Summary
Denne protokol beskriver den hurtige og meget følsomme kvantificering af Förster resonans (FRET) sensor data ved hjælp af en skræddersyet bærbar FRET analysator. Indretningen blev anvendt til at detektere maltose inden en kritisk temperaturområde, der maksimerer afsløring følsomhed, der gør det muligt praktisk og effektiv vurdering af indhold af sukker.
Abstract
Nylige forbedringer i Förster resonans (FRET) sensorer har aktiveret deres anvendelse til at opdage forskellige små molekyler, herunder ioner og aminosyrer. Men den medfødte svagt signal intensitet FRET sensorer er en stor udfordring, der forhindrer deres anvendelse i forskellige områder og gør brug af dyre, high-end fluorometre nødvendig. Vi har tidligere bygget en omkostningseffektiv, højtydende FRET analysator, som specifikt kan måle forholdet mellem to emissioner bølgelængdebånd (530 og 480 nm) for at opnå en høj detektionsfølsomhed. For nylig blev det opdaget, at FRET sensorer med bakteriel periplasmiske bindingsproteiner detektere ligander med maksimal følsomhed i det kritiske temperaturområde på 50 - 55 ° C. Denne rapport beskriver en protokol til vurdering sukkerindhold i kommercielt tilgængelige drikkevarer prøver at bruge vores bærbare FRET analysator med en temperatur-specifik FRET sensor. Vores resultater viste, at den yderligere forvarmningFremgangsmåden FRET sensor øger FRET forholdssignal, at muliggøre en mere nøjagtig måling af indhold af sukker. Den specialfremstillede FRET analysator og sensor blev anvendt med held til at kvantificere sukkerindholdet i tre typer af kommercielle drikkevarer. Vi forventer, at yderligere reduktion og ydeevne størrelse forøgelse af udstyret vil lette brugen af håndholdte analysatorer i miljøer, hvor high-end udstyr er ikke tilgængelig.
Introduction
Forster-resonansenergioverførsel (FRET) er blevet almindeligt anvendt som en biometrisk sensor til at detektere små molekyler, såsom sukkerarter, calciumioner og aminosyrer 1-4. FRET biosensorer indeholder fluorescerende proteiner, cyan fluorescerende proteiner (CFPS) og gul fluorescerende proteiner (YFPs), som er kondenseret til begge ender af periplasmatiske-proteiner (PBP). Sukkerarter binder til PBP placeret i midten af FRET sensor, forårsager strukturelle ændringer af sensor, der efterfølgende ændrer afstanden og overgang dipol orientering af de to fluorescerende proteiner i hver ende af PBP. Denne ændring muliggør kvantitativ analyse af sukkerindholdet ved at måle forholdet mellem emissions- bølgelængder EYFP (530 nm) og ECFP (480 nm). På grund af den høje følsomhed, specificitet, real-time overvågning kapacitet, og hurtig responstid på FRET biosensorer, er disse sensorer er meget udbredt i miljøet, industrielle og medicinske anvendelser 5. Desuden ratiometric måling med FRET biosensorer har vigtige praktiske fordele, da den kan anvendes til at måle bestanddele i komplekse biologiske prøver, hvor koncentrationen sensoren ikke let kan kontrolleres og baggrundsfluorescens er altid til stede.
På trods af disse fordele ved FRET-baserede sensorer til kvantitativ visualisering, små strukturelle ændringer med ufuldstændig domæne motion-overførsel til de fluorescerende proteiner producerer inhærent svagt signal intensitet. Dette svage signal begrænser anvendelsen af FRET-baserede sensorer til in vitro eller in vivo-analyse 6. Derfor kan de fleste FRET biosensorer kræver brug af dyre og meget følsomt udstyr. Vi har tidligere udviklet en billig og bærbar FRET analysator med kapaciteter svarende til dem af de eksisterende fluorescens analysatorer 7. I denne anordning billige 405-nm båndet ultraviolet lysemitterende diode (LED) blev anvendt som lyskilde til at forårsage excitation af the fluorescenssignal, der erstatter et dyrt lampe eller laser. Detekteringssystemet af analysatoren effektivt fokuserer utrættende fluorescenssignalet på to fotodetektorer med en silicium fotodiode. I en nyere undersøgelse, viste vi, at optimering af afsløring temperatur ved 50 - 55 ° C i væsentlig grad kan forstørre ratiometrisk FRET signal 8. Denne temperatur-specifikke signal ekstraudstyr, sammen med specialfremstillede FRET analysator, muliggør anvendelse af FRET sensorer i mere generelle diagnostiske applikationer med hurtig og høj følsomhed.
I denne protokol, demonstrerede vi den generelle anvendelighed af den FRET analysator under optimale FRET temperaturforhold ved at kvantificere indholdet af kommercielt tilgængelige drikkevarer sukker. Denne protokol giver detaljerne i FRET enhedens drift, samt en kort beskrivelse af sensor og prøveforberedelse. Vi forventer, at denne rapport vil fremme den potentielle anvendelse af bærbareanalysator i små laboratoriemiljøer og give et grundlag for yderligere udvikling af en billig on-site diagnostiske enhed med FRET-baserede biosensorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af biosensor
- Konstruktion af plasmidet pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 ved at følge den tidligere etablerede protokol 2.
- Inokulere 5 ml Luria-bouillon (LB) med en enkelt koloni af en Escherichia coli DE3-stammen og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer under omrystning.
- Overføres 1 ml O / N-kulturen til en 500 ml kolbe indeholdende 100 ml LB og inkuber ved 37 ° C i en rysteinkubator, indtil den optiske densitet ved 600 nm (OD600) når 0,5 (ca. 3 timer).
- Cellerne høstes i et 50 ml konisk rør ved centrifugering ved 1000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes hurtigt i hvert rør med 50 ml iskold destilleret vand (DW) og centrifugeres ved 1.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes i 50 pi iskold DW med 10% (v / v) glycerol ved forsigtigt hvirvlende indtil opløsningen (elektrokompetente celler) når en OD600
- Placer blandingen af elektrokompetente celler (50 pi af cellerne ved en OD600 på 100) og 10 ng af plasmidet pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 i en iskold elektroporation cuvette i en Elektroporeringsindretning og elektroporere blandingen (18 kV / cm, 25 uF).
- Hurtigt tilsættes 1 ml SOC-medium til kuvetten og cellerne resuspenderes forsigtigt, efterfulgt af udvinding ved 37 ° C i 1 time under forsigtig omrystning i en 15 ml rundbundet rør.
- Spred cellerne på en LB-plade indeholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes ved 37 ° C i 12 timer.
- Isolere en enkelt koloni ved anvendelse af en løkke og pode kolonien i 10 ml LB indeholdende 100 pg / ml ampicillin ved 37 ° C i et rysteapparat i 12 timer.
- Der tilsættes 5 ml af podekulturen til 500 ml LB indeholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes kulturen i en 37 ° C rysteinkubator.
- Tilføj 0,5 mM isopropyl β-d-(IPTG), når OD 600 når op0,5 og inkuberes kulturen i en 37 ° C rysteinkubator i 24 timer.
- Centrifuger cellerne ved 4500 x g i 20 minutter (4 ° C) og forsigtigt fjerne supernatant.
- Pellet resuspenderes i 5 ml bindingsbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA og 1 mM DTT).
- Sonikeres cellerne på is med seks 10-sec bursts ved 200-300 W, efter hver burst med 10 sekunders afkøling.
- Centrifugeres lysatet ved 10.000 × g i 30 minutter ved 4 ° C for at pelletere celledebris. Overfør supernatanten (opløseligt protein) i en ny samling rør.
- For at opnå affinitetsoprensning af FRET sensor proteiner, belastning 4 ml af den blokerede cellelysat på en Ni-NTA affinitetssøjle (5 ml volumen) og udføre en kromatografi under anvendelse af hurtig protein-væskechromatografi (FPLC) 18.
- Kolonnen udvaskes en gang med fem kolonnevolumener vaskebuffer I (50 mM fosfatbuffer, 300 mM natriumchlorid, 10 mM imidazol, pH 7,0).
- Gentag vasketrinet med fem kolonnevolumener vaskebuffer II (50 mM phosphatbuffer, 300 mM natriumchlorid, 20 mM imidazol, pH 7,0).
- Eluering af sensoren proteinet med fem søjlevolumener elueringsbuffer (50 mM phosphatbuffer, 300 mM natriumchlorid, 500 mM imidazol, pH 7,0).
- At koncentrere og afsalte den eluerede prøve, fylde koncentrator (membran størrelse på 10.000 MW) med op til 20 ml prøve og centrifugeres i 10 min ved 3000 x g. Refill koncentrator med 0,8% phosphatbufret saltvand (PBS). Gentag dette trin to gange, først fylde koncentrator med 20 ml prøve, og derefter genpåfyldning med PBS.
- Gendan den koncentrerede og de-saltet sensor protein og gemme det ved -80 ° C.
2. Måling af Sukker indhold ved hjælp af FRET Analyzer
BEMÆRK: Detaljerne i FRET analysator byggeriet blev beskrevet i vores tidligere arbejde 7.
- Forbered en afsløring løsning på 0,8% PBS indeholdende 0,2uM sensoren proteiner.
- Tænd for FRET analysatoren. Tryk på knappen "UP" i 2 sek at kalibrere den optimale temperatur. Indstil temperaturen til 53 ° C ved hjælp af "op" og "ned" knapper og tryk på knappen "SET".
- For kalibrering, tryk og hold "UP" og "DOWN" knapperne samtidig i 2 sek. Bekræft, at skærme LED "CALIB", og tryk på knappen "SET".
- Placer en 12,5 × 12,5 × 45 mm (længde × bredde × højde) rektangulært parallelepipedum fartøj (cuvette), der kun indeholder PBS-buffer i en kuvette indehaver af analysatoren og tryk på knappen "SET".
- Udskift kuvetten med én, der kun indeholder afsløring opløsning (se 2.1) uden sukker (maltose / saccharose) og tryk på knappen "SET" for at kalibrere grundlinjen.
- Udskift kuvetten med en, der indeholder påvisning løsning med 10 mM sukker og tryk på "SET"knap.
- For at bestemme indholdet af en drikkevare prøve sukker, put 1 ml drikkevare prøve i et 1,5-ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 16.000 x g i 1 min.
BEMÆRK: FRET sensorbaseret fluorescensmåling har den fordel ikke at kræve særlig forbehandling af prøven, fordi kun 1% (v / v) af prøven er inkluderet i det totale volumen. Men vi anbefaler at fjerne ethvert materiale, der kan påvirke fluorescens måling (f.eks, celler, uopløselige partikler, lipid, fedt, eller materiale med autofluorescens). Desuden, hvis en stærk syre, stærk base, rengøringsmiddel (detergent), eller emulgeringsmiddel (emulgator) er til stede i en høj koncentration og kan påvirke egenskaberne af FRET biologiske sensor, det bør fjernes ved anvendelse af et organisk opløsningsmiddel eller en Neutralizer. For eksempel, når fedt og emulgatorer mejeri elimineres fra frosne snacks prøverne centrifugeret i et mikrofugerør ved 16.000 x g i 30 minutter, og væsken between sediment og det øverste lag af fedt mejeri ekstraheres. Et lige mængde hexan tilsættes derefter, efterfulgt af centrifugering ved 15.000 x g i 30 min for at fjerne lipider. - Fjern supernatanten med en 1 ml sprøjte og filtreres det gennem et sprøjtefilter (porestørrelse 0,2 um).
- Anbring 0,1 ml filtrerede drik prøve i et 1,5-ml mikrocentrifugerør indeholdende 0,9 ml PBS og vortex forsigtigt.
BEMÆRK: Det er vigtigt at fortynde drikken prøven korrekt. I dette tilfælde blev 1000-gange fortynding udføres således, at koncentrationen af sukker ville falde inden for dynamiske område af indretningen. Vi anbefaler, at estimere koncentrationen målet sukker på forhånd ved at henvise til sukkerindholdet i etiketten af drikken. - Tilsæt 5 pi af den fortyndede drikkevare prøve (1%, v / v) til en kuvette indeholdende 0,495 ml påvisning opløsning.
- Anbring kuvetten i en kuvette indehaveren af FRET analysator og forvarme prøveopløsningen til 53 ° C.
- Tryk på knappen "SET" for at måle sukkerindholdet.
Bemærk Det er muligt at evaluere FRET måling med en multilabel pladelæser eller et fluorescens-spektrofotometer udstyret med en Peltier indretning til temperaturstyring ved aflæsning af forholdet ved 488/535 nm 7,8. For saccharose afsløring Følg trinnene fra 1,1 til 2,12 med en CSY-LH sensor 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at udføre kvantitativ analyse af sukker indhold ved hjælp af FRET analysatoren, er det nødvendigt at bygge en tilpassede kurve estimering koncentration målet sukker fra den observerede FRET ratio. Lad r definere forholdet mellem emissionsintensitet FFP ved 480 nm, og emissionsintensitet YFP genereret ved 530 nm (Eq. 1).
Dosis-respons-kurven for FRET biosensor (CMY-BII ved 53 ° C) kan tilvejebringes ved at observere FRET-forholdet, r, ved forskellige koncentrationer af sukker. Kurven kan derefter udtrykkes som et S-formet sigmoidal kurve som følger:
r max og r min repræsenterer signal forholdet med sukker koncentrationer på 0 og mættet (1000 uM) henholdsvis; x 0 repræsenterer koncentrationen sukkeret ved 50% respons; og p betegner hældningen af reaktionen, hvilket er tæt på 1 eller -1. I den foreliggende undersøgelse, r max, r min, x 0, og p er 4,256, 2,672, 71,779, og 1, henholdsvis. Koncentrationsområdet fra 1 uM til 1000 pM blev anvendt i modellen fitting.
Brug ligninger 1 og 2, blev indholdet af commercially- tilgængelige drikkevarer sukker kvantificeret med FRET analysator. To maltose FRET sensorer blev undersøgt for at teste signal, r, afhængigt af forskellige temperaturer 2,8. Den første FRET sensor, CMY-0, er en grundlæggende FRET-baserede sensor bestående af FFP, maltose-bindende protein (MBP), og YFP, med no linkerpeptider. Den anden sensor, CMY-BII, har en Ser-Arg-linkeren mellem MBP og de to fluorescens proteiner 2. Som Figur 1A viser, er CMY-0 ikke observeret ved måling temperaturer under 50 ° C, da der ikke er noget signal forskel mellem 0 og 1 mM maltose koncentration. De signalforskelle for både FRET Sensorerne blev maksimeret mellem 50 og 55 ° C (figur 1) 8. For at kvantificere indholdet af de tre typer af kommercielt tilgængelige drikkevarer sukker, blev en dosisresponskurve af CMY-BII sensoren ved 53- ° C genereres (figur 2A) og maltose indholdet af de tre prøver blev identificeret ved omdannelse af FRET-forholdet i maltose koncentration.
Som prøve A er fremstillet af korn såsom ris og byg, som er vigtige maltose kilder blev prøven forventes at indeholde relativt høje maltose indhold (gennemsnitlig 11,892 g / 235 ml) ( 
Figur 1. FRET Signal Forskellen mellem 0 og 1 mM Maltose anvendelse af FRET-Analyzer ved forskellige temperaturer. (A) CMY-0 sensor viste ingen signal forskel ved forskellige maltose koncentrationer ved temperaturer under 50 ° C. (B) Den CMY-BII sensor kunne skelne FRET signal forskellen mellem 0 og 1 mM maltose i et bredt temperaturområde. I begge tilfælde signalet forskellen dramatisk forøget i et bestemt temperaturområde (50 - 55 ° C). error søjler repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2. maltose Kvantificering i Three Kommercielt tilgængelige drikkevarer. (A) En dosis-respons-kurven for CMY-BII. (B) Maltose indhold af tre beverage prøver blev kvantificeret. Bemærk, at "Samlet sukkerindhold" angiver mængden af al sukker (herunder maltose) rapporteret af drikken producenten på drik label. Fejlen bar angiver standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol muliggør hurtig og effektiv kvantificering af sukkerindholdet i prøver drik ved hjælp af en skræddersyet FRET analysator 7 ved en optimal temperatur for FRET sensorer. Analysatoren er designet med en nyligt udviklede, billig 405-nm båndet ultraviolet-LED som lyskilde og to fotodetektorer med en silicium fotodiode. Denne enhed er mere omkostningseffektiv end andre sammenlignelige fluorometre. Indretningen udviste høj detekteringssensitivitet, specielt ved måling af forholdet mellem to emissionsbølgelængde bånd (530 nm og 480 nm) i en optimal temperaturområde for FRET sensorer. Dens følsomhed og intensitet i påvisning af forskellige sukkerarter var overlegne i forhold til en fluorescensspektrofotometer indretning 7.
Hovedformålet med denne protokol er at støtte den brede anvendelighed af FRET-baserede sensorer med specialfremstillede FRET analysator. Mens analysatoren indirekte måler sukkerindhold via FRET sensorer, jegt er klart, at indretningen indeholder en række af fordelene ved FRET sensorer, herunder almindeligt udvides gensplejset ligandspecificitet, modulopbygget, sensor koncentration-uafhængige signaler, og nøjagtig målretning af subcellulære små molekyler. FRET sensorer rent faktisk bruges til at detektere en lang række små molekyler, herunder ioner 9, hæm 10 og andre. Desuden kan mere end 20 typer af FRET konstruktioner let findes og bestilles gennem nonprofit depositar AddGene 11.
Trods den brede anvendelighed af FRET analysatoren, er der to væsentlige problemer med driften af indretningen. For det første fordi driften af enheden er relativt enkel, prøve forbehandlingsfasen er det afgørende skridt, der påvirker kvaliteten af afsløring, undtagen i tilfælde af fejl på enheden. I denne protokol, et skridt (prøve fortynding) var tilstrækkelig til at behandle flydende prøver, der var klart gennemskuelig og indeholdt ingen uopløselige particykler. Imidlertid kan andre prøver kræve yderligere behandling for at fjerne uopløselige materialer, såsom cellulære eller lipidkomponenter. Eventuelle autofluorescerende partikler, der kan påvirke FRET signal bør også fjernes, som bemærket efter Trin 2.7. For det andet skal løses, som med alle typer af point-of-care test (POCT) værktøj 12 kvalitetskontrol og tilslutningsmuligheder samspil med hospitalets informationssystemer. Eftersom signalkvaliteten af FRET analysator vid udstrækning afhænger af kvaliteten af den FRET sensor og på forbehandlingstrin, kræves regelmæssig kontrol kvalitetskontrol for at sikre, at målingerne forbliver inden for standard signalområde for regelmæssig kvalitetskontrol dataanalyse. Den FRET sensor stabilitet og opbevaring periode, som begge er afgørende for yderligere pålidelige applikationer, bør undersøges under kvalitetskontroller. Oprettelse retningslinjer og udvikling af passende software kan også tage fat på konnektivitet begrænsning. Aktuelle versioner afFRET analysator er udstyret med RS232-tilslutning til fjernbetjening kommandolinje kontrol, men trådløs kommunikation kan være et element i den næste version af analysatoren, som vil have et forbedret interface til hospital informationssystemer.
Imidlertid har FRET sensorer blevet udviklet til substratspecificitet, en tilgang, der normalt giver bredere specificitet 2. Derfor kan FRET signal støde utilsigtede interferens fra andre ingredienser, herunder andre typer af sukker i kommercielle drikkevarer. Yderligere undersøgelser skal undersøge, hvordan FRET sensorer reagerer på forskellige sukker blandinger til nøjagtigt at kvantificere mængden af sukker. Samarbejde med virksomheder, der producerer drikkevarerne vil hjælpe bekræfte, at sukkerindholdet kalibrere af FRET analysator.
Det forventes, at den foreslåede bærbare FRET enhed med forskellige FRET sensorer vil blive anvendt i POCT applikationer. POCT bruges til vurdering af graviditet, blodglucose niveauer, biomarkør proteiner, smitsomme bakterier og smitsomme vira. POCT metoder har hurtige behandlingstider og generelt udviser lave fejlprocenter på grund af det lille antal procestrin. Det er vigtige fordele ved POCT over den midterste laboratorieprøver tilgang. Håndholdte bærbare POCT enheder, såsom enheden beskrevet heri, har fået stigende opmærksomhed på grund af deres potentielle anvendelser i vurderingen mad og overvågning blodsukker. Især glukose monitorering af blodprøver hos patienter med diabetes kræver en hurtig, præcis og omkostningseffektiv POCT metode 13. Efter Ames forskerhold udviklede den første blodsukker teststrimmel i 1965 (ved hjælp af en strimmel, der indeholder glucose oxidase), blev der flere teknologier foreslået til blodsukker overvågningsformål 12. Den FRET analysator er også tilgængelig til at detektere glukose i blodprøver med passende forbehandling af blod og periplasmiske glucose-bindende Protein (MglB) 14 -baseret FRET protein.
Der er behov for enkle, hurtige metoder til vurdering fødevarekvalitet. Forbruget af sukkerholdige drikke er associeret med en række sygdomme og syndromer, såsom øget body mass index i barndommen 15, pædiatrisk fedme 16, og risikoen for slagtilfælde 17. Forståelse denne forbindelse nødvendiggør præcis måling af sukker komponenter i drikkevarer. Derfor glukose og fruktose koncentrationer af drikkevarer er af interesse for beskæftiger sig med menneskers sundhed forskere. Denne protokol viser meget følsomme ydeevne FRET analysator med optimal temperaturstyring. Enheden kan bruges med forskellige FRET sensorer til at registrere forskellige små molecules- herunder glucose og fructose 14,15. Vores bærbare og genopladelige enhed, som har en batterilevetid på 10 - 20 timer, afhængig af opvarmning protokol, gælder for POCT. Dens enkle operationelle protokol makes enheden let at bruge og eliminerer behovet for komplicerede uddannelse af personalet. Med tekniske forbedringer, herunder reduktion af udstyr størrelse, minimering af forbehandlingstrin, og identifikation af praktiske krav til brug felt, vil denne enhed fremme FRET-baserede forskning udvikling i små laboratoriemiljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944) og KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).
