Abstract
Denne artikel præsenterer en protokol for produktion af protein-baserede nanopartikler, der ændrer den hydrofobe overflade hydrofil ved en simpel sprøjtebelægning. Disse nanopartikler fremstilles ved polymerisationsreaktionen af alkyl cyanoacrylat på overfladen af korn Protein (gliadin) molekyler. Alkyl cyanoacrylat er en monomer, som øjeblikkeligt polymeriserer ved stuetemperatur, når den påføres overfladen af materialer. Dens Polymerisationsreaktionen er indledt af spormængder af svagt basiske eller nukleofile arter på overfladen, herunder fugt. Når polymeriseres, de polymeriserede alkylcyanoacrylater viser en stærk affinitet med objektet materialer, fordi nitrilgrupper er i skelettet af poly (alkyl cyanoacrylat). Proteiner også virke som initiator for denne polymerisation fordi de indeholder amingrupper, der kan initiere polymerisationen af cyanoacrylat. Hvis der anvendes aggregeret protein som initiator, er proteinaggregatet omgivet af den hydrofobepoly (alkyl cyanoacrylat) kæder efter polymerisationsreaktionen af alkyl cyanoacrylat. Ved at styre den eksperimentelle betingelse, er partikler i nanometerområdet produceret. De fremstillede nanopartikler let adsorberes til overfladen af de fleste materialer, herunder glas, metal, plast, træ, læder og tekstiler. Når overfladen af et materiale sprøjtes med den producerede nanopartikel suspension og skyllet med vand, ændrer den micellære struktur nanopartikel sin konformation, og de hydrofile proteiner udsættes for luft. Som et resultat, nanopartikel-coatede overflade ændres til hydrofile.
Protocol
1. affedtende Commercial Gliadin
- Mål 150 ml acetone med en gradueret cylinder og hæld i 250 ml Erlenmeyer-kolbe.
- Under omrøring med et spin bar på en magnetomrører ved stuetemperatur, tilsættes 30 g kommerciel gliadin pulver. Forsegl åbningen af kolben med aluminiumsfolie, og holde på omrøring O / N i hætten.
- Filtrere løsningen med et filtrerpapir.
- filtratet med frisk acetone (ca. 50 ml) vaskes. Lad det stå i 10 minutter for at tillade acetonen at dræne.
- Overfør filtratet sammen med filtrerpapiret nedenunder til en stor skål, såsom en cellekultur firkantet skål. Dække hele skålen med en stor filtrerpapir at bremse fordampningen af resterende acetone.
- Lad filtratet tørre helt i hætten O / N. Opbevar affedtede gliadin i en lufttæt beholder ved stuetemperatur.
2. Fremstilling af renset Gliadin
- Mål 150 ml water med et måleglas og hæld i 1000 ml Erlenmeyer-kolbe.
- Måle 350 ml absolut ethanol med en rod cylinder og hældes i samme 1.000 ml Erlenmeyer-kolbe. Rør kraftigt (800 - 1000 rpm) med et spin bar, indtil der ikke boble genereres fra opløsningen blanding.
- Under omrøring tilsættes 20 g affedtet-kommerciel gliadin pulver. Tilføj gliadin i små mængder ad gangen for at undgå dannelse af klumper, som indeholder luft i midten. Hold på omrøring O / N.
- Overfør hele løsningen til en 1000 ml rod cylinder. Lad det stå i to dage. I løbet af denne tid vil urenheder udfældes på bunden af cylinderen.
- Supernatanten overføres til en rotationsinddamper med en pipette, og ethanolen fjernes fra supernatanten så meget som muligt. Som den procentdel af ethanol reduceres vil gliadin vises i opløsningen som aggregat.
- Frys opløsningen indeholdende gliadin aggregater ved at nedsænke / roterer i methanol/ Tøris-blanding og frysetørres ved -70 ° C under vakuum. Før frysetørring, sørg hele løsningen er frosset uden væske.
BEMÆRK: Den frysetørrede gliadin vil danne et porøst fast stof. - Knus den frysetørrede gliadin med morter og støder, og male med en kaffemølle til at opnå en fin effekt (<0,5 mm). Overfør produktet i en lufttæt beholder og opbevares ved stuetemperatur.
3. polymerisationsreaktion af ECA med Gliadin
- Placer et scintillationshætteglas (volumen er omkring 20 ml) i en vejning balance, og tara. Tilføj 3,2 g destilleret vand og 6,8 g absolut ethanol i scitillation hætteglasset.
- Flyt scintillationshætteglas på en magnetisk omrører, satte en magnetisk spin-bar (20 x 3 mm) i hætteglasset og omrør kraftigt (800 - 1.000 opm), indtil luftbobler er genereret fra den vandige ethanol-blanding.
- Tilsæt 40 pi 4N HCI i hætteglasset under omrøring. Tilføj 20 mg gliadin i hætteglasset mens sti rring, og holde på omrøring indtil gliadin pulveret er fuldstændigt opløst i den vandige ethanol-blanding.
- Efter at sikre den gliadin Opløsningen er klar til det blotte øje, tilsættes langsomt 80 - 100 ul ECA mens omrøring hastighed er stadig 800 - 1000 rpm.
- Sænk omrøringshastigheden til 500 rpm og fortsat omrøring i 1 time. Efterhånden som reaktionen skrider, observere turbiditeten hvilket indikerer, at polymerisationsreaktionen er i gang.
- Når reaktionen er afsluttet, hvorefter opløsningen overføres til centrifugerør og afbalancere vægten af rørene. Centrifugeres reaktionsproduktet ved 10.000 xg i 20 min. I løbet af denne tid, biprodukt præcipitater og nanopartikler forblive i supernantant. Den største del af side produkt er PACA homopolymer.
- Efter centrifugen, overføre den producerede nanopartikel suspension (supernatant) med en pipette til et scintillationshætteglas (eller enhver lufttæt beholder), og opbevare det ved stuetemperatur.
- Forbered 10 g 68 vægt-% vandig ethanol ved blanding af 3,2 g vand og 6,8 g absolut ethanol i 20 ml scintillationshætteglas og rør indtil ingen bobler frembringes fra opløsningen blandingen.
- Tilsæt 40 pi 4N HCI til opløsningen blandingen under omrøring. Der tilsættes 50 pi nanopartikel suspensionen til den fremstillede ethanol opløsning under omrøring.
- Måle størrelsen af nanopartikel med dynamisk lysspredning (DLS) ved anvendelse prøveopløsningen fremstillet ovenfor og følge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Størrelsen af slutproduktet skal være mindre end 200 nm. Hvis det er større end 200 nm, vil produktet ikke være stabile i en længere periode. Større nanopartikler produceres når ansat ECA ikke er friske.
5. Undersøgelse af Produktet
- Forbered en glasplade, såsom en hånd spejl. Vask overfladen af glaspladen med sæbevand. RInse overfladen af glaspladen med strømmende vand. Tør den rensede overflade, eller brug uden tørring i det næste trin.
- Spray nanopartikel suspensionen opnået i 3.6) på en del af glaspladen, og skylle overfladen med strømmende vand straks.
- Spray rent vand på overfladen af glaspladen. Observer coatede (sprøjtet med nanopartikel suspension) overflade hold vandlag, mens det ikke-coatede overflade er klar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanopartikler kan fremstilles i forskellige reaktionsbetingelser. Gliadin formularer aggregerer i bred vifte af ethanol indhold 5. Størrelsen af aggregater skal dog være så lille som muligt, fordi et yderligere lag (dvs.., Polymeriseret ECA) vil blive føjet til dette aggregat og denne proces vil foretage den endelige størrelse større. Hvis endelige størrelse partikel er for stor, vil partiklen blive ustabil og vil let udfældes. Derfor blev 68% vandig ethanol valgt som et reaktionsmedium 4. Størrelsen af den producerede nanopartikel er i størrelsesordenen nogle få hundrede nanometer. Den arbejder mekanisme for den hydrofile belægning med den producerede nanopartikel er som følger.
Til overfladebehandling af materialer, er denne nanopartikel suspension (suspenderet i 68% ethanol) sprøjtet på overfladen af målmaterialet efterfulgt af skylning med vand. Når nan oparticles suspenderet i vandig ethanol sprøjtes på overfladen af målmaterialet, vandig ethanol let spreder sig til et større område, fordi overfladespændingen af ethanol er meget lav. Denne spredning virkning af vandig ethanol giver de suspenderede nanopartikler på overfladen af målmaterialet hurtigt og jævnt. De leverede nanopartikler adsorberes på materialet på grund af den stærke affinitet af PECA kæder på overfladen af nanopartiklerne. Efterfølgende tilsætning af vand ændrer konformationen af nanopartikler. Med andre ord, den nanopartikel åbner sin struktur for at blotlægge de indre hydrofile proteiner til luften. Som følge af denne konformationsændring, overfladen af det coatede materiale fik hydrofil 8. For at forstå denne konformationsændring af nanopartikler, er denne situation efterlignes ved at nanopartiklerne i forskellige ethanolopløsninger og overvågning zetapotentialet.
1 "src =" / files / ftp_upload / 54.147 / 54147fig1.jpg "/>
Figur 1. Zeta Potentielle og diameteren af den fremstillede nanopartikler i Diverse A queous Ethanol Solutions. Denne graf viser, at hver nanopartikel ændrer sin kropsbygning og dens overflade bliver hydrofil som indholdet af suspension medium ethanol falder. Dette er den arbejder mekanisme af den hydrofile belægning med nanopartikler. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 viser, at nanopartikel fremstillet i 68% vandig ethanol disintegreres til mindre partikler som den omgivende suspensionsmedium indeholder mindre ethanol, fra 68% til 50%. I denne ethanolindhold interval, fejlsøjler af zetapotentiale er store, hvilket betyder, at distribution af overflade afgift er ganske bredt og partikler er ikke godt stabiliseret. Da indholdet af vand øges, den absolutte værdi af zeta potentialet stiger hurtigt, indtil ethanolindholdet falder til 30%. Dette betyder, at overfladen af hver nanopartikel er højt ladet og hydrofiliciteten af partikeloverfladen er væsentligt forøget. Efter dette, går zetapotentialet ikke ændre meget fordi nanopartikler danne aggregater. Denne aggregatdannelse sker ikke, når nanopartikel suspensionen anvendes til hydrofile belægning, fordi partiklerne adsorberes på overfladen af materialer. Kort sagt omfatter fremgangsmåden til den hydrofile belægning indebærer sprøjtning af nanopartikel suspension, adsorption af nanopartikler på overfladen af målmaterialet, og eksponering af indre proteinmolekyler til luften. I virkeligheden hele overtrækningsprocessen foregår i mindre end et minut.
upload / 54.147 / 54147fig2.jpg "/>
Figur 2. SEM Billede af adsorberet nanopartikler. SEM viser fordelingen af nanopartikler på overfladen af en glasplade. På grund af de jævnt fordelte nanopartikler, transmittansen af synligt lys er ikke væsentligt påvirket. Klik her for at se en større version af dette tal.
Som følge af belægningen med nanopartikler, er partikler adsorberet på overfladen af målmaterialet. Figur 2 viser nanopartiklerne adsorberet på overfladen af en glasplade. Dette billede blev taget med en Field Emission-Scanning Electron Microscope (SEM). Dette SEM-billede viser, at alle partikelstørrelser se mindre end 100 nm. Da prøven sputter blev belagt forud for SEM billeddannelse, men der bør være en vis krympning af partikelstørrelse underdenne proces. Dette SEM-billede viser, at nanopartikler er godt dispergeret på overfladen af en glasplade, og der er nok rum mellem partikler for lys at passere igennem. Denne rumlige fordeling af partikler og den lille størrelse af partikler (dvs.., Mindre størrelse end bølgelængden af synligt lys) forklare, hvorfor gennemsigtigheden af glaspladen ikke påvirkes meget af overtrækket.
| Før belægning | efter belægning | |
| Glas | 25,5 ± 1,5 ° | 8,9 ± 0,8 ° |
| Polystyren | 52,7 ± 1,2 ° | 6,8 ± 0,8 ° |
Tabel 1: Kontakt Vinkel af substrater Før & Efter Belægning med Nanopartikler.
Tabel 1 viser de eksperimentelle data målt ved et dynamisk kontaktvinkel (DCA) instrument. I denne test blev Wilhelmy pladen metode anvendes til at bestemme virkningen af nanopartikel belægning på overfladebefugtelighed 9. Til måling af kontaktvinklen, blev prøver fremstillet ved at dyppe plader fremstillet af materialet, der skal testes i nanopartikel suspension og skylning med en strøm af destilleret vand i et par sekunder. Den fremstillede plade blev konsekutivt nedsænket i og fjernes fra destilleret vand. Kurver vedrørende grænsefladespændingen til nedsænkning dybde blev afbildet og anvendt til at beregne den vigende kontaktvinkel 10. I tabellen er det vist, at overfladespændingen af to eksempler, glas og plast (polystyren), falderbetydeligt efter belægningen.
Figur 3. Påvisning af hydrofile belægning (1). Højre halvdel af overfladen af polycarbonat plast blev coatet med nanopartikler, mens venstre halvdel var ikke-overtrukket. Når hele overfladen blev drysset med en vand sprøjte, belagt overflade ikke danne vanddråber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Belægningen virkning kan let visualiseres ved at sammenligne befugtningsvirkning før og efter belægningen. Figur 3 viser den hydrofile belægning effekt på overfladen af en plast, polycarbonat. Mens den højre halvdel af den øverste overflade blev belagt, venstre halvdel var intakt. Overbrusning på sverflade af disse overflader viser klart overtræk virkning. De rigtige halvdel danner en meget tynd film af vand, mens den venstre halvdel danner vanddråber der viser, at vandet ikke våd overflade.
Figur 4. Demonstration af hydrofile belægning (2). Førersæde vindue af en bil blev belagt med nanopartikler, mens passager vindue bag var ubestrøget. Når begge vinduer blev drysset med en vand sprøjte, belagt overflade ikke danne vanddråber. Klik her for at se en større version af dette tal.
For yderligere demonstration, blev produceret nanopartikel sprøjtes på overfladen af auto glas (figur 4). Førersædet vindue blev belagt mednanopartikler, mens vinduet bageste passager ikke blev coatet. Når vand blev sprøjtet på begge ruder, det sprøjtede vand dannet et tyndt vandlag på det belagte glas, mens vanddråber dannes på den ikke-coatede glas. Dette foto viser klart, at det coatede glas giver meget bedre udsyn end ubestrøget én.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Takket være Mr. Jason Adkins for ekspert teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer | K&R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | Any pure ECA can be used. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | Gift from the company | Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial gluten can be used. |
| HCl | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Acetone | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Methanol | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Ethanol (100%) | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Filter paper | Any | Any grade filter paper larger than 10 cm can be used. | |
| Cell culture square dish | Any | Any dish larger than 20 x 20 cm can be used. | |
| Coffee grinder | Any | Any coffee grinder can be used. | |
| Rotary evaporator | Any | Any rotary evaporator can be used. | |
| Freeze Dryer | Any | Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used. | |
| Centrifuge | Any | Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used. | |
| Magnetic stirrer | Any | Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used. | |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer | DLS from any company can be used. |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Carl Zeiss Inc. | Any SEM can be used. | |
| Dynamic Contact Angle (DCA) | Thermo Cahn Instruments | Any DCA can be used. |
References
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
