Abstract
この記事では、単純なスプレーコーティングによって親水性に疎水性表面を変化させるタンパク質ベースのナノ粒子の製造のためのプロトコルを提示します。これらのナノ粒子は、穀物タンパク質（グリアジン）分子の表面上のアルキルシアノアクリレートの重合反応によって製造されます。アルキルシアノアクリレートは、それが材料の表面に適用した場合、即座に、室温で重合する単量体です。その重合反応は、水分を含む表面上に、弱塩基性または求核性種の微量によって開始されます。重合後ニトリル基は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）のバックボーンにあるため、重合アルキルシアノアクリレートは、対象物質と強い親和性を示します。彼らはシアノアクリレートの重合を開始することができるアミン基を含有するためのタンパク質はまた、この重合のための開始剤として働きます。凝集タンパク質を開始剤として使用される場合、タンパク質凝集体は、疎水性で囲まれていますアルキルシアノアクリレートの重合反応後のポリ（アルキルシアノアクリレート）鎖。実験条件を制御することにより、ナノメートル範囲の粒子が生成されます。製造されたナノ粒子は、容易にガラス、金属、プラスチック、木材、皮革、及び織物を含むほとんどの物質の表面に吸着します。材料の表面を製造ナノ粒子懸濁液を噴霧し、水でリンスされた場合、ナノ粒子のミセル構造は、コンフォメーションが変化し、親水性タンパク質は、空気にさらされています。その結果、ナノ粒子コーティングされた表面は、親水性に変化します。
Protocol
1.脱脂商業グリアジン
- メスシリンダーをアセトン150ml中に測定250mlの三角フラスコに注ぎます。
- 室温でマグネチックスターラー上でスピン棒で攪拌しながら、商業グリアジン粉末30gを追加します。アルミ箔でフラスコの開口部を密閉し、フード内でO / N撹拌し続けます。
- 濾紙で溶液をろ液。
- 新鮮なアセトン（約50ml）でろ液を洗います。アセトンを排出させるために10分間放置してみましょう。
- このような細胞培養正方形の皿のような大きな皿に下をろ紙とともにろ液を転送します。残留アセトンの蒸発を遅くするために、大きなろ紙で全体の皿をカバーしています。
- ろ液は、ボンネットO / Nで完全に乾燥することができます。室温で気密容器内の脱脂グリアジンを保管してください。
精製されたグリアジンの調製
- WAの150ミリリットルを測定しますメスシリンダーとターと千ミリリットルの三角フラスコに注ぎます。
- 混乱のシリンダーを無水エタノール350ミリリットルを測定し、同じ千ミリリットルの三角フラスコに注ぎます。全く気泡が溶液混合物から生成されなくなるまでスピン棒を - （1,000回転800）を激しく撹拌します。
- 撹拌しながら、脱脂商用グリアジン粉末20グラムを追加します。途中で空気を含ま塊の形成を避けるために、一度に少量でグリアジンを追加します。 O / N撹拌し続けます。
- 千ミリリットルのメスシリンダーにソリューション全体を転送します。 2日間放置してみましょう。この時間の間に、不純物がシリンダの底部に析出されます。
- ピペットでロータリーエバポレーターに上清を移して、できるだけ多くの上清からエタノールを除去。エタノールの割合が減少すると、グリアジンは、集合体として溶液中で表示されます。
- メタノールに回転/浸漬することによりグリアジン凝集体を含む溶液を凍結/ドライアイス混合物、凍結乾燥し、真空下で-70℃で。凍結乾燥の前に、溶液全体が任意の液体ずに凍結されていることを確認します。
注：凍結乾燥したグリアジンは、多孔性固体を形成します。 - 乳鉢と乳棒で凍結乾燥したグリアジンを粉砕し、微粉末（<0.5 mm）を得るためにコーヒーグラインダーで挽きます。室温で気密容器と店に製品を転送します。
グリアジンとECAの3重合反応
- 計量バランス、風袋中のシンチレーションバイアルを（体積は約20ミリリットルである）を配置します。 scitillationバイアルに3.2グラムの蒸留水および6.8グラムの無水エタノールを追加します。
- バイアルに磁気スピン棒（20×3 mm）を入れ、マグネチックスターラー上にシンチレーションバイアルを移動し、激しく撹拌 - 空気の泡が水性エタノール混合物から生成されなくなるまで（800千rpm）を。
- 攪拌しながら、バイアルに4 N HClを40μlを添加します。 STIながらバイアルにグリアジン20mgを追加します。 RRING、およびグリアジン粉末を完全に水性エタノールの混合物に溶解するまで攪拌し続けます。
- 1,000回転 - 攪拌速度はまだ800である間ECA100μlの - を確認した後グリアジン液が肉眼には明らかである、ゆっくりと80を追加します。
- 500rpmに攪拌速度を下げ、そして1時間撹拌し続けます。反応が進行するにつれて、重合反応が進行中であることを示している濁度を観察します。
- 反応が終了すると、遠心チューブに溶液を移し、チューブの重量のバランスをとります。 20分間10,000×gでの反応生成物を遠心。この間、副生成物の沈殿物及びナノ粒子はsupernantantに残ります。副生成物の主成分は、PACAホモポリマーです。
- 遠心分離後、シンチレーションバイアル（または任意の気密容器）にピペットを用いて製造したナノ粒子懸濁液（上清）を転送し、室温で保管してください。
- 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに3.2グラムの水および6.8グラムの無水エタノールを混合することにより、68重量％エタノール水溶液の10グラムを準備し、全く気泡が溶液混合物から生成されなくなるまで撹拌します。
- 攪拌しながら混合液に4 N HClを40μlを添加します。攪拌しながら調製したエタノール溶液にナノ粒子懸濁液の50μlのを追加します。
- 上記で調製した試料溶液を用いて、動的光散乱（DLS）を持つナノ粒子のサイズを測定し、製造元の指示に従ってください。
注：最終製品のサイズを200nmよりも小さくなければなりません。それが200nmよりも大きい場合、生成物は、長期間安定ではないだろう。就業ECAが新鮮でない場合は、大きなナノ粒子が生成されます。
製品の5.審査
- このような手鏡としてガラス板を準備します。石鹸水でガラス板の表面を洗浄します。 R流水でガラス板の表面inse。清浄化された表面を乾燥させたり、次の工程で乾燥させずに使用します。
- ガラス板の一部に）3.6で得られたナノ粒子懸濁液をスプレーし、すぐに流水で表面を洗い流してください。
- ガラス板の表面に、純水をスプレー。コーティングされていない面がクリアされている間（ナノ粒子懸濁液を噴霧）塗面ホールド水層を観察します。
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Representative Results
ナノ粒子は、種々の反応条件下で調製することができます。グリアジン形態は、エタノール含有量5の広い範囲に集約します。しかし、凝集体の大きさは、付加的な層（ すなわち 、重合ECA）は、この集合に追加されるため、できるだけ小さくする必要があり、このプロセスは、最終的なサイズが大きくなります。粒子の最終サイズが大きすぎると、粒子が不安定になり、容易に沈殿されます。したがって、68％エタノール水溶液を反応媒体4として選択しました。生成ナノ粒子のサイズは、数百ナノメートルのオーダーです。以下のように製造したナノ粒子を有する親水性コーティングのための作業機構です。
材料のコーティングのために、（68％エタノール中に懸濁）このナノ粒子懸濁液を水で洗い流し、続いてターゲット材料の表面上に噴霧されます。ときナンは、水性エタノール中に懸濁oparticlesがターゲット材の表面に噴霧されるエタノールの表面張力が非常に低いため、水性エタノールを容易に、より広い領域に広がります。水性エタノールのこの拡散作用は、迅速かつ均一にターゲット材の表面に中断したナノ粒子を提供します。配信ナノ粒子があるため、ナノ粒子の表面にPECAチェーンの強い親和性物質に吸着します。水のその後の添加は、ナノ粒子のコンフォメーションを変化させます。言い換えれば、ナノ粒子は、空気中に内部親水性タンパク質を露出させるために、その構造を開きます。このコンフォメーション変化の結果として、コーティングされた材料の表面は、8、親水性になります。ナノ粒子のこの立体構造変化を理解するために、このような状況は、種々のエタノール溶液中にナノ粒子を入れてゼータ電位を監視することによって模倣されます。
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図1. ゼータは、可能性と様々なA queousエタノール溶液 中で製造されたナノ粒子の直径 。このグラフは、各ナノ粒子は、その立体構造を変化させ、懸濁媒体のエタノール含有量が減少するように、その表面が親水性になることを示しています。これは、ナノ粒子を有する親水性コーティングの作業機構です。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図1は、周囲の懸濁媒体は、68％〜50％、より少ないエタノールを含有するように68％エタノール水溶液中で調製したナノ粒子をより小さな粒子に崩壊されることを示しています。このエタノール含有量範囲で、ゼータ電位のエラーバーは、つまり、大きいです表面電荷の分布が非常に広く、粒子が十分に安定化されていません。エタノール含有量が30％に低下するまで水の含有量が増加するように、ゼータ電位の絶対値が急激に増加します。これは、各ナノ粒子の表面は高度に荷電され、粒子表面の親水性が著しく増加することを意味します。ナノ粒子が凝集体を形成するので、その後、ゼータ電位はあまり変わりません。ナノ粒子懸濁液は、親水性コーティングのために使用される場合、粒子は、材料の表面に吸着されるので、この凝集体形成は起こりません。要するに、親水性コーティングのための方法は、ナノ粒子懸濁液、ターゲット材の表面上のナノ粒子の吸着、空気の内部タンパク質分子の曝露を噴霧することを含みます。実際には、全体のコーティングプロセスが分未満で起こります。
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吸着ナノ粒子。SEMの 図2 のSEM画像は、ガラス板の表面上のナノ粒子の分布を示しています。そのため均等に分散ナノ粒子から、可視光の透過率が大幅に影響されない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ナノ粒子コーティングの結果として、粒子は、ターゲット材料の表面に吸着されている。 図2は、ガラス板の表面に吸着したナノ粒子を示します。この画像は、電界放出走査電子顕微鏡（SEM）で撮影しました。このSEM画像は、すべての粒子サイズが100nmより小さく見えることを示しています。試料は、スパッタ前のSEM画像に塗布しているので、しかし、中に粒子サイズのいくつかの縮みがあるはずこのプロセス。このSEM画像は、ナノ粒子が十分にガラス板の表面上に分散し、光が通過するための粒子間に十分なスペースが存在していることを示しています。ガラス板の透明性がはるかにコーティングすることによって影響されない理由はこの粒子の空間分布と粒子のサイズが小さい（ すなわち 、可視光の波長よりも小さいサイズ）を説明します。
| コーティングの前に | コーティングした後、 | |
| グラス | 25.5±1.5° | 8.9±0.8° |
| ポリスチレン | 52.7±1.2° | 6.8±0.8° |
表1：ビフォー＆ナノ粒子でコーティングした後、基板の接触角。
表1は、動的接触角（DCA）機器によって測定された実験データを示します。この試験では、ウィルヘルミープレート法は、表面湿潤性9にナノ粒子コーティングの効果を決定するために使用しました。接触角の測定のために、サンプルをナノ粒子懸濁液に試験される材料からなる板を浸漬し、数秒間蒸留水の流れですすぐことにより調製しました。調製されたプレートは、連続的に浸漬し、蒸留水から取り出しました。浸漬深さに界面張力に関連する曲線をプロットし、後退接触角10を計算するために使用しました。表では、二つの例、ガラス、プラスチック（ポリスチレン）の表面張力は、低下することが示されています大幅にコーティングした後。
左半分は未被覆であった親水性コーティング（1）ポリカーボネートプラスチックの表面の右半分の 図3 実証は 、ナノ粒子でコーティングしました。全面が水噴霧器を振りかけたときに、コーティングされた表面が水滴を形成しなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コーティング効果は、容易にコーティング前後の濡れ効果を比較することによって可視化することができる。 図3は、プラスチック、ポリカーボネートの表面に親水性コーティングの効果を示します。上面の右半分がコーティングされたが、左半分は無傷でした。 sの上に散水これらの表面のurfaceは明らかに、コーティングの効果を実証します。右半分の形の水の非常に薄い膜、左半分は、表面を湿潤しない、水を示した水滴を形成しています。
後部乗客ウィンドウがコーティングされていないあった親水性コーティング（2）自動車の運転席ウィンドウの図4実証は 、ナノ粒子でコーティングしました。両方のウィンドウを水噴霧器で散布した場合には、コーティングされた表面が水滴を形成しなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
さらなる実証のために、生成ナノ粒子は自動車ガラスの表面（ 図4）上に噴霧しました。運転席の窓を用いて塗布しましたナノ粒子は、後部の乗客ウィンドウを塗布されませんでした。水がガラス窓の両方に噴霧したときに水滴がコーティングされていないガラス上に形成されている間、噴霧水がコーティングされたガラス上に薄い水の層を形成しました。この写真は明らかにコーティングされたガラスがコーティングされていないものよりもはるかに優れた視認性を提供していますことを示しています。
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Acknowledgments
専門家の技術支援のための氏ジェイソン・アドキンスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer | K&R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | Any pure ECA can be used. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | Gift from the company | Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial gluten can be used. |
| HCl | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Acetone | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Methanol | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Ethanol (100%) | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Filter paper | Any | Any grade filter paper larger than 10 cm can be used. | |
| Cell culture square dish | Any | Any dish larger than 20 x 20 cm can be used. | |
| Coffee grinder | Any | Any coffee grinder can be used. | |
| Rotary evaporator | Any | Any rotary evaporator can be used. | |
| Freeze Dryer | Any | Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used. | |
| Centrifuge | Any | Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used. | |
| Magnetic stirrer | Any | Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used. | |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer | DLS from any company can be used. |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Carl Zeiss Inc. | Any SEM can be used. | |
| Dynamic Contact Angle (DCA) | Thermo Cahn Instruments | Any DCA can be used. |
References
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
