Summary
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.
Abstract
Die jüngsten Verbesserungen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Sensoren haben ihre Verwendung aktiviert werden, damit verschiedene kleine Moleküle einschließlich Ionen und Aminosäuren erkennen. Allerdings ist die angeborene schwache Signalintensität von FRET-Sensoren eine große Herausforderung dar, die ihre Anwendung in verschiedenen Bereichen verhindert und die Verwendung von teuren High-End-Fluorometer notwendig. Bisher haben wir eine kostengünstige, High-Performance-FRET-Analyzer, der speziell das Verhältnis von zwei Emissionswellenlängenbändern zu messen (530 und 480 nm) hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. In jüngerer Zeit wurde entdeckt, dass FRET Sensoren mit bakteriellen periplasmatischen Bindungsproteinen Liganden mit einer maximalen Empfindlichkeit im kritischen Temperaturbereich von 50 erfassen - 55 ° C. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll Zuckergehalt in handelsüblichen Getränkeproben unter Verwendung unserer tragbaren FRET-Analysator mit einer temperaturspezifischen FRET-Sensor für die Beurteilung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die zusätzliche VorwärmungProzess des FRET-Sensor erhöht die FRET-Verhältnissignal, eine genauere Messung des Zuckergehalts zu ermöglichen. Maßgeschneiderte FRET-Analysator und Sensor wurden erfolgreich den Zuckergehalt in drei Arten von kommerziellen Getränke zu quantifizieren angewandt. Wir gehen davon aus, dass eine weitere Größenreduktion und Leistungssteigerung der Anlage wird die Verwendung von Hand Analysatoren in Umgebungen erleichtern, in denen High-End-Geräte nicht zur Verfügung steht.
Introduction
Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) wurde als biometrischer Sensor zur Erkennung kleiner Moleküle wie Zucker, Calciumionen und Aminosäuren 1-4 verwendet. FRET Biosensoren enthalten fluoreszierende Proteine, cyan fluoreszierende Proteine (CFPs) und Gelb fluoreszierendes Protein (YFPs), die an beiden Enden des periplasmatischen-bindenden Proteinen fusioniert sind (PBPs). Zucker binden an PBPs in der Mitte des FRET-Sensor befindet, strukturelle Änderungen an dem Sensor verursachen, die anschließend den Abstand und Übergangsdipolmomente Orientierung der beiden fluoreszierenden Proteinen an jedem Ende des PBP verändern. Diese Änderung ermöglicht die quantitative Analyse der Zuckergehalt, indem das Verhältnis der Emissionswellenlängen von EYFP (530 nm) und ECFP (480 nm) gemessen wird. Aufgrund der hohen Sensitivität, Spezifität, Echtzeit - Monitoring - Kapazitäten und eine schnelle Reaktionszeit von FRET Biosensoren sind diese Sensoren weit verbreitet in der Umwelt, Industrie und medizinische Anwendungen 5. Außerdem ratiometric Messung mittels FRET Biosensoren hat wichtige praktische Vorteile, da es verwendet werden kann, Komponenten in komplexen biologischen Proben zu messen, wo der Sensor-Konzentration nicht leicht gesteuert werden kann und die Hintergrundfluoreszenz ist immer vorhanden.
Trotz dieser Vorteile von FRET-basierten Sensoren für quantitative Visualisierung, kleine strukturelle Veränderungen mit unvollständigen Domain Bewegungsübertragung auf die fluoreszierenden Proteine produzieren von Natur aus schwach Signalintensität. Dieses schwache Signal begrenzt die Anwendung von FRET-basierten Sensoren für die in vitro oder in vivo - Analyse 6. Folglich meisten FRET Biosensoren die Verwendung von teuren und hochempfindliche Ausrüstung erfordern. Bisher haben wir eine kostengünstige und portable FRET - Analysator mit Funktionen ähnlich denen der bestehenden Fluoreszenz Analysatoren 7. Bei dieser Vorrichtung ist kostengünstig 405-nm-Band ultraviolettem Licht emittierende Diode (LED) als Lichtquelle verwendet Anregung th zu verursachene Fluoreszenzsignal, eine teure Lampe oder einem Laser zu ersetzen. Das Detektionssystem des Analysators fokussiert effizient das ableitende Fluoreszenzsignal auf zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. In einer neueren Studie wurde gezeigt, dass die Optimierung der Erfassungstemperatur bei 50 - 55 ° C signifikant die ratiometrisch FRET - Signal 8 vergrößern könnte. Diese Temperatur spezifische Signalverstärkung, zusammen mit dem maßgeschneiderten FRET-Analyzer, ermöglicht die Verwendung von FRET-Sensoren in allgemeinere diagnostische Anwendungen mit schnellen und hohen Empfindlichkeit.
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, die allgemeine Anwendbarkeit des FRET-Analysator unter optimalen FRET Temperaturbedingungen durch den Zuckergehalt von handelsüblichen Getränken zu quantifizieren. Dieses Protokoll stellt die Details des FRET Gerätebedienung sowie eine kurze Beschreibung der Sensor und die Probenvorbereitung. Wir gehen davon aus, dass dieser Bericht die Anwendung des tragbaren fördernAnalysator in kleinen Laborumgebungen und eine Grundlage für die weitere Entwicklung eines kostengünstigen Vor-Ort-Diagnosegerät mit FRET-basierten Biosensoren bieten.
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Protocol
1. Herstellung von Biosensor
- Konstruieren Sie das Plasmid pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 durch Befolgen des vorher festgelegten Protokoll 2.
- Impfen 5 ml Luria - Brühe (LB) mit einer Einzelkolonie eines Stammes Escherichia coli DE3 und Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden unter Schütteln.
- 1 ml des O / N - Kultur in einen 500-ml - Kolben , die 100 ml LB und bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator inkubieren , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) 0,5 erreicht (ca. 3 h).
- Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
- Das Pellet schnell in jedes Röhrchen mit 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und die Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C.
- Das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin vorsichtig , bis die Lösung (elektro Zellen) wirbelnden erreicht eine OD 600
- Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen (50 & mgr; l der Zellen bei einer OD 600 von 100) und 10 ng des pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 in einer eiskalten Elektroporationsküvette in einer Elektroporation Gerät und elektroporieren die Mischung (18 kV / cm, 25 & mgr; F).
- Schnell 1 ml SOC-Medium in die Küvette hinzufügen und die Zellen resuspendieren sanft, für 1 Stunde bei 37 ° C mit anschließender Erholung mit sanftem Rundboden Röhrchen in einem 15 ml schütteln.
- Verteilt die Zellen auf einer LB-Platte, die 100 ug / ml Ampicillin und Inkubieren bei 37 ° C für 12 Stunden.
- Isolieren einer Einzelkolonie einer Schleife und inokulieren die Kolonie in 10 ml LB für 12 h in einem Schüttler 100 ug / ml Ampicillin bei 37 ° C enthält.
- 5 ml der Impfkultur zu 500 ml LB, enthaltend 100 & mgr; g / ml Ampicillin und Inkubieren der Kultur in einem 37 ° C Schüttelinkubator.
- In 0,5 mM Isopropyl β-d-(IPTG) , wenn die OD 600 erreicht24 h 0,5 und die Kultur in einem 37 ° C Schüttelinkubator inkubiert.
- Zentrifuge die Zellen bei 4.500 × g für 20 min (4 ° C) und Überstand vorsichtig entfernen.
- Resuspendieren des Pellets in 5 ml Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
- Beschallen die Zellen auf Eis mit sechs 10-Sekunden-Bursts bei 200-300 W, die jeweils mit 10 sec Burst folgenden Kühlung.
- Zentrifugieren Sie das Lysat bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand (lösliche Protein) in eine neue Sammelröhrchen.
- Zur Affinitätsreinigung der FRET Sensorproteine, Last 4 ml des gelöscht Zelllysats auf eine Ni-NTA - Affinitätssäule (5 ml Volumen) , und führen eine Chromatographie - Assay unter Verwendung von Fast - Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) 18 erreichen.
- Die Säule wird einmal mit fünf Säulenvolumina Waschpuffer I (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 10 mM Imidazol, pH 7,0).
- Wiederholen der Waschschritt mit fünf Säulenvolumina Waschpuffer II (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 20 mM Imidazol, pH 7,0).
- Eluieren des Sensorprotein mit fünf Säulenvolumina Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 500 mM Imidazol, pH 7,0).
- Zu konzentrieren und die eluierten Probe entsalzen füllen Konzentrator (Membran eine Größe von 10000 MW) mit bis zu 20 ml der Probe und zentrifugiert für 10 min bei 3000 × g. Nachzufüllen Konzentrator mit 0,8% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, zuerst den Konzentrator mit 20 ml Probe füllen und dann mit PBS Nachfüllen.
- Wiederherstellen der konzentrierten und de-gesalzene Sensorprotein und lagern Sie es bei -80 ° C.
2. Messung des Zuckergehalts der FRET-Analyzer
HINWEIS: Die Details des FRET - Analysator Bau wurden in unserer bisherigen Arbeit 7 beschrieben.
- Bereiten Sie eine Detektionslösung von 0,8% PBS, die 0,2uM der Sensorproteinen.
- Schalten Sie den FRET-Analysator. Drücken Sie die Taste "UP" für 2 Sekunden die optimale Temperatur zu kalibrieren. Stellen Sie die Temperatur auf 53 ° C unter Verwendung der "UP" und "DOWN" Tasten und drücken Sie die Taste "SET".
- Für die Kalibrierung, drücken und halten Sie die "UP" und "DOWN" Tasten gleichzeitig für 2 Sekunden. Bestätigen Sie, dass die LED-Panel Displays "CALIB" und drücken Sie die Taste "SET".
- Legen Sie ein 12,5 x 12,5 x 45 mm (Länge x Breite x Höhe) quader Gefäß (Küvette), die nur Puffer PBS in einem Küvettenhalter des Analysators und drücken Sie die Taste "SET".
- Setzen Sie die Küvette mit einer nur die Nachweislösung enthält (siehe 2.1) ohne Zucker (Maltose / Saccharose) und drücken Sie die Taste "SET" die Basislinie zu kalibrieren.
- Setzen Sie die Küvette mit einer der Detektionslösung mit 10 mM Zucker und drücken Sie die "SET"Taste.
- Um den Zuckergehalt eines Getränks Probe zu bestimmen, setzen Sie 1 ml Getränkeprobe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min.
HINWEIS: FRET sensorbasierte Fluoreszenzmessung hat den Vorteil, nicht erfordern spezielle Vorbehandlung der Probe, da nur 1% (v / v) der Probe wird in dem Gesamtvolumen enthalten. Empfehlen jedoch Entfernen wir jedes Material, das die Fluoreszenzmessung (zB Zellen, unlöslichen Teilchen, Lipid, Fett, oder jedes Material mit Eigenfluoreszenz) beeinflussen können. Darüber hinaus, wenn eine starke Säure, starke Basis, Mittel (Reinigungsmittel) reinigen oder Emulgator (Emulgator) in hoher Konzentration vorhanden ist, und kann die Eigenschaften des FRET biologischen Sensor beeinflussen, sollte es ein organisches Lösungsmittel oder ein entfernt werden unter Verwendung von Neutralisator. Wenn beispielsweise Milchfett und Emulgatoren aus gefrorenen Snacks eliminiert werden, werden die Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 30 min bei 16000 × g zentrifugiert und die Flüssigkeit between der Bodensediment und die obere Schicht aus Milchfett wird extrahiert. Eine gleiche Menge an Hexan wird dann zugegeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 15.000 × g für 30 min Lipiden zu eliminieren. - Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Spritze und filtern sie durch einen Spritzenfilter (Porengröße 0,2 um).
- Legen Sie 0,1 ml gefiltert Getränkeprobe in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 0,9 ml PBS und Wirbel sanft.
HINWEIS: Es ist entscheidend, um die Getränkeprobe richtig zu verdünnen. In diesem Fall wurde 1.000-fache Verdünnung durchgeführt, so dass die Zuckerkonzentration innerhalb des dynamischen Bereichs der Vorrichtung fallen. Wir empfehlen, die Schätzung der Zielzuckerkonzentration im Voraus in der Bezeichnung des Getränks auf den Zuckergehalt bezieht. - Zugabe von 5 & mgr; l der verdünnten Getränkeprobe (1%, v / v) in eine Küvette 0.495 ml der Nachweislösung enthält.
- Setzen Sie die Küvette in einem Küvettenhalter des FRET-Analysator und Vorwärmung der Probenlösung auf 53 ° C.
- Drücken Sie die Taste "SET", den Zuckergehalt zu messen.
Hinweis : Es ist möglich , die FRET - Messung mit einem Multilabel- Plattenlesegerät oder ein Fluoreszenz - Spektralphotometer mit einem Peltier - Element zur Temperaturkontrolle zu bewerten , indem das Verhältnis bei 488/535 nm 7,8 zu lesen. Für Saccharose Erkennung, die Schritte 1,1-2,12 mit einem CSY-LH - Sensor 2.
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Representative Results
Auszuführen quantitative Analyse der Zuckergehalt unter Verwendung des FRET-Analysator, ist es notwendig, eine angepasste Kurve Abschätzen der Zielzuckerkonzentration aus dem beobachteten FRET-Verhältnis aufzubauen. Es sei r das Verhältnis der Emissionsintensität von GFP bei 480 nm und die Emissionsintensität von YFP erzeugt bei 530 nm (Gl. 1) definieren.
Die Dosis-Wirkungs-Kurve des FRET Biosensor (CMY-BII bei 53 ° C) kann durch Beobachtung der FRET - Verhältnis, r, bei verschiedenen Zuckerkonzentrationen erzeugt werden. Die Kurve kann dann als eine S-förmige sigmoidalen Kurve wie folgt ausgedrückt werden:
R max und R min das Signalverhältnis mit Zucker - Konzentrationen von 0 und gesättigt (1,000 uM) darstellen, verbunden sind; x 0 die Zuckerkonzentration bei 50% Reaktion; und p die Steigung der Antwort, die zu 1 oder -1 liegt. In der vorliegenden Studie r max, r min, x 0 ist , und p 4,256, 2,672, 71,779, bzw. 1 sind. Der Konzentrationsbereich von 1 um bis 1000 um wurde in der Modellanpassung verwendet.
Unter Verwendung der Gleichungen 1 und 2 wurde der Zuckergehalt von im Handel erhältlich Getränke mit dem FRET-Analysator quantifiziert. Zwei Maltose FRET - Sensoren wurden untersucht , das Signal zu prüfen, r, in Abhängigkeit von verschiedenen Temperaturen 2,8. Der erste FRET-Sensor, CMY-0, ist ein grundlegendes FRET-basierten Sensor, bestehend aus CFP, Maltose-bindendes Protein (MBP) und YFP, mit no Linkerpeptide. Der zweite Sensor, CMY-BII, hat einen Ser-Arg - Linker zwischen MBP und den beiden Fluoreszenzproteine 2. Wie 1A zeigt, CMY-0 nicht an Messtemperaturen unter 50 ° C beobachtet, da es keine Signaldifferenz zwischen 0 und 1 mM Maltose - Konzentration ist. Die Signalunterschiede beider FRET - Sensoren zwischen 50 und 55 ° C (Abbildung 1) 8 maximiert wurden. Um wurde der Zuckergehalt der drei Arten von im Handel erhältlichen Getränke, eine Dosis-Wirkungs-Kurve des CMY-BII Sensors bei 53- ° C zu quantifizieren erzeugt (2A) und der Maltosegehalt der drei Proben wurde identifiziert durch das FRET-Verhältnis in das Maltose-Konzentration umgewandelt wird.
Wie Probe A von Körnern wie Reis und Gerste hergestellt ist, die wichtige Maltose Quellen sind, wurde die Probe zu erwarten relativ hohen Maltosegehalt (Mittelwert 11,892 g / 235 ml) enthalten ( 
Abbildung 1. FRET Signalunterschied zwischen 0 und 1 mM Maltose unter Verwendung des FRET Analyzer bei verschiedenen Temperaturen. (A) Die CMY-0 Sensor zeigte keine Signaldifferenz bei verschiedenen Konzentrationen Maltose bei Temperaturen unter 50 ° C. (B) Die CMY-BII Sensor konnte die FRET Signaldifferenz zwischen 0 und 1 mM Maltose in einem weiten Temperaturbereich zu unterscheiden. (- 55 ° C 50) In beiden Fällen ist die Signaldifferenz drastisch in einem bestimmten Temperaturbereich erhöht. Die error Balken stellen Standardabweichung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2. Maltosegehalt Quantifizierung in drei kommerziell erhältliche Getränke. (A) eine Dosis-Wirkungskurve für die CMY-BII. (B) Maltosegehalt von drei Getränkeproben wurde quantifiziert. Beachten Sie, dass "Gesamtzucker" die Menge aller Zucker zeigt der Getränkehersteller auf dem Getränk Etikett ausgewiesen (einschließlich Maltose). Die Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Quantifizierung des Zuckergehalts in Getränkeproben, eine maßgeschneiderte FRET - Analysator 7 bei einer optimalen Temperatur für FRET - Sensoren. Der Analysator wurde entwickelt mit einem kürzlich entwickelten, kostengünstigen 405-nm-Band Ultraviolett-LED als die Lichtquelle und zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. Diese Vorrichtung ist kostengünstiger als andere vergleichbare Fluorometer. Die Vorrichtung zeigte eine hohe Nachweisempfindlichkeit, insbesondere wenn das Verhältnis der zwei Emissionswellenlängenbereiche (530 nm und 480 nm) in einem optimalen Temperaturbereich für FRET-Sensoren gemessen wird. Seine Empfindlichkeit und die Intensität bei der Detektion verschiedener Zucker waren besser als die eines Fluoreszenzspektrophotometers Vorrichtung 7.
Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die breite Anwendbarkeit der FRET-basierten Sensoren mit dem maßgeschneiderten FRET-Analysator zu unterstützen. Während der Analysator misst indirekt Zuckergehalt über FRET-Sensoren, it ist klar, dass die Vorrichtung eine Anzahl von den Vorteilen der FRET-Sensoren enthält, einschließlich weit ausfahrbaren gentechnisch veränderten Ligandspezifität, modularer Aufbau, Sensor Konzentration unabhängige Signale und genaue Ausrichtung subzellulärer kleine Moleküle. FRET - Sensoren werden verwendet , tatsächlich eine Vielzahl von kleinen Molekülen zu detektieren, einschließlich Ionen , 9, Häm - 10 und andere. Darüber hinaus mehr als 20 Arten von FRET - Konstrukte leicht zu finden und werden durch die Non - Profit - Hinterlegungs AddGene 11 bestellt.
Trotz der breiten Anwendbarkeit des FRET-Analysator, gibt es zwei Hauptprobleme mit dem Betrieb der Vorrichtung. Erstens, weil Betrieb der Vorrichtung ist relativ einfach, Probenvorverarbeitungsvorrichtung ist der entscheidende Schritt, die Qualität der Erkennung betrifft, außer in Fällen von Fehlfunktion des Geräts. In diesem Protokoll war eine Stufe (Probenverdünnung) ausreichend Flüssigkeitsproben zu verarbeiten, die klar transparent und enthielt kein unlösliches parti warenkeln. Jedoch können auch andere Proben eine zusätzliche Verarbeitung erfordern, unlösliche Materialien, wie beispielsweise zelligen oder Lipidkomponenten zu entfernen. Alle autofluoreszenten Partikel, die die FRET-Signals beeinflussen kann, sollte auch entfernt werden, wie folgende Schritt 2.7 festgestellt. Zweitens, Qualitätskontrolle und Konnektivität mit Krankenhausinformationssystemen Schnittstellen müssen angegangen werden, wie bei allen Arten von Point-of-Care - Tests (POCT) Werkzeuge 12. Da die Signalqualität des FRET-Analysator weitgehend von der Qualität des FRET-Sensors hängt und auf den Vorverarbeitungsschritten werden regelmäßige Qualitätskontrollen erforderlich, um sicherzustellen, dass die Messungen für die regelmäßige Qualitätskontrolle der Datenanalyse innerhalb des Standardsignalbereich bleiben. Die FRET-Sensor Stabilität und Lagerzeit, die beide für weitere zuverlässige Anwendungen wesentlich sind, sollten bei der Qualitätskontrolle überprüft untersucht werden. Richtlinien und die Entwicklung geeigneter Software erstellen können auch die Connectivity-Begrenzung adressieren. Aktuelle Versionen derFRET-Analysator mit RS232-Konnektivität für Remote-Befehlszeilensteuerung ausgestattet, aber die drahtlose Kommunikation kann ein Merkmal der nächsten Version des Analysators sein, die eine verbesserte Schnittstelle für Krankenhausinformationssysteme haben wird.
Allerdings haben die FRET - Sensoren für Substratspezifität konstruiert, ein Ansatz, der normalerweise breiter Spezifität 2 ermöglicht. Folglich kann das FRET-Signal von anderen Bestandteilen, einschließlich anderer Arten von Zuckern in kommerziellen Getränke unbeabsichtigte Störungen auftreten. Weitere Untersuchungen sollten untersuchen, wie FRET-Sensoren auf verschiedenen Zuckermischungen reagieren, um genau die Menge an Zucker zu quantifizieren. Die Zusammenarbeit mit Unternehmen, die die Getränke produzieren wird helfen, den Zuckergehalt bestätigen des FRET-Analysator zu kalibrieren.
Es ist zu erwarten, dass die vorgeschlagene tragbare FRET-Gerät mit verschiedenen FRET Sensoren in POCT Anwendungen verwendet werden. POCT ist für die Beurteilung der Schwangerschaft, Blut verwendetGlucosespiegel, Biomarker-Proteine, infektiöse Bakterien und infektiösen Viren. POCT Methoden haben eine schnelle Durchlaufzeiten und weisen in der Regel niedrige Fehlerraten der geringen Anzahl von Verarbeitungsschritten zurückzuführen ist. Dies sind wichtige Vorteile von POCT über das Zentrallabor Testansatz. Handgehaltene POCT Vorrichtungen, wie die Vorrichtung hier beschrieben ist, haben Aufmerksamkeit erregt Erhöhung wegen ihrer möglichen Anwendungen in der Lebensmittelbewertung und Blutzuckerkontrolle. Insbesondere Glukose - Monitoring von Blutproben bei Patienten mit Diabetes erfordert eine schnelle, genaue und kosteneffektive POCT - Verfahren 13. Nach dem Ames Research - Team das erste Blutzucker - Teststreifen im Jahr 1965 entwickelt (ein Streifen verwenden , die Glucose - Oxidase enthält), wurden verschiedene Technologien für Blutzuckerüberwachungszwecke vorgeschlagen 12. Die FRET-Analysator ist auch Glucose in Blutproben mit geeigneten Vorverarbeitung von Blut und periplasmatischen Glucose-bindende protei zu erkennenn (MglB) 14 -Basis FRET - Protein.
Einfache und schnelle Methoden für die Lebensmittelqualität Beurteilung erforderlich sind. Der Verzehr von zuckerhaltigen Getränken ist mit einer Vielzahl von Krankheiten und Syndromen, wie erhöhter Body - Mass - Index in der Kindheit 15, Pediatric Obesity 16, und das Risiko von Schlaganfall 17. diese Verbindung Verständnis erfordert eine genaue Messung von Zuckerkomponenten in Getränken. Daher sind die Glucose und Fructose-Konzentrationen von Getränken von Interesse für Wissenschaftler mit der menschlichen Gesundheit besorgt. Dieses Protokoll zeigt die hochempfindliche Leistung des FRET-Analysator mit optimalen Temperaturkontrolle. Das Gerät kann mit verschiedenen FRET - Sensoren verwendet werden 14,15 verschiedene kleine molecules- einschließlich Glucose und Fructose zu erkennen. Unsere tragbaren und wiederaufladbaren Einrichtung, die eine Batterielebensdauer von 10 hat - 20 h, abhängig von der Erwärmungs Protokoll ist anwendbar für POCT. Seine einfache Operationsprotokoll makes das Gerät einfach zu bedienen und eliminiert die Notwendigkeit für komplizierte Ausbildung des Personals. Mit technischen Verbesserungen, einschließlich der Verringerung der Anlagengröße, Minimierung der Vorbehandlungsschritte, und die Identifizierung von praktischen Anforderungen für den Feldeinsatz, wird dieses Gerät fördern FRET-basierte Forschung Entwicklung in kleinen Laborumgebungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier-Projekt (2011-0031944) und der KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
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