarbeid med bedrifter som produserer drikkevarer vil hjelpe bekrefte sukkerinnholdet å kalibrere av FRET analysator.

Det er forventet at den foreslåtte bærbare FRET enhet med forskjellige FRET følere vil bli benyttet i POCT anvendelser. POCT blir brukt for å vurdere graviditet, blodblodsukkeret, biomarkør proteiner, smittsomme bakterier, og smittsomme virus. POCT metoder har hurtige behandlingstidene og vanligvis oppviser lave feilrater på grunn av det lille antallet av behandlingstrinn. Dette er viktige fordeler ved POCT over sentrale laboratorietesting tilnærming. Håndholdte bærbare POCT enheter, for eksempel den enheten som er beskrevet her, har økt oppmerksomhet på grunn av deres potensielle bruksområder i mat vurdering og blodsukker overvåking. Spesielt glukosemåling av blodprøver hos pasienter med diabetes krever en rask, nøyaktig og kostnadseffektiv POCT metode 13. Etter Ames forskerteamet utviklet den første blodsukker teststrimmel i 1965 (ved hjelp av en stripe som inneholder glukose oksidase), ble flere teknologier foreslått for blodsukker overvåking formål 12. Den FRET analysatoren er også tilgjengelige for å påvise glukose i blodprøver med passende forbehandling av blodglukose og periplasmatiske bindings Proteinkonn (MglB) 14 -basert FRET protein.

Enkle, raske metoder for mat kvalitetsvurdering er nødvendig. Forbruket av sukkerholdige drikker er forbundet med en rekke sykdommer og syndromer, slik som økt kroppsmasseindeks i barndommen 15, pediatrisk fedme 16, og risiko for slag 17. Forstå den forbindelse krever nøyaktig måling av sukker komponenter i drikkevarer. Derfor glukose og fruktose konsentrasjoner av drikkevarer er av interesse for forskere som arbeider med helse. Denne protokollen viser den meget følsomme ytelsen til FRET analysator med optimal temperaturregulering. Enheten kan brukes med ulike FRET sensorer for å oppdage en rekke små molecules- inkludert glukose og fruktose 14,15. Vår bærbart og oppladbar enhet, som har en batterilevetid på 10 - 20 timer, avhengig av oppvarming protokollen, er anvendelig for POCT. Det enkle driftsprotokoll makes enheten enkel å bruke og eliminerer behovet for komplisert opplæring av personalet. Med tekniske forbedringer, blant annet reduksjon av utstyr størrelse, minimering av forbehandling trinn, og identifisering av praktiske krav til feltbruk, vil denne enheten fremme FRET basert forskning utvikling i småskala laboratoriemiljøer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Intelligent Syntetisk biologi Center of Global Frontier Prosjekt (2011-0031944) og KRIBB Forskningsinitiativet Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB BD #244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) Sigma I6758
Ampicillin Sigma A9518
Tri-HCl Bioneer C-9006-1
PMSF Sigma 78830
EDTA Bioneer C-9007
DTT Sigma D0632
NaCl Junsei 19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 70011-044 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q Amersham Biosciences 17-1177-01 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column 
HisTrap HP1 Amersham Biosciences 29-0510-21
Quartz cuvette Sigma Z802875
AKÄKTAFPLC Amersham Biosciences 18-1900-26 a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse VarianInc a fluorescence spectrophotometer
VICTOR   PerkinElmer 2030-0050 a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3) Promega Electrocompetent cells
A (Beverage) Korea Yakult Co. (Korea) Birak Fermented drinks
B (Beverage) Lotte Foods (Korea) Epro Soft drink
C (Beverage) Lotte Foods (Korea) Getoray Sports drink

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  2. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
  3. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  4. Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  5. Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
  6. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  7. Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
  8. Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
  9. Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
  10. Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
  11. Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
  12. Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
  13. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
  14. Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
  15. Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
  16. Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
  17. Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
  18. Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).

Tags

Biokjemi fluorescens resonans energi overføring bærbar enhet point-of-care testing sukkerinnhold fluorometer mat vurdering Förster resonans energi overføring (FRET)
Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, H., Han, G. H., Fu, Y., Gam,… More

Kim, H., Han, G. H., Fu, Y., Gam, J., Lee, S. G. Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer. J. Vis. Exp. (116), e54144, doi:10.3791/54144 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter