Ett protokoll för produktion av Gliadin-cyanoakrylat Nanopartiklar för hydrofil beläggning

Abstract

I denna artikel presenteras ett protokoll för framställning av proteinbaserade nanopartiklar som förändrar den hydrofoba ytan till hydrofil genom en enkel spraybeläggning. Dessa nanopartiklar framställs genom polymerisationsreaktionen av alkyl cyanoakrylat på ytan av spannmål protein (gliadin) molekyler. Alkyl cyanoakrylat är en monomer som omedelbart polymeriserar vid RT när den anbringas på ytan av material. Dess polymerisationsreaktion initieras av spårmängder av svagt basiska eller nukleofila species på ytan, inklusive fukt. En gång polymeriserad, de polymeriserade alkylcyanoakrylater visar stark affinitet med de objekt material på grund nitrilgrupper är i ryggraden i poly (alkyl-cyanoakrylat). Proteiner arbetar också som initiativtagare för denna polymerisation eftersom de innehåller amingrupper som kan initiera polymerisation av cyanoakrylat. Om aggregerade protein används som en initiator, är proteinaggregat omgiven av den hydrofobapoly (alkyl-cyanoakrylat) kedjorna efter polymerisationsreaktionen av alkyl cyanoakrylat. Genom att styra den experimentella tillstånd, är partiklar i nanometerområdet produceras. De framställda nanopartiklar lätt adsorberas på ytan av de flesta material, inklusive glas, metall, plast, trä, läder och textilier. När ytan av ett material sprayas med det producerade nanopartikelsuspension och sköljdes med vatten, den micellära strukturen hos nanopartikel ändrar sin konformation, och de hydrofila proteinerna utsätts för luft. Som ett resultat, ändrar nanopartikel-belagda ytan till hydrofila.

Protocol

1. Avfettning Commercial Gliadin

1. Mät 150 ml aceton med en graderad cylinder och häll i 250 ml Erlenmeyer-kolv.
   1. Under omrörning med en spin bar på en magnetomrörare vid RT, tillsätt 30 g kommersiell gliadin pulver. Försegla öppningen av kolven i aluminiumfolie och hålla på omrörning O / N i huven.
2. Filtrera lösningen med ett filterpapper.
   1. Tvätta filtratet med färsk aceton (ca 50 ml). Låt stå under 10 min för att tillåta acetonen att dränera.
   2. Överför filtratet tillsammans med filterpapper under för att ett stort fat, såsom en cellodlings kvadratisk maträtt. Täcka hela skålen med ett stort filterpapper för att bromsa förångning av kvarvarande aceton.
   3. Tillåta filtratet torka fullständigt i huven O / N. Lagra den avfettade gliadin i en lufttät behållare vid RT.

2. Beredning av renat Gliadin

1. Mät 150 ml water med en graderad cylinder och häll i 1000 ml Erlenmeyerkolv.
   1. Mät 350 ml absolut etanol med en enda röra cylinder och häll i samma 1000 ml Erlenmeyerkolv. Rör om kraftigt (800 - 1000 rpm) med en spinn bar tills ingen bubbla genereras från lösningsblandningen.
2. Under omrörning, tillsätt 20 g avfettat kommersiellt gliadin pulver. Lägg gliadin i små mängder i taget för att undvika bildandet av klumpar som innehåller luft i mitten. Keep on omrörning O / N.
3. Överför hela lösningen till en 1000 ml röra cylinder. Låt stå i två dagar. Under denna tid, kommer föroreningar utfällas vid botten av cylindern.
4. Överför supernatanten till en rotationsindunstare med en pipett, och avlägsnande av etanol från supernatanten så mycket som möjligt. Som procentandelen av etanol minskar, kommer gliadin visas i lösningen som ballast.
5. Frysa lösningen innehållande gliadin aggregat genom nedsänkning / rotera i metanol/ Torris blandningen och frystorka vid -70 ° C under vakuum. Före frystorkning, se till att hela lösningen fryses utan vätska.
   OBS: Den frystorkade gliadin kommer att bilda ett poröst fast material.
6. Krossa den frystorkade gliadin med mortel och mortelstöt, och slipa med en kaffekvarn för att erhålla ett fint pulver (<0,5 mm). Överföra produkten till en lufttät behållare och förvara vid RT.

3. polymerisationsreaktion av ECA med Gliadin

1. Placera en scintillationsflaska (volym är cirka 20 ml) i en vägnings balans, och tara. Lägg 3,2 g destillerat vatten och 6,8 g absolut etanol i scitillation flaskan.
2. Flytta scintillationsflaska på en magnetisk omrörare, sätta en magnetisk dragning bar (20 x 3 mm) i flaskan, och rör om kraftigt (800 - 1000 rpm) tills ingen luftbubbla genereras från vattenetanolblandning.
3. Tillsätt 40 pl av 4 N HCl i flaskan under omrörning. Tillsätt 20 mg gliadin i flaskan medan sti rring, och hålla på omrörning tills gliadin pulver är helt upplöst i vattenetanolblandning.
4. Efter att se till gliadin lösningen är klar för blotta ögat, långsamt 80 - 100 il ECA under omrörning hastighet är fortfarande 800 - 1000 rpm.
   1. Sänka omrörningshastigheten till 500 rpm, och fortsätt omröring i 1 h. När reaktionen fortskrider, observera grumligheten som indikerar att polymerisationsreaktionen pågår.
5. När reaktionen är avslutad, överför lösningen i centrifugrör, och balansera vikten av rören. Centrifugera reaktionsprodukten vid 10.000 xg under 20 min. Under denna tid, sidoprodukt fällningar och nanopartiklar kvar i supernantant. Huvudkomponenten i sidoprodukten är PACA-homopolymer.
6. Efter centrifugen, överföra den producerade nanopartikelsuspension (supernatant) med en pipett till en scintillationsflaska (eller någon lufttät behållare), och lagra den vid RT.

Titeln "> 4. karakterisera produkten

1. Förbereda 10 g av 68 vikt% vattenlösning av etanol genom att blanda 3,2 g vatten och 6,8 g absolut etanol i 20 ml scintillationsflaska och rör om tills ingen bubbla genereras från lösningsblandningen.
   1. Tillsätt 40 pl av 4 N HCl till lösningsblandningen under omrörning. Tillsätt 50 pl av nanopartikelsuspension till den förberedda etanollösningen under omrörning.
2. Mäta storleken på nanopartikel med Dynamic Light Scattering (DLS) med hjälp av provlösningen som framställts ovan och följ tillverkarens instruktioner.
   OBS: Storleken på den slutliga produkten måste vara mindre än 200 nm. Om den är större än 200 nm, kommer produkten inte att vara stabil under en längre tidsperiod. Större nanopartiklar bildas när anställda ECA inte är färska.

5. Prövning av produkten

1. Förbereda en glasplatta, såsom en handspegel. Tvätta ytan av glasplatta med tvålvatten. RInse ytan av glasplatta med strömmande vatten. Torka den rengjorda ytan eller användning utan torkning för nästa steg.
2. Spraya nanopartikelsuspension som erhölls i 3,6) på en del av glasplattan, och skölj av ytan omedelbart med rinnande vatten.
3. Spraya rent vatten på ytan av glasskivan. Observera den belagda (besprutas med nanopartiklar suspension) yta hålla vattenskikt medan den obelagda ytan är klar.

Representative Results

Nanopartiklar kan framställas på olika reaktionsbetingelser. Gliadin former aggregera i ett brett spektrum av etanolhalt ^5. Men storleken av aggregat måste vara så liten som möjligt, därför att ett ytterligare skikt (dvs., Polymeriserad ECA) kommer att läggas till detta aggregat och denna process kommer att göra det slutliga storlek större. Om den slutliga storleken av partikeln är för stor, kommer partikeln vara instabil och kommer lätt utfällas. Därför var 68% vattenhaltig etanol som valts som reaktionsmedium ^4. Storleken på den producerade nanopartiklar är i storleksordningen några hundra nanometer. Arbetsmekanism för den hydrofila beläggningen med det producerade nanopartikel är som följer.

För beläggning av material, som här nanopartikelsuspension (suspenderad i 68% etanol) sprutas på ytan av målmaterial följt av sköljning med vatten. När nan oparticles suspenderade i vattenhaltig etanol sprutas på ytan av målmaterialet, vattenhaltig etanol sprider sig lätt till en bredare område eftersom ytspänningen för etanol är mycket låg. Denna spridnings verkan av vattenhaltig etanol ger de suspenderade nanopartiklar på ytan av målmaterialet snabbt och jämnt. De levererade nanopartiklar adsorberas på materialet på grund av den starka affiniteten hos PECA kedjorna på ytan av nanopartiklar. Efterföljande tillsats av vatten förändrar konformationen av nanopartiklar. Med andra ord öppnar nanopartikeln dess struktur för att exponera de inre hydrofila proteiner till luften. Som ett resultat av denna konformationsförändring, ytan av det belagda materialet vänder hydrofil ^åtta. För att förstå denna konformationsförändring av nanopartiklar, är denna situation härmas genom att sätta de nanopartiklar i olika etanollösningar och övervakning av zeta-potentialen.

1 "src =" / filer / ftp_upload / 54147 / 54147fig1.jpg "/>
Figur 1. Zeta Potential och diameter Producerad Nanopartiklar i Various A queous etanollösningar. Detta diagram visar att varje nanopartiklar ändrar sin konformation och dess yta blir hydrofil som innehållet i suspensionsmediet etanol minskar. Detta är den arbetar mekanismen av den hydrofila beläggningen med nanopartiklar. Felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1 visar att nanopartikeln framställd i 68% vattenhaltig etanol sönderdelas till mindre partiklar som det omgivande suspensionsmediet innehåller mindre etanol, från 68% till 50%. I detta etanolhalt intervall, felstaplar av zeta-potential är stora, vilket innebär att fördelning av ytladdning är ganska bred och partiklar är inte väl stabiliserats. Eftersom innehållet i vatten ökar, ökar det absoluta värdet av zetapotentialen snabbt tills etanolinnehållet minskar till 30%. Detta innebär att ytan av varje nanopartikel är i hög grad laddade och hydrofiliciteten hos partikelytan ökar signifikant. Efter det går zetapotentialen ändras inte mycket eftersom nanopartiklar bildar aggregat. Denna aggregatbildning händer inte när nanopartikelsuspension används för hydrofil beläggning eftersom partiklarna adsorberas på ytan av materialen. I korthet innefattar förfarandet för den hydrofila beläggningen innefattar sprayning av nanopartikelsuspension, adsorption av nanopartiklar på ytan av målmaterialet, och exponering av inre proteinmolekyler till luft. I verkligheten tar hela beläggningsprocessen rum i mindre än en minut.

ladda / 54147 / 54147fig2.jpg "/>
Figur 2. SEM-bild av Adsorberat Nanopartiklar. SEM visar fördelningen av nanopartiklar på ytan av en glasplatta. På grund av de jämnt fördelade nanopartiklar, transmittansen av synligt ljus inte påverkas nämnvärt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Som ett resultat av beläggningen med nanopartiklar, är partiklarna adsorberas på ytan av målmaterialet. Figur 2 visar de nanopartiklar adsorberade på ytan av en glasplatta. Denna bild togs med en fältemissions-svepelektronmikroskop (SEM). Denna SEM-bilden visar att alla partikelstorlekar de ser mindre än 100 nm. Sedan provet sputter beläggas före SEM avbildning, dock bör det finnas någon krympning av partikelstorleken underdenna process. Denna SEM-bilden visar att nanopartiklar är väl dispergerade på ytan av en glasplatta och det finns tillräckligt många utrymmen mellan partiklar för ljuset att passera igenom. Denna rumsliga fördelningen av partiklar och små partiklar (dvs., Mindre storlek än våglängden för synligt ljus) förklara varför insyn i glasskivan inte påverkas i hög grad av beläggningen.

	före beläggning	efter beläggning
Glas	25,5 ± 1,5 °	8,9 ± 0,8 °
Polystyren	52,7 ± 1,2 °	6,8 ± 0,8 °

Tabell 1: Kontaktvinkel substrat före och efter beläggning med nanopartiklar.

Tabell 1 visar de experimentella data som mäts av en dynamisk kontaktvinkel (DCA) instrument. I detta test var den Wilhelmy plattmetod som används för att bestämma effekten av nanopartikelbeläggning på ytan vätbarhet ^9. För mätning av kontaktvinkeln framställdes prover genom att doppa plattorna gjorda av det material som skall testas i den nanopartikelsuspension och sköljning med en ström av destillerat vatten under några sekunder. Det framställda plattan konsekutivt nedsänkt i och avlägsnas från destillerat vatten. Kurvor gränsytspänningen till nedsänkningsdjup plottades och användes för att beräkna den vikande kontaktvinkeln ^10. I tabellen, visas det att ytspänningen hos två exempel, glas och en plast (polystyren), dropparsignifikant efter beläggningen.

Figur 3. Demonstration av hydrofil beläggning (1). Höger halva ytan av polykarbonatplast belades med nanopartiklar, medan vänstra halvan var obelagda. När hela ytan beströdda med en vattenspruta, belagda ytan inte bildar vattendroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Beläggningseffekt kan lätt visualiseras genom att jämföra den vätande effekten före och efter beläggningen. Figur 3 visar den hydrofila beläggningen effekt på ytan av en plast, polykarbonat. Medan den högra halvan av den övre ytan belades, den vänstra halvan var intakt. Strö på surface av dessa ytor visar klart beläggningseffekten. Den högra halvan bildar en mycket tunn film av vatten, medan den vänstra halvan bildar vattendroppar som visar att vattnet inte väta ytan.

Figur 4. Demonstration av hydrofil beläggning (2). Förarsäte fönster hos en bil belades med nanopartiklar medan bakre passagerar fönstret var obelagda. När båda fönstren beströdda med en vattenspruta, belagda ytan inte bildar vattendroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För ytterligare demonstration, var den framställda nanopartikel sprutas på ytan av auto glas (figur 4). Förarsätet fönster belades mednanopartiklar, medan den bakre passagerar fönstret inte belades. När vatten sprutades på båda av de glas fönster, det sprutade vattnet bildas ett tunt vattenskikt på det belagda glaset medan vattendroppar bildas på det obelagda glaset. Detta foto visar tydligt att det belagda glaset ger mycket bättre synlighet än obestruket en.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer	K&R International (Laguna Niguel, CA)	I-1605	Any pure ECA can be used.
Gliadin	MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS)	Gift from the company	Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial  gluten can be used.
HCl	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Acetone	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Methanol	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Ethanol (100%)	Any		Any reagent grade chemical can be used.
Filter paper	Any		Any grade filter paper larger than 10 cm can be used.
Cell culture square dish	Any		Any dish larger than 20 x 20 cm can be used.
Coffee grinder	Any		Any coffee grinder can be used.
Rotary evaporator	Any		Any rotary evaporator can be used.
Freeze Dryer	Any		Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used.
Centrifuge	Any		Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used.
Magnetic stirrer	Any		Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used.
Dynamic Light Scattering (DLS)	Brookhaven Instruments Corporation	NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer	DLS from any company can be used.
Scanning Electron Microscope (SEM)	Carl Zeiss Inc.		Any SEM can be used.
Dynamic Contact Angle (DCA)	Thermo Cahn Instruments		Any DCA can be used.