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Biochemistry

अत्यधिक संवेदनशील और एक पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक के साथ रैपिड प्रतिदीप्ति पता लगाने

Published: October 1, 2016 doi: 10.3791/54144
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) सेंसर एक कस्टम बनाया पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक का उपयोग कर डेटा के तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील मात्रा का ठहराव का वर्णन है। इस उपकरण में एक महत्वपूर्ण तापमान रेंज है कि संवेदनशीलता का पता लगाने अधिकतम हो, चीनी सामग्री का व्यावहारिक और कुशल मूल्यांकन को सक्षम करने के भीतर माल्टोज पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Abstract

Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण में हाल के सुधारों (झल्लाहट) सेंसर उनके उपयोग के लिए सक्षम है आयनों और अमीनो एसिड सहित विभिन्न छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए। हालांकि, झल्लाहट सेंसर की जन्मजात कमजोर संकेत तीव्रता एक बड़ी चुनौती है कि विभिन्न क्षेत्रों में उनके आवेदन को रोकता है और महंगा, उच्च अंत का उपयोग आवश्यक fluorometers बनाता है। इससे पहले, हम एक लागत प्रभावी, उच्च प्रदर्शन झल्लाहट विश्लेषक कि विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने प्राप्त करने के लिए दो उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य बैंड (530 और 480 एनएम) के अनुपात से उपाय कर सकते हैं का निर्माण किया। अभी हाल ही में यह पाया गया है कि जीवाणु periplasmic बाध्यकारी प्रोटीन के साथ झल्लाहट सेंसर 50 की महत्वपूर्ण तापमान रेंज में अधिकतम संवेदनशीलता के साथ ligands का पता लगाने - 55 डिग्री सेल्सियस। इस रिपोर्ट में एक तापमान विशिष्ट झल्लाहट सेंसर के साथ हमारे पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पेय पदार्थ के नमूनों में चीनी सामग्री का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हमारे परिणाम है कि अतिरिक्त preheating से पता चलाझल्लाहट सेंसर की प्रक्रिया काफी झल्लाहट अनुपात संकेत बढ़ जाती है, चीनी सामग्री के और अधिक सटीक माप सकें। कस्टम बनाया झल्लाहट विश्लेषक और सेंसर सफलतापूर्वक वाणिज्यिक पेय पदार्थों के तीन प्रकार में चीनी सामग्री यों के लिए लागू किया गया था। हम आशा करते हैं जहां उच्च अंत उपकरण उपलब्ध नहीं है कि आगे के आकार में कमी और प्रदर्शन उपकरणों की वृद्धि के वातावरण में हाथ से आयोजित एनालाइजर के उपयोग की सुविधा होगी।

Introduction

Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) व्यापक रूप से शर्करा, कैल्शियम आयनों, और एमिनो एसिड के रूप में 1-4 छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए एक बायोमेट्रिक सेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। झल्लाहट biosensors फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFPS), और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFPs), जो periplasmic बाध्यकारी प्रोटीन (PBPs) के दोनों सिरों से जुड़े हुए होते हैं। शुगर्स झल्लाहट सेंसर के बीच में स्थित PBPs करने के लिए बाध्य है, सेंसर कि बाद में PBPs के दोनों छोर पर दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की दूरी और संक्रमण द्विध्रुवीय रुख बदलने के लिए संरचनात्मक परिवर्तन के कारण। यह परिवर्तन EYFP (530 एनएम) और ECFP (480 एनएम) के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुपात को मापने के द्वारा चीनी सामग्री के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है। उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, वास्तविक समय की निगरानी क्षमता है, और झल्लाहट biosensors के तेजी से प्रतिक्रिया समय के कारण, इन सेंसरों को व्यापक रूप से पर्यावरण औद्योगिक, और चिकित्सा अनुप्रयोगों 5 में इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, ratiomके रूप में यह जटिल जैविक नमूने जहां सेंसर एकाग्रता आसानी से नियंत्रित नहीं किया जा सकता और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति हमेशा मौजूद है में घटकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता झल्लाहट biosensors का उपयोग कर etric माप, महत्वपूर्ण व्यावहारिक लाभ है।

मात्रात्मक दृश्य के लिए झल्लाहट आधारित सेंसर के इन फायदों के बावजूद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए अधूरा डोमेन गति हस्तांतरण के साथ छोटे संरचनात्मक परिवर्तन स्वाभाविक रूप से कमजोर संकेत तीव्रता का उत्पादन। यह कमजोर संकेत इन विट्रो के लिए या विवो विश्लेषण 6 में झल्लाहट आधारित सेंसर के आवेदन की सीमा। नतीजतन, ज्यादातर biosensors महंगा है और अत्यधिक संवेदनशील उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता झल्लाहट। इससे पहले, हम मौजूदा प्रतिदीप्ति एनालाइजर 7 के उन लोगों के लिए इसी तरह की क्षमताओं के साथ एक सस्ता और पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक विकसित की है। इस डिवाइस, सस्ती 405 एनएम बैंड पराबैंगनी प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) में वीं की उत्तेजना पैदा करने के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया थाई प्रतिदीप्ति संकेत, एक महंगी दीपक या लेजर की जगह ले। विश्लेषक का पता लगाने प्रणाली कुशलतापूर्वक एक सिलिकॉन photodiode के साथ दो photodetectors पर dissipating प्रतिदीप्ति संकेत केंद्रित है। एक और अधिक हाल के एक अध्ययन में, हम पता चला है कि 50 में पता लगाने के तापमान के अनुकूलन - 55 डिग्री सेल्सियस काफी ratiometric झल्लाहट संकेत 8 बढ़ाना सकता है। इस तापमान विशिष्ट संकेत वृद्धि, कस्टम बनाया झल्लाहट विश्लेषक के साथ-साथ, तेजी से और उच्च संवेदनशीलता के साथ और अधिक सामान्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में झल्लाहट सेंसर का उपयोग सक्षम बनाता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पेय पदार्थों की चीनी सामग्री बढ़ाता द्वारा इष्टतम झल्लाहट तापमान की शर्तों के तहत झल्लाहट विश्लेषक के सामान्य प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया। इस प्रोटोकॉल झल्लाहट डिवाइस ऑपरेशन का ब्यौरा, साथ ही संवेदक और नमूना तैयार करने का एक संक्षिप्त विवरण प्रदान करता है। हम आशा करते हैं कि इस रिपोर्ट पोर्टेबल के संभावित आवेदन को बढ़ावा देंगेछोटे पैमाने पर प्रयोगशाला वातावरण में विश्लेषक और झल्लाहट आधारित biosensors के साथ एक सस्ती साइट पर नैदानिक ​​उपकरण के आगे विकास के लिए एक आधार प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. Biosensor की तैयारी

  1. प्लाज्मिड pET21a (+) का निर्माण - CFP-MBP-YFP-His6 पहले से स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 2।
  2. एक कोलाई DE3 तनाव का एक भी कॉलोनी के साथ Luria शोरबा (पौंड) के 5 मिलीलीटर टीका लगाना और झटकों के साथ 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. स्थानांतरण एक 500 एमएल 100 मिलीलीटर लेग युक्त और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व 0.5 (लगभग 3 घंटा) तक पहुँच जाता है फ्लास्क में हे / एन संस्कृति के 1 मिलीलीटर।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कम से 1,000 × छ centrifugation द्वारा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं फसल।
  5. गोली जल्दी से 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कम से 1,000 × छ 50 मिलीलीटर ठंडा आसुत जल (DW) और सेंट्रीफ्यूज के साथ प्रत्येक ट्यूब में Resuspend।
  6. धीरे समाधान (electrocompetent कोशिकाओं) तक घूमता द्वारा 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल के साथ ठंडा DW के 50 μl में गोली Resuspend एक आयुध डिपो तक पहुँच जाता है 600
  7. एक electroporation डिवाइस और electroporate में CFP-MBP-YFP-His6 एक ठंडा electroporation क्युवेट में - और प्लाज्मिड pET21a (+) के 10 एनजी (एक आयुध डिपो के 100 में से 600 पर कोशिकाओं के 50 μl) electrocompetent कोशिकाओं के मिश्रण रखें मिश्रण (18 केवी / सेमी, 25 μF)।
  8. जल्दी से 1 मिलीलीटर समाज मध्यम कोमल एक 15 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर क्युवेट करने के लिए जोड़ सकते हैं और कोशिकाओं को धीरे, वसूली के बाद resuspend।
  9. 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त एक लेग थाली पर कोशिकाओं बिखरा हुआ है और 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. एक पाश का उपयोग कर एक भी कॉलोनी को अलग-थलग और लेग 12 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त के 10 मिलीलीटर में कॉलोनी टीका लगाना।
  11. 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त पौंड की 500 मिलीलीटर के लिए बीज संस्कृति के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में संस्कृति सेते हैं।
  12. 0.5 मिमी isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) जब आयुध डिपो 600 तक पहुँच जोड़े0.5 और 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में संस्कृति सेते हैं।
  13. अपकेंद्रित्र पर 20 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) और धीरे सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 4,500 × छ कोशिकाओं।
  14. 5 एमएल बाध्यकारी बफर (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मिमी PMSF, 0.5 मिमी EDTA, और 1 मिमी डीटीटी) में गोली Resuspend।
  15. 200-300 डब्ल्यू पर छह से 10 सेकंड फटने के साथ बर्फ पर कोशिकाओं Sonicate, निम्नलिखित प्रत्येक को ठंडा करने के लिए 10 सेकंड के साथ फट।
  16. 10,000 × पर lysate अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जी सेलुलर मलबे गोली। एक नया संग्रह ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (घुलनशील प्रोटीन) स्थानांतरण।
  17. एक नी NTA आत्मीयता के स्तंभ (5 मिलीलीटर मात्रा) पर झल्लाहट सेंसर प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि, लोड को मंजूरी दे दी सेल lysate के 4 मिलीलीटर को प्राप्त करने और तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) 18 का उपयोग कर एक क्रोमैटोग्राफी परख करने के लिए।
  18. धो बफर के पांच स्तंभ संस्करणों के साथ एक बार स्तंभ धो लें मैं (50 मिमी फॉस्फेट बफर 300 मिमी सोडियम क्लोराइड, 10 मिमी imidazole, 7.0 पीएच)।
  19. धो बफर द्वितीय के पांच स्तंभ की मात्रा (50 मिमी फॉस्फेट बफर 300 मिमी सोडियम क्लोराइड, 20 मिमी imidazole, 7.0 पीएच) के साथ धोने कदम दोहराएँ।
  20. क्षालन बफर के पांच स्तंभ की मात्रा (50 मिमी फॉस्फेट बफर 300 मिमी सोडियम क्लोराइड, 500 मिमी imidazole, 7.0 पीएच) के साथ सेंसर प्रोटीन Elute।
  21. ध्यान केंद्रित करने और eluted नमूना फीका बनाना करने के लिए, पर 3,000 × छ 10 मिनट के लिए नमूना और सेंट्रीफ्यूज के लिए 20 मिलीलीटर के साथ concentrator (10,000 मेगावाट की झिल्ली आकार) भरें। 0.8% फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ concentrator फिर से भरना। इस कदम दो बार दोहराएँ, पहला नमूना के 20 मिलीलीटर के साथ concentrator भरने, और फिर पीबीएस के साथ refilling।
  22. ध्यान केंद्रित किया और de-नमकीन सेंसर प्रोटीन की वसूली और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।

झल्लाहट विश्लेषक का उपयोग चीनी सामग्री की 2. मापन

नोट: झल्लाहट विश्लेषक निर्माण का ब्यौरा हमारे पिछले काम 7 में वर्णित किया गया।

  1. 0.8% पीबीएस युक्त 0.2 की एक का पता लगाने के समाधान तैयारसेंसर प्रोटीन का माइक्रोन।
  2. झल्लाहट विश्लेषक चालू करें। अधिकतम तापमान जांच करने के लिए 2 सेकंड के लिए "उत्तर प्रदेश" बटन दबाएँ। "उत्तर प्रदेश" और "नीचे" बटन का उपयोग कर 53 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट और "सेट" बटन दबाएँ।
  3. अंशांकन, प्रेस और 2 सेकंड के लिए एक साथ "उत्तर प्रदेश" और "नीचे" बटन पकड़ लिए। पुष्टि करें कि एलईडी पैनल प्रदर्शित करता है "CALIB" और "सेट" बटन दबाएँ।
  4. 12.5 × 12.5 × 45 मिमी (लंबाई चौड़ाई × × ऊंचाई) आयताकार समानांतर खात पोत (क्युवेट) केवल पीबीएस विश्लेषक के एक क्युवेट धारक में बफर और "सेट" बटन दबाएँ युक्त रखें।
  5. एक ही पता लगाने के समाधान (2.1 देखें) बिना चीनी (माल्टोज / सूक्रोज) युक्त साथ क्युवेट बदलें और आधारभूत जांच करने के लिए "सेट" बटन दबाएँ।
  6. 10 मिमी चीनी के साथ पता लगाने के समाधान युक्त एक के साथ क्युवेट बदलें और "सेट" प्रेसबटन।
  7. एक पेय पदार्थ के नमूने की चीनी सामग्री का निर्धारण करने के लिए, 1 मिनट के लिए कम से 16,000 × छ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 1 मिलीलीटर पेय नमूना डाल दिया।
    नोट: झल्लाहट सेंसर आधारित प्रतिदीप्ति माप नमूने का नमूना क्योंकि केवल 1% (वी / वी) की विशेष पूर्व उपचार की आवश्यकता नहीं है का लाभ कुल मात्रा में शामिल किया गया है। हालांकि, हम किसी भी सामग्री है कि प्रतिदीप्ति माप (जैसे, सेल, अघुलनशील कणों, लिपिड, वसा, या autofluorescence के साथ किसी भी सामग्री) को प्रभावित कर सकता हटाने की सिफारिश। इसके अलावा, अगर एक मजबूत एसिड, मजबूत आधार, सफाई एजेंट (डिटर्जेंट), या पायसीकारी एजेंट (पायसीकारकों) एक उच्च एकाग्रता में मौजूद है और झल्लाहट जैविक संवेदक के गुणों को प्रभावित कर सकता है, यह एक कार्बनिक विलायक या एक का उपयोग कर हटाया जाना चाहिए neutralizer। उदाहरण के लिए, जब डेयरी वसा और पायसीकारी जमे हुए स्नैक्स से समाप्त हो जाते हैं, नमूने एक microfuge ट्यूब में 16,000 × छ पर 30 मिनट, और तरल betwee के लिए centrifuged कर रहे हैंn नीचे तलछट और डेयरी वसा के ऊपर परत निकाला जाता है। हेक्सेन के बराबर राशि तो जोड़ा जाता है, पर 15,000 × छ centrifugation द्वारा पीछा 30 मिनट लिपिड को खत्म करने के लिए।
  8. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक सिरिंज फिल्टर (ताकना आकार 0.2 माइक्रोन) के माध्यम से फिल्टर।
  9. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge 0.9 मिलीलीटर पीबीएस और भंवर धीरे युक्त ट्यूब में 0.1 मिलीलीटर फ़िल्टर पेय नमूना रखें।
    नोट: यह पेय नमूना ठीक से कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस मामले में, 1,000 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन किया गया था तो यह है कि चीनी एकाग्रता डिवाइस के गतिशील रेंज के भीतर गिर जाएगी। हम पेय पदार्थ के लेबल में चीनी सामग्री की चर्चा करते हुए अग्रिम में लक्ष्य चीनी एकाग्रता का आकलन सलाह देते हैं।
  10. एक क्युवेट का पता लगाने के समाधान की 0.495 मिलीग्राम से युक्त करने के लिए पतला पेय नमूना (1%, वी / वी) के 5 μl जोड़ें।
  11. झल्लाहट विश्लेषक के एक क्युवेट धारक में क्युवेट की जगह और 53 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना समाधान पहले से गरम।
  12. "सेट" चीनी सामग्री को मापने के लिए बटन दबाएँ।
    नोट यह 488/535 एनएम 7.8 पर अनुपात पढ़ने के द्वारा एक multilabel प्लेट रीडर या एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तापमान नियंत्रण के लिए एक Peltier डिवाइस के साथ सुसज्जित का उपयोग कर झल्लाहट माप का मूल्यांकन करने के लिए संभव है। सुक्रोज का पता लगाने के लिए, एक CSY-एलएच सेंसर 2 के साथ 2.12 करने के लिए 1.1 से चरणों का पालन करें।

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Representative Results

झल्लाहट विश्लेषक का उपयोग चीनी सामग्री के मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए, यह एक फिट की अवस्था मनाया झल्लाहट अनुपात से लक्ष्य चीनी एकाग्रता का आकलन का निर्माण करने के लिए आवश्यक है। आर 480 एनएम पर सीएफपी की उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात को परिभाषित करने और YFP की उत्सर्जन तीव्रता 530 एनएम (Eq। 1) में उत्पन्न करते हैं।

1 समीकरण

(53 डिग्री सेल्सियस पर CMY-BII) झल्लाहट biosensor की खुराक प्रतिक्रिया वक्र झल्लाहट अनुपात, आर, विभिन्न चीनी सांद्रता में देख द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। इस प्रकार के रूप वक्र तो एक एस के आकार sigmoidal वक्र रूप में व्यक्त किया जा सकता है:

2 समीकरण

आर मैक्स और आर मिनट 0 की चीनी सांद्रता और संतृप्त (1000 माइक्रोन) के क्रमश संकेत अनुपात प्रतिनिधित्व करते हैं, एक्स 0 50% प्रतिक्रिया में चीनी एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है; और पी प्रतिक्रिया है, जो 1 या -1 के करीब है की ढलान का प्रतिनिधित्व करता है। वर्तमान अध्ययन, आर मैक्स, आर मिनट, एक्स 0, और पी में 4.256, 2.672, 71.779 और 1, क्रमशः रहे हैं। 1 माइक्रोन से 1000 माइक्रोन के लिए एकाग्रता रेंज मॉडल फिटिंग में इस्तेमाल किया गया था।

समीकरण 1 और 2 का प्रयोग, commercially- उपलब्ध पेय पदार्थों की चीनी सामग्री झल्लाहट विश्लेषक के साथ मात्रा निर्धारित किया गया था। दो माल्टोज झल्लाहट सेंसर संकेत परीक्षण, आर, विभिन्न तापमान 2,8 के आधार पर जांच की गई। पहली झल्लाहट सेंसर, CMY -0, एक बुनियादी झल्लाहट आधारित CFP, माल्टोज़ बाध्यकारी प्रोटीन (MBP), और YFP से मिलकर सेंसर, एन के साथ हैओ लिंकर पेप्टाइड्स। दूसरे सेंसर, CMY-BII, MBP और दो प्रतिदीप्ति प्रोटीन 2 के बीच एक सेवा-Arg लिंकर है। चित्रा 1 ए से पता चलता है के रूप में, CMY -0, 50 डिग्री सेल्सियस से नीचे माप तापमान पर नहीं मनाया जाता है वहाँ के रूप में 0 और 1 मिमी माल्टोज एकाग्रता के बीच कोई संकेत अंतर है। दोनों का संकेत मतभेदों झल्लाहट (चित्रा 1) सेंसर 50 और 55 डिग्री सेल्सियस के बीच maximized रहे थे 8। आदेश में वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पेय पदार्थों के तीन प्रकार की चीनी सामग्री यों करने के लिए, 53- डिग्री सेल्सियस पर CMY-BII सेंसर की एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न किया गया था (चित्रा 2A) और तीन नमूनों की माल्टोज सामग्री द्वारा की पहचान की थी माल्टोज एकाग्रता में झल्लाहट अनुपात परिवर्तित।

नमूना एक जैसे चावल और जौ जैसे अनाज, जो महत्वपूर्ण स्रोत हैं माल्टोज से बना है के रूप में, नमूना अपेक्षाकृत उच्च माल्टोज सामग्री शामिल की उम्मीद थी (औसत 11.892 जी / 235 मिलीलीटर) (

आकृति 1
चित्रा 1. झल्लाहट संकेत के बीच 0 और 1 मिमी Maltose अंतर विभिन्न तापमान पर झल्लाहट विश्लेषक का उपयोग कर। (ए) CMY-0 संवेदक 50 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान पर अलग माल्टोज सांद्रता में कोई संकेत अंतर दिखाया। (बी) CMY-BII सेंसर तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला में 0 और 1 मिमी माल्टोज के बीच संकेत झल्लाहट अंतर भेद करने में सक्षम था। (- 55 डिग्री सेल्सियस 50) दोनों ही मामलों में, संकेत अंतर नाटकीय रूप से एक विशिष्ट तापमान रेंज में वृद्धि हुई है। ईrror सलाखों के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Maltose CMY-BII के लिए तीन वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पेय पदार्थ। (ए) एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र में सामग्री मात्रा। (बी) के तीन पेय पदार्थ के नमूने की Maltose सामग्री की मात्रा निर्धारित किया गया था। ध्यान दें कि "कुल चीनी" सभी चीनी (माल्टोज़ सहित) की मात्रा पेय लेबल पर पेय निर्माता द्वारा रिपोर्ट इंगित करता है। त्रुटि पट्टी मानक विचलन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल पेय पदार्थ के नमूनों में चीनी सामग्री के तेजी से और कुशल मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, झल्लाहट सेंसरों के लिए एक अधिकतम तापमान में एक कस्टम बनाया झल्लाहट विश्लेषक 7 का उपयोग कर। विश्लेषक एक हाल ही में विकसित की है, सस्ती 405 एनएम बैंड प्रकाश स्रोत और एक सिलिकॉन photodiode के साथ दो photodetectors के रूप में पराबैंगनी एलईडी के साथ डिजाइन किया गया था। इस डिवाइस को अधिक लागत प्रभावी अन्य तुलनीय fluorometers से अधिक है। डिवाइस, उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने से पता चला है विशेष रूप से जब झल्लाहट सेंसरों के लिए एक इष्टतम तापमान रेंज में दो उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य बैंड (530 एनएम और 480 एनएम) के अनुपात को मापने। अपनी संवेदनशीलता और विभिन्न शर्करा का पता लगाने में तीव्रता एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर डिवाइस 7 के उन लोगों के लिए बेहतर थे।

इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य कस्टम बनाया झल्लाहट विश्लेषक के साथ झल्लाहट आधारित सेंसर की व्यापक प्रयोज्यता का समर्थन है। विश्लेषक परोक्ष रूप से झल्लाहट सेंसर के माध्यम से चीनी सामग्री के उपाय करते हैं, मैंटी कि डिवाइस व्यापक रूप से बढ़ाई अनुवांशिक इंजीनियर ligand विशिष्टता, मॉड्यूलर डिजाइन, सेंसर एकाग्रता स्वतंत्र संकेत है, और subcellular छोटे अणुओं की सटीक लक्ष्य-निर्धारण सहित झल्लाहट सेंसर, के लाभ के एक नंबर शामिल स्पष्ट है। झल्लाहट सेंसर वास्तव में आयनों 9, हीम 10, और अन्य लोगों सहित छोटे अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, झल्लाहट निर्माणों के 20 से अधिक प्रकार के आसानी से पाया और गैर लाभ डिपॉजिटरी Addgene 11 के माध्यम से आदेश दिया जा सकता है।

झल्लाहट विश्लेषक की व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, वहाँ डिवाइस के संचालन के साथ दो मुख्य मुद्दे हैं। सबसे पहले, क्योंकि डिवाइस के आपरेशन अपेक्षाकृत सरल है, नमूना preprocessing महत्वपूर्ण कदम है कि इस उपकरण की खराबी के मामलों को छोड़कर, पता लगाने की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इस प्रोटोकॉल में, एक कदम (नमूना कमजोर पड़ने) तरल नमूने है कि स्पष्ट रूप से पारदर्शी थे पर कार्रवाई करने के लिए पर्याप्त था और कोई अघुलनशील गड्ड निहितcles। हालांकि, अन्य नमूने ऐसे सेलुलर या लिपिड घटक के रूप में अघुलनशील सामग्री, को दूर करने के लिए अतिरिक्त संसाधन की आवश्यकता हो सकती है। किसी भी autofluorescent कणों कि संकेत झल्लाहट प्रभावित कर सकते हैं भी, हटा दिया जाना चाहिए के रूप में कदम 2.7 निम्न का उल्लेख किया। दूसरे, गुणवत्ता नियंत्रण और कनेक्टिविटी अस्पताल सूचना प्रणाली के साथ interfacing बिंदु का ध्यान परीक्षण (POCT) उपकरण 12 के सभी प्रकार के साथ के रूप में, को संबोधित करने की जरूरत है। चूंकि झल्लाहट विश्लेषक के संकेत गुणवत्ता काफी हद तक झल्लाहट सेंसर की गुणवत्ता पर और preprocessing कदम पर निर्भर करता है, नियमित रूप से गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच सुनिश्चित करने के लिए कि माप नियमित रूप से गुणवत्ता नियंत्रण डेटा विश्लेषण के लिए मानक संकेत सीमा के भीतर रहने के लिए आवश्यक हैं। झल्लाहट सेंसर स्थिरता और भंडारण अवधि, जो दोनों के आगे विश्वसनीय अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं, गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच के दौरान जांच की जानी चाहिए। दिशा निर्देशों बनाना और उपयुक्त सॉफ्टवेयर के विकास को भी कनेक्टिविटी सीमा को संबोधित कर सकते हैं। के वर्तमान संस्करणझल्लाहट विश्लेषक दूरस्थ कमांड लाइन नियंत्रण के लिए RS232 कनेक्टिविटी से लैस हैं, लेकिन वायरलेस संचार विश्लेषक के अगले संस्करण है, जो अस्पताल सूचना प्रणाली के लिए एक बेहतर इंटरफ़ेस होगा की एक विशेषता हो सकता है।

हालांकि, झल्लाहट सेंसर सब्सट्रेट विशिष्टता के लिए इंजीनियर किया गया है, एक दृष्टिकोण है कि सामान्य रूप से व्यापक विशिष्टता 2 अनुमति देता है। नतीजतन, झल्लाहट संकेत वाणिज्यिक पेय पदार्थों में शर्करा के अन्य प्रकार के सहित अन्य सामग्री, से अनायास ही हस्तक्षेप आ सकती है। आगे की जांच का पता लगाने चाहिए कैसे झल्लाहट सेंसर विभिन्न चीनी के मिश्रण का जवाब सही ढंग से चीनी की मात्रा यों की। कंपनियों है कि पेय पदार्थों के उत्पादन के साथ सहयोग में मदद मिलेगी चीनी सामग्री पुष्टि झल्लाहट विश्लेषक की जांच करने के लिए।

यह अनुमान है कि विभिन्न झल्लाहट सेंसर के साथ प्रस्तावित पोर्टेबल डिवाइस झल्लाहट POCT अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा। POCT गर्भावस्था, रक्त का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता हैग्लूकोज का स्तर, बायोमार्कर प्रोटीन, संक्रामक बैक्टीरिया, वायरस और संक्रामक। POCT तरीकों में तेजी से बदलाव समय है और आम तौर पर प्रसंस्करण कदम की छोटी संख्या के कारण कम त्रुटि दर दिखा रहे हैं। इन केंद्रीय प्रयोगशाला परीक्षण दृष्टिकोण पर POCT के महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं। इस तरह के डिवाइस के साथ साथ वर्णित के रूप में हाथ से आयोजित पोर्टेबल उपकरणों POCT, भोजन आकलन और रक्त में शर्करा की निगरानी में अपने संभावित अनुप्रयोगों की वजह से बढ़ती ध्यान आकर्षित किया है। विशेष रूप से, मधुमेह के रोगियों में रक्त के नमूनों की ग्लूकोज की निगरानी के लिए एक तेजी से, सही, और लागत प्रभावी POCT विधि 13 की आवश्यकता है। बाद एम्स रिसर्च टीम 1965 में पहली बार रक्त ग्लूकोज परीक्षण पट्टी विकसित (एक पट्टी है कि ग्लूकोज oxidase शामिल है का उपयोग), कई प्रौद्योगिकियों रक्त ग्लूकोज की निगरानी उद्देश्यों के 12 के लिए प्रस्तावित किया गया। झल्लाहट विश्लेषक भी रक्त और periplasmic ग्लूकोज बाध्यकारी protei की उचित preprocessing के साथ रक्त के नमूनों में ग्लूकोज का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैn (MglB) 14 आधारित झल्लाहट प्रोटीन।

भोजन की गुणवत्ता के आकलन के लिए सरल, तेजी से तरीकों की जरूरत है। चीनी युक्त पेय पदार्थों की खपत में इस तरह के बचपन के 15 में वृद्धि की बॉडी मास इंडेक्स, बाल चिकित्सा मोटापा 16, और 17 स्ट्रोक का खतरा जैसे रोगों और सिंड्रोम, की एक किस्म के साथ जुड़ा हुआ है। इस संबंध समझना पेय पदार्थों में शर्करा के घटकों का सही माप जरूरी है। इसलिए, पेय पदार्थों की ग्लूकोज और फ्रुक्टोज सांद्रता मानव स्वास्थ्य के साथ संबंध वैज्ञानिकों के हित के लिए कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल अधिकतम तापमान नियंत्रण के साथ झल्लाहट विश्लेषक के अत्यधिक संवेदनशील प्रदर्शन को दर्शाता है। डिवाइस ग्लूकोज और फ्रुक्टोज 14,15 सहित विभिन्न छोटे molecules- पता लगाने के लिए विभिन्न झल्लाहट सेंसर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे पोर्टेबल और रिचार्जेबल डिवाइस है, जो 10 की एक बैटरी जीवन है - 20 घंटा के हीटिंग प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, POCT के लिए लागू है। इसका सरल परिचालन प्रोटोकॉल पहुंचतों डिवाइस का उपयोग आसान और जटिल कर्मचारियों के प्रशिक्षण के लिए की आवश्यकता समाप्त करने के लिए। उपकरण आकार में कमी, pretreatment कदम की कमी, और क्षेत्र में उपयोग के लिए व्यावहारिक आवश्यकताओं की पहचान सहित तकनीकी सुधार के साथ, इस उपकरण के छोटे पैमाने पर प्रयोगशाला वातावरण में झल्लाहट आधारित अनुसंधान और विकास को बढ़ावा देंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध नेटवर्किंग फ्रंटियर परियोजना (2011-0031944) और KRIBB रिसर्च इनिशिएटिव कार्यक्रम के बुद्धिमान सिंथेटिक जीव विज्ञान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB BD #244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) Sigma I6758
Ampicillin Sigma A9518
Tri-HCl Bioneer C-9006-1
PMSF Sigma 78830
EDTA Bioneer C-9007
DTT Sigma D0632
NaCl Junsei 19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 70011-044 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q Amersham Biosciences 17-1177-01 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column 
HisTrap HP1 Amersham Biosciences 29-0510-21
Quartz cuvette Sigma Z802875
AKÄKTAFPLC Amersham Biosciences 18-1900-26 a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse VarianInc a fluorescence spectrophotometer
VICTOR   PerkinElmer 2030-0050 a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3) Promega Electrocompetent cells
A (Beverage) Korea Yakult Co. (Korea) Birak Fermented drinks
B (Beverage) Lotte Foods (Korea) Epro Soft drink
C (Beverage) Lotte Foods (Korea) Getoray Sports drink

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References

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जैव रसायन अंक 116 प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण पोर्टेबल डिवाइस बिंदु का ध्यान परीक्षण चीनी सामग्री fluorometer भोजन आकलन Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)
अत्यधिक संवेदनशील और एक पोर्टेबल झल्लाहट विश्लेषक के साथ रैपिड प्रतिदीप्ति पता लगाने
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Kim, H., Han, G. H., Fu, Y., Gam, J., Lee, S. G. Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer. J. Vis. Exp. (116), e54144, doi:10.3791/54144 (2016).

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