Summary
이 프로토콜은 주문품 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 센서 데이터의 신속한 고감도 정량 설명한다. 장치는 당도 실용적이고 효율적인 평가를 가능하게 검출 감도를 최대화하는 임계 온도 범위 내에서 말토오스를 검출하기 위해 사용 하였다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달이 최근 개선 (FRET) 센서는 이온 및 아미노산을 포함하여 다양한 작은 분자를 검출하기 위해 사용을 사용할 수있다. 그러나, FRET 센서의 본래 약한 신호 세기는 다양한 분야에의 응용을 방지하고 비싼 고성능의 사용이 필요하게 fluorometers 중요한 과제이다. 이전에, 우리는 특히 높은 검출 감도를 달성하기 위해 두 개의 발광 파장 대역 (530 및 480 ㎚)의 비율을 측정 할 수있는 경제적 인 고성능 FRET 분석 내장. 55 °의 C - 더 최근에는 세균의 세포질 단백질과 결합 FRET 센서 (50)의 임계 온도 범위에서 최대 감도 리간드를 검출하는 것이 발견되었다. 이 보고서는 온도 별 FRET 센서 우리 FRET 휴대용 분석기를 사용하여 시판 음료 샘플 당 함량을 평가하기위한 프로토콜을 설명한다. 우리의 결과는 추가 예열 것으로 나타났다프렛 센서의 과정은 상당히 당도의보다 정확한 측정을 가능하게하려면 FRET 비율 신호를 증가시킨다. 주문품 FRET 분석과 센서 성공적 상용 음료의 세 종류의 당 함량을 정량하기 위해 적용 하였다. 우리는 하이 엔드 장비는 가능하지 않은 장치의 추가적인 소형화 및 성능 향상이 환경에서 휴대용 분석기의 사용을 용이하게 할 것으로 예상된다.
Introduction
포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 널리 당, 칼슘 이온, 아미노산 1-4와 같은 작은 분자를 검출하는 바이오 센서로서 사용되어왔다. FRET 바이오 센서는 형광 단백질, 시안 형광 단백질 (CFP들), 및 주변 세포질 결합 단백질 (PBPs)의 양단에 융합 노란색 형광 단백질 (YFPs)를 포함한다. 당류는 이후 PBPs 양쪽 끝에 두 형광 단백질의 거리 및 전이 쌍극자의 방향을 변경하는 센서의 구조 변화를 일으키는 FRET 센서의 중앙에 위치 PBPs 바인딩. 이러한 변화는 EYFP (530 ㎚) 및 ECFP (480 ㎚)의 발광 파장의 비율을 측정함으로써, 당 함량의 정량 분석을 가능하게한다. 높은 민감도, 특이도, 실시간 모니터링 능력 및 FRET 바이오 센서의 빠른 응답 시간으로 인해, 이러한 센서는 크게, 환경 산업, 의료 분야 5에 사용된다. 또한, ratiom이 센서의 농도를 용이하게 제어 및 배경 형광이 항상 존재할 수없는 복잡한 생물학적 시료의 성분을 측정하기 위해 사용될 수있다 FRET 바이오 센서를 사용하여 측정 etric 중요한 실용적인 장점을 갖는다.
양적 시각화를위한 FRET 기반 센서의 이러한 장점에도 불구하고, 형광 단백질에 불완전 도메인 모션 전송 작은 구조적 변화는 본질적으로 약한 신호 강도를 생산하고 있습니다. 이 약한 신호는 시험 관내 또는 생체 내 분석 6 FRET 기반 센서의 적용을 제한합니다. 따라서, 대부분의 바이오 센서가 고가 민감한 장비를 사용해야 FRET. 이전에는, 기존 형광 분석기 (7)의 것과 유사한 기능을 저렴하고 휴대용 FRET 분석을 개발 하였다. 이 장치 저렴 405 nm의 대역 자외선 발광 다이오드 (LED)에서는 제의 여기를 야기하는 광원으로서 사용 된즉 형광 신호 고가 램프 또는 레이저를 교체. 광자의 검출 시스템은 효율적으로 실리콘 광 다이오드 두 광 검출기 상으로 발산 형광 신호를 집중한다. 55 ° C를 크게 비율 계량 FRET 신호 (8)을 확대 할 수 - 더 최근의 연구에서 우리는 50에서 검출 온도의 최적화는 것을 보여 주었다. 이 온도 별 신호 향상은 맞춤형 FRET 분석과 함께 신속한 고감도 일반적인 진단 애플리케이션 FRET 센서의 사용을 가능하게한다.
이 프로토콜에서는 시판 음료의 당 함량을 정량함으로써 FRET 최적 온도 조건 하에서 분석 FRET의 일반적인 적용 가능성을 보여 주었다. 이 프로토콜은 FRET 장치 동작의 세부 사항뿐만 아니라 센서 샘플 준비에 대한 간략한 설명을 제공한다. 우리는이 보고서는 휴대용의 잠재적 인 응용 프로그램을 촉진 것으로 예상소규모 실험실 환경 분석기 FRET 기반 바이오 센서와 저가의 현장 진단 장치의 추가 개발을위한 기반을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
바이오 센서 1. 준비
- 이전에 확립 된 프로토콜 2에 따라 CFP-MBP-YFP-을 His6 - 플라스미드 pET21a (+)를 구축합니다.
- 대장균 DE3 균주의 단일 콜로니로 루리아 국물 (LB) 5 ㎖를 접종하고 진탕 16 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 전송 100 ㎖ LB를 함유하는 600 나노 미터 (OD 600)에서의 광학 밀도가 0.5 (약 3 시간)에 도달 할 때까지 진탕 배양기에서 37 ℃에서 부화 500 mL의 플라스크에 O / N 배양 1 ㎖.
- 4 ℃에서 20 분 동안 1000 × g에서 원심 분리하여 50ml의 원뿔형 튜브에 세포를 수확.
- 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 × g에서 50 ml의 얼음처럼 차가운 증류수 (DW) 및 원심 각 튜브에 신속하게 펠렛을 재현 탁.
- 부드럽게 용액 (electrocompetent 세포)까지 소용돌이에 의해 10 % (v / v) 글리세롤과 빙냉 DW 50 μL에 펠렛을 재현 탁 것은 OD에 도달 (600)
- 일렉트로 장치와 electroporate에 빙냉 전기 천공 큐벳에 CFP-MBP-YFP-을 His6 - 플라스미드 pET21a (+) 10 ng의 (AN OD 100 (600)에서 세포의 50 μL) electrocompetent 세포의 혼합물을 놓고 혼합물 (18 kV로 / ㎝, 25 μF).
- 신속 완만 15 mL의 둥근 바닥 튜브에 진탕하면서 1 시간 동안 37 ℃에서 회복 하였다 부드럽게 세포를 큐벳에 1 mL의 SOC 배지를 추가하고 재현 탁.
- 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 세포를 확산하고 12 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 루프를 사용하여 단일 콜로니를 분리 및 LB는 12 시간 동안 진탕 기에서 37 ℃에서 100 ㎍ / ml 암피실린 10ml에 콜로니를 접종.
- 100 ㎍ / ml 암피실린 LB 500 ml의 종자 배양 5 mL를 첨가하고 37 ° C 진탕 배양기에서 배양 물을 배양한다.
- 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG) 때 OD 600에 도달 추가0.5 24 시간 동안 37 ° C 진탕 배양기에서 문화를 품어.
- 원심 분리기 20 분 (4 ° C를) 조심스럽게 뜨는을 제거하기위한 4,500 × g에서 세포.
- 5 mL의 결합 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 8.0, 1 ㎜ PMSF, 0.5 mM의 EDTA, 1 mM의 DTT)의 펠렛을 재현 탁.
- 각각의 냉각 10 초 버스트 다음, 200 ~ 300 W에서 여섯 10 초 버스트 얼음에 세포를 초음파 처리.
- 10,000 ×에서 해물을 원심 분리기 4 ° C에서 30 분 동안 g는 세포 파편 펠렛합니다. 새 컬렉션 튜브에 뜨는 (가용성 단백질)을 전송합니다.
- 나 Ni-NTA 친 화성 컬럼 (5 ㎖의 부피) 상에 FRET 센서 단백질의 친 화성 정화, 부하 클리어 세포 용 해물의 4 ml의를 달성하고 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) (18)를 사용하여 크로마토 그래피 분석을 수행 할 수 있습니다.
- 세척 완충액 다섯 컬럼 부피로 한번 씻어 열 I (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸, pH를 7.0).
- 세척 완충액 II 다섯 컬럼 부피 (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, pH를 7.0)으로 세척하는 단계를 반복한다.
- 용출 완충액의 다섯 컬럼 부피 (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨 500 mM의 이미 다졸, pH를 7.0)와 센서 단백질을 용출시켰다.
- 집중 용출 샘플을 탈염, 3,000 × g에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기의 최대 20 ㎖에 집중 (10,000 MW의 막 크기)를 입력합니다. 0.8 % 인산 완충 식염수 (PBS)로 집중 리필. 첫 번째 샘플의 20 ml의 집중을 충전 한 후 PBS로 채우는 두 번이 단계를 반복합니다.
- 농축 및 탈 소금에 절인 센서 단백질 복구 및 -80 ° C에서 보관합니다.
프렛 분석기를 사용하여 당도 2. 측정
참고 : FRET 분석기 건설의 세부 사항은 이전 작품 7에 설명 하였다.
- 0.8 % 0.2 PBS를 함유하는 검출 솔루션을 준비센서 단백질 μM.
- 프렛 분석기를 켭니다. 최적의 온도를 보정하기 위해 2 초 동안 "UP"버튼을 누릅니다. 은 "UP"과 "DOWN"버튼을 사용하여 53 ° C로 온도를 설정하고 "SET"버튼을 누릅니다.
- 교정, 언론과 2 초 동안 동시에 "UP"과 "DOWN"버튼을 길게하십시오. LED가 패널에 "CALIB"하고는 "SET"버튼을 눌러 확인합니다.
- 만 PBS는 분석기의 큐벳 홀더에 버퍼 및 "SET"버튼을 누르면이 포함 된 12.5 × 12.5 × 45mm (길이 × 폭 × 높이) 직육면체 용기 (큐벳)를 놓습니다.
- 하나는 설탕 (맥아당 / 크로스)없이 오직 탐지 솔루션 (2.1 참조) 함유 큐벳을 교체하고베이스 라인을 교정하기 위해 "SET"버튼을 누릅니다.
- 10 mM의 설탕 검출 솔루션을 포함하는 하나 큐벳을 교체하고 "SET"를 눌러단추.
- 음료 샘플의 당 함량을 결정하기 위해 1 분 동안 16,000 × g에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 1 ㎖의 음료 샘플을 넣어.
주 : FRET 센서 계 형광 측정 총량에 포함되는 샘플의 때문에 1 % (v / v)로 시료의 특별한 전처리를 필요로하지 않는 장점을 갖는다. 그러나, 우리는 형광 측정 (예를 들면, 세포, 불용성 입자, 지질, 지방, 또는 자기 형광과 자료를) 영향을 줄 수있는 물질을 제거하는 것이 좋습니다. 강산, 강염기, 제 (세정제)를 청소하거나, 유화제 (유화제)이 고농도로 존재하고 FRET 생물학적 센서의 특성에 영향을 미칠 수있는 경우 또한, 그 유기 용매 또는를 사용하여 제거되어야 중화제. 우유 지방, 유화제가 스낵 냉동로부터 제거되는 경우, 예를 들어, 샘플은 30 분, 액체 betwee 16,000 × g에서 미세 원심 분리 튜브에서 원심 분리N 바닥 침전물과 우유 지방의 상층을 추출한다. 헥산의 동일한 양을 30 분 지질을 제거하기 위해 15,000 × g에서 원심 분리 후 첨가한다. - 1 ML의 주사기로 상층 액을 제거하고 주사기 필터 (기공 크기 0.2 μm의)를 통해 필터링합니다.
- 부드럽게 0.9 ml의 PBS와 소용돌이를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 음료 샘플 필터링 0.1 ml에 놓습니다.
참고 : 제대로 음료 샘플을 희석하는 것이 중요합니다. 당 농도가 상기 장치의 동적 범위에 속하는 것이라고이 경우, 1000 배 희석을 수행 하였다. 우리는 음료의 라벨의 당도를 참조하여, 사전에 목표 당 농도를 추정 바랍니다. - 검출 용액 0.495 mL를 함유하는 큐벳 (1 % v / v)로 희석 된 음료 시료 5 μL를 추가한다.
- 프렛 분석기의 큐벳 홀더에 큐벳을 놓고 53 ° C에 시료 용액을 예열.
- 설탕 함량을 측정 할 수있는 "SET"버튼을 누릅니다.
535분의 488 내지 7,8의 비율을 판독하여 온도 제어하는 펠티에 소자를 구비 한 다중 레벨 플레이트 판독기 또는 형광 분광 광도계를 이용하여 FRET 측정을 평가하는 것이 가능합니다. 크로스 탐지를 들어, CSY-LH 센서 2 2.12 1.1의 단계를 따릅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
프렛 분석기를 사용 당도의 정량 분석을 수행하기 위해, 관찰 된 FRET 비율에서 표적 당 농도를 추정 피팅 곡선을 구축 할 필요가있다. R은 480 nm에서 CFP의 발광 강도의 비율을 정의 YFP의 발광 강도가 530 나노 미터 (식. 1)에서 생성하자.
(53 ° C에서 CMY-BII)를 FRET 바이오 센서의 용량 - 반응 곡선은 다른 당 농도에서 FRET 비율 (R)를 관찰함으로써 생성 될 수있다. 다음 곡선은 다음 S 형상의 S 자형 곡선으로 표현 될 수있다 :
R 최대 및 R 최소 각각 당 10-0의 농도 및 포화 (1000 μM)와 신호의 비율을 나타내며, X 0 50 % 응답에서 당 농도를 나타내고; p는 1 또는 -1에 가까운 응답의 기울기를 나타낸다. 본 연구, 연구 맥스, R 최소, X 0, 및 P에서 4.256, 2.672, 71.779, 1, 각각 수 있습니다. 1 μM 내지 1000 μM의 농도 범위는 피팅 모델에 사용 하였다.
식 (1) 및 (2) 사용 가능한 시중 음료의 당 함량은 FRET 분석기로 정량 하였다. 두 말토오스 FRET 센서는 다양한 온도 2,8에 따라 R 신호를 테스트하기 위해 조사 하였다. 제 FRET 센서는 CMY-0, N으로, CFP, 말토오스 결합 단백질 (MBP) 및 YFP 이루어진 기본 FRET 기반 센서 인링커 펩타이드 오. 두 번째 센서, CMY-BII는 MBP 두 형광 단백질이 사이에 빼앗아, 인수 링커가 있습니다. 도 1a와 같이 0과 1 mM의 농도 말토오스 간의 신호 차이가 없기 때문에, CMY-0, 50 ° C 이하의 온도에서 측정 관찰되지 않는다. 양자의 신호 차이는 (도 1)가 센서 (50)와 55 ° C 사이의 8 FRET 최대화 하였다. 시판 음료의 세 종류의 당 함량을 정량하기 위하여, 53- ° C에서 CMY-BII 센서의 용량 - 반응 곡선 (도 2A) 및 3 개의 시료의 말 토스 함량 동정은 생성 된 말 토스 농도로 FRET 비율 변환.
샘플 A는 말토오스 중요한 원천 벼와 보리 등의 곡식 이루어지는 바와 같이, 샘플이 비교적 높은 말토오스 콘텐츠를 포함하는 것으로 예상되었다 (평균 11.892 g / 235 mL) 중 ( 
다양한 온도에서 FRET 분석을 이용하여 0과 1 mM의 말토오스 사이도 1 FRET 신호 차이. (A)가 CMY 0 센서는 50 ° C 이하의 온도에서 상이한 토스 농도에서 어떠한 신호도 차이가 없었다. (B)가 CMY-BII 센서는 광범위한 온도 범위에서 0에서 1 밀리미터 사이의 FRET 말토오스 신호의 차이를 구별 할 수 있었다. (- 55 ° C의 50)이 두 경우에서, 상기 신호 차분이 크게 특정 온도 범위에서 증가 하였다. 전자rror 바는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
도 2 말토오스 CMY-BII위한 세 시판 음료수. (A) 투여 량 - 반응 곡선에서 콘텐츠 부량. (B) 세 음료 샘플 토스 함량을 정량 하였다. "총 설탕"음료 라벨에 음료 제조 업체에 의해보고 (맥아당 포함) 모든 설탕의 양을 표시합니다. 에러 바는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 FRET 센서 최적 온도 주문품 FRET 분석 장치 (7)를 이용하여 음료 샘플 당 농도의 신속하고 효율적인 정량화를 허용한다. 이 분석기는 최근에 개발 된 저렴한 405 나노 밴드 광원 및 실리콘 포토 다이오드와 두 개의 광 검출기로 자외선이-LED 설계되었습니다. 이 장치는보다 비용 효율적인 다른 비교 fluorometers보다. FRET 센서를위한 최적의 온도 범위에서 두 개의 발광 파장 대역 (530 nm 내지 480 ㎚)의 비율을 측정 할 때 특히 상기 장치는 높은 검출 감도를 나타냈다. 검출 각종 당류의 감도 및 강도는 형광 분광 장치 (7)보다 우수 하였다.
이 프로토콜의 주요 목표는 맞춤형 FRET 분석과 FRET 기반 센서의 넓은 적용 성을 지원하는 것입니다. 분석기는 간접적으로 FRET 센서를 통해 당도를 측정하는 동안, 난t는 장치가 널리 확장 유전자 조작 리간드 특이성 모듈 설계 센서 농도에 독립적 인 신호 및 세포 내 분자의 작은 정확하게 타겟팅을 포함 FRET 센서의 이점들을 포함하는 것이 명백하다. FRET 센서 실제로 이온 9 헴 (10) 등을 포함한 작은 분자의 다양한 검출하는데 사용된다. 또한, FRET 구조의 20 개 이상의 유형을 쉽게 찾을 수 있으며, 비영리 예탁 AddGene (11)를 통해 주문할 수 있습니다.
프렛 분석기의 광범위한 적용에도 불구하고, 상기 장치의 동작에 두 가지 문제점이있다. 상기 장치의 작동이 상대적으로 간단하기 때문에 먼저, 시료 전처리 장치 오작동의 경우를 제외하고, 감지 품질에 영향을 미치는 중요한 단계이다. 이 프로토콜에서 한 단계 (샘플 희석) 명확하게 투명한 액체 샘플을 처리하기에 충분했다 더 불용성 이상적 상대를 함유하지사이클 사용. 그러나, 다른 샘플은 셀룰러 또는 지질 성분으로 불용성 물질을 제거하기 위해 추가 처리가 필요할 수 있습니다. 단계 2.7 다음 바와 같이 FRET 신호에 영향을 미칠 수있는 모든 autofluorescent 입자도 제거해야한다. 둘째, 품질 관리 및 병원 정보 시스템과의 인터페이스 연결이 시점 관리 테스트 (POCT) 공구 (12)의 모든 형태와 마찬가지로, 해결되어야 할 필요가있다. 프렛 분석기의 신호 품질이 크게 FRET 센서의 품질 및 상기 전처리 단계에 의존하기 때문에, 일정한 품질 제어 검사는 측정 일정한 품질 관리 데이터 분석을위한 표준 신호 범위에 유지되도록 요구된다. 더욱 안정적인 응용에 필수적인 모두의 FRET 센서 안정성과 저장 기간, 품질 관리 검사 동안 조사한다. 해당 소프트웨어 가이드 라인을 작성하고 개발하면 연결 제한을 해결할 수 있습니다. 의 현재 버전FRET 분석 원격 명령 라인 제어 RS232 연결 구비되어 있지만, 무선 통신이 병원 정보 시스템을위한 개선 된 인터페이스를 가질 것이다 분석기의 다음 버전의 기능 일 수있다.
그러나, FRET 센서는 기질 특이성에 대해 일반적으로 광범위한 특이성이 있도록하는 방법을 설계 하였다. 그 결과, FRET 신호는 상용 음료에 설탕의 다른 유형을 포함하여 다른 성분에서 의도하지 않은 간섭이 발생할 수 있습니다. 또한 조사 정확하게 설탕의 양을 정량화하기 위해 다양한 설탕 혼합물에 어떻게 반응하는지 FRET 센서 탐구한다. 음료 생산 업체와의 협력은 FRET 분석기의 교정 설탕 함량을 확인하는 데 도움이됩니다.
다양한 FRET 센서 제안 FRET 휴대용 장치 POCT 응용에 사용될 것으로 예상된다. POCT는 임신, 혈액을 평가하기 위해 사용된다글루코스 레벨, 바이오 마커 단백질, 감염성 박테리아 및 바이러스 감염. POCT 방법은 빠른 처리 시간이 일반적으로 처리 단계 소수 때문에 낮은 에러율을 나타낸다. 다음은 중앙 실험실 시험 방법을 통해 POCT의 중요한 장점이다. 본원에 개시된 장치와 같은 핸드 헬드 휴대용 장치 POCT는 때문에 음식 평가 및 혈당 모니터링 그들의 응용 가능성을 증가 주목 받고있다. 특히, 당뇨병 환자의 혈액 샘플의 포도당 모니터링은 신속하고 정확하며 경제적 POCT 방법 (13)을 필요로한다. 에임스 연구팀 (글루코스 옥시 다제를 포함하는 스트립을 사용) 1965 년 제 혈당 테스트 스트립을 개발 한 후, 여러 가지 기술이 혈당 모니터링을 위해 (12)을 위해 제안되었다. 프렛 분석기는 혈액과 주변 세포질 포도당 결합 PROTEI의 적절한 전처리와 혈액 샘플에서 포도당을 감지도 가능N (MglB) 14 기반의 FRET 단백질.
식품 품질 평가를위한 간단하고 빠른 방법이 필요하다. 설탕 함유 음료의 소비는 증가 된 체질량 지수 15 아동기 소아 비만 (16)와 스트로크 (17)의 위험과 같은 질병 증후군의 다양한 관련된다. 이 연결을 이해하는 음료에 설탕 성분의 정확한 측정을 필요로한다. 따라서, 음료의 포도당과 과당의 농도는 인간의 건강에 관심 과학자 관심이다. 이 프로토콜은 최적의 온도 조절과 FRET 분석기의 고감도 성능을 보여줍니다. 장치는 포도당과 과당 (14, 15)을 포함하는 다양한 작은 molecules-를 검출하는 각종 센서 FRET 사용될 수있다. (10)의 배터리 수명을 갖는 우리의 휴대용 충전식 장치 - 상기 가열 프로토콜에 따라 20 시간이 POCT에 적용 할 수있다. 간단한 조작 프로토콜 살려ES 쉬운 장치 사용 복잡한 직원 훈련의 필요성을 제거한다. 장치의 크기 감소, 전처리 단계를 최소화하고, 필드 실용화 요건의 확인을 포함하여 기술적 향상으로,이 장치는 소규모 실험실 환경 FRET 기반 연구 개발을 촉진 할 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 글로벌 프론티어 사업 (2011-0031944)과 KRIBB 연구 이니셔티브 프로그램의 지능형 합성 생물학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).
