Abstract
Cet article présente un protocole pour la production de nanoparticules à base de protéines qui modifie la surface hydrophobe à hydrophile par un revêtement par pulvérisation simple. Ces nanoparticules sont produites par la réaction de polymérisation de cyanoacrylate d'alkyle sur la surface des protéines de céréales (gliadine) molécules. Cyanoacrylate d'alkyle est un monomère qui polymérise instantanément à température ambiante quand elle est appliquée sur la surface des matériaux. La réaction de polymérisation est initiée par les traces des espèces basiques ou faiblement nucléophiles sur la surface, y compris l'humidité. Une fois polymérisé, les cyanoacrylates d'alkyle polymérisés montrent une forte affinité avec les matériaux des objets parce que les groupes nitrile sont dans le squelette de poly (cyanoacrylate d'alkyle). Les protéines travaillent aussi comme initiateur pour cette polymérisation, car ils contiennent des groupes aminés qui peuvent déclencher la polymérisation de cyanoacrylate. Si la protéine agrégée est utilisé comme initiateur, un agrégat de protéine est entourée par la hydrophobele poly (cyanoacrylate d'alkyle), des chaînes après la réaction de polymérisation de cyanoacrylate d'alkyle. En contrôlant la condition expérimentale, des particules de l'ordre du nanomètre sont produites. Les nanoparticules produites adsorbent facilement à la surface de la plupart des matériaux y compris le verre, les métaux, les plastiques, le bois, le cuir et les tissus. Lorsque la surface d'un matériau est pulvérisé avec la suspension de nanoparticules produites et on le rince à l'eau, la structure de nanoparticule micellaire change sa conformation et les protéines hydrophiles sont exposées à l'air. En conséquence, la surface des nanoparticules enrobées devient hydrophile.
Protocol
1. Dégraissage Commercial gliadine
- Mesurer 150 ml d'acétone avec un cylindre gradué et verser dans Erlenmeyer de 250 ml.
- Tout en agitant avec une barre de rotation sur un agitateur magnétique à température ambiante, ajouter 30 g de poudre de gliadine commerciale. Sceller l'ouverture du flacon dans une feuille d'aluminium, et continuer à agitation O / N dans la hotte.
- Filtrer la solution avec un papier filtre.
- Laver le filtrat avec de l'acétone fraîche (environ 50 ml). Laisser reposer pendant 10 min pour permettre à l'acétone pour égoutter.
- Transférer le filtrat ainsi que le papier filtre en dessous pour un grand plat, comme un plat carré de culture cellulaire. Couvrir tout le plat avec un grand papier filtre pour ralentir l'évaporation de l'acétone résiduelle.
- Laisser le filtrat sécher complètement dans la hotte O / N. Rangez la gliadine dégraissée dans un récipient étanche à l'air à température ambiante.
2. Préparation de Purifié gliadine
- Mesurer 150 ml de water avec un cylindre gradué et verser dans 1000 ml flacon Erlenmeyer.
- Mesurer 350 ml d'éthanol absolu avec un cylindre de désordre et verser dans le même 1000 ml flacon Erlenmeyer. Agiter vigoureusement (800 - 1000 rpm) avec une barre de rotation jusqu'à ce qu'aucune bulle est générée à partir du mélange de solution.
- Tout en agitant, ajouter 20 g de poudre de gliadine dégraissés commerciales. Ajouter gliadine en petites quantités à la fois pour éviter la formation de grumeaux qui contient de l'air dans le milieu. Continuez à agitation O / N.
- Transférer toute la solution à un cylindre de mess 1000 ml. Laisser reposer pendant deux jours. Pendant ce temps, les impuretés sont précipitées au fond du cylindre.
- Transférer le surnageant dans un évaporateur rotatif avec une pipette, et éliminer l'éthanol à partir du surnageant, autant que possible. Comme le pourcentage d'éthanol est réduite, la gliadine apparaîtra dans la solution sous forme agrégée.
- Congeler la solution contenant des agrégats de la gliadine par immersion / rotation dans le méthanol/ Mélange de glace sèche et lyophilisation à -70 ° C sous vide. Avant lyophilisation, assurez-vous que l'ensemble de la solution est congelée sans liquide.
REMARQUE: La gliadine lyophilisé formera un solide poreux. - Crush the gliadine lyophilisé avec du mortier et un pilon, et broyer avec un moulin à café pour obtenir une amende puissance (<0,5 mm). Transférer le produit dans un récipient et un magasin étanche à l'air à température ambiante.
3. Réaction de polymérisation de la CEA avec gliadine
- Placez un flacon de scintillation (volume est d'environ 20 ml) dans un poids d'équilibre et la tare. Ajouter 3,2 g d'eau distillée et 6,8 g d'éthanol absolu dans le flacon de scitillation.
- Déplacez le flacon de scintillation sur un agitateur magnétique, mettre une barre de spin (20 x 3 mm) dans le flacon, et mélanger vigoureusement (800 - 1000 rpm) jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air est généré à partir du mélange d'éthanol aqueux.
- Ajouter 40 ul de HCl 4 N dans le flacon tout en remuant. Ajouter 20 mg de gliadine dans le flacon tandis sti fait qui l'appelle, et continuer à remuer jusqu'à ce que la poudre de gliadine est entièrement dissous dans le mélange d'éthanol aqueux.
- Après s'être assuré que la solution de gliadine est clair à l'oeil nu, ajouter lentement 80 - 100 pi de la CEA alors que la vitesse d'agitation est encore 800 - 1000 rpm.
- Abaisser la vitesse d'agitation à 500 tours par minute, et continuez de remuer pendant 1 h. Comme le produit de réaction, d'observer la turbidité qui indique que la réaction de polymérisation est en cours.
- Lorsque la réaction est terminée, la solution dans des tubes de centrifugeuse et équilibrer le poids des tubes. Centrifuger le produit de réaction à 10 000 xg pendant 20 min. Pendant ce temps, des précipités et des nanoparticules de produits secondaires restent dans le surnageant. Le composant principal du produit secondaire est PACA homopolymère.
- Après la centrifugation, le transfert de la suspension de nanoparticules produites (surnageant) avec une pipette dans une fiole à scintillation (ou tout autre récipient étanche à l'air) et la stocker à température ambiante.
- Préparer 10 g de 68% en poids d'éthanol aqueux en mélangeant 3,2 g d'eau et 6,8 g d'éthanol absolu dans 20 ml flacon à scintillation et remuer jusqu'à ce qu'aucune bulle est générée à partir du mélange de solution.
- Ajouter 40 ul de HCl 4 N dans le mélange de la solution tout en agitant. Ajouter 50 pl de suspension nanoparticulaire à la solution de l'éthanol préparé tout en agitant.
- Mesurer la taille de nanoparticules avec Dynamic Light Scattering (DLS) en utilisant la solution de l'échantillon préparé ci-dessus et suivez les instructions du fabricant.
REMARQUE: La taille du produit final doit être inférieure à 200 nm. Si elle est supérieure à 200 nm, le produit ne sera pas stable pendant une longue période de temps. Grandes nanoparticules sont produites lorsque la CEA employée est pas frais.
5. Examen du produit
- Préparer une plaque de verre, comme un miroir à main. Laver la surface de la plaque de verre avec de l'eau savonneuse. Rinse la surface de la plaque de verre avec de l'eau qui coule. Sécher la surface nettoyée ou utilisation sans séchage pour l'étape suivante.
- Pulvériser la suspension de nanoparticules obtenue en 3.6) sur une partie de la plaque de verre, et rincer la surface avec l'eau qui coule immédiatement.
- Pulvériser de l'eau pure sur la surface de la plaque de verre. Observer le (pulvérisés avec nanoparticule suspension) couche d'eau de maintien de la surface revêtue tandis que la surface non revêtue est clair.
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Representative Results
Les nanoparticules peuvent être préparées sous diverses conditions de réaction. Formes gliadine agrègent dans une large gamme de teneur en éthanol 5. Cependant, la taille des agrégats doit être aussi faible que possible , car une couche supplémentaire (ie., CEA polymérisée) est ajoutée à cet ensemble et ce processus fera la plus grande dimension finale. Si la taille finale des particules est trop importante, la particule sera instable et facilement être précipité. Par conséquent, 68% d' éthanol aqueux a été choisi en tant que milieu de réaction 4. La taille de la nanoparticule produite est de l'ordre de quelques centaines de nanomètres. Le mécanisme de travail pour le revêtement hydrophile avec la nanoparticule produit est la suivante.
Pour le revêtement de matériaux, cette suspension de nanoparticules (en suspension dans 68% d'éthanol) est pulvérisée sur la surface du matériau cible suivie d'un rinçage à l'eau. Lorsque le nan oparticles en suspension dans de l'éthanol aqueux est pulvérisé sur la surface du matériau cible, l'éthanol aqueux se propage facilement à une zone plus large, car la tension superficielle de l'éthanol est très faible. Cette action d'étalement de l'éthanol aqueux, fournit des nanoparticules en suspension sur la surface du matériau cible rapidement et uniformément. Les nanoparticules administrées sont adsorbés sur le matériau en raison de la forte affinité des chaînes PECA sur la surface des nanoparticules. L'addition ultérieure d'eau modifie la conformation de nanoparticules. En d'autres termes, la nanoparticule ouvre sa structure pour exposer les protéines hydrophiles internes à l'air. En conséquence de ce changement de conformation, la surface du matériau revêtu devient hydrophile 8. Pour comprendre ce changement conformationnel de nanoparticules, cette situation est mimée en mettant les nanoparticules dans différentes solutions d'éthanol et de surveillance du potentiel zêta.
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Figure 1. Zeta potentiel et le diamètre des nanoparticules produites dans Divers A de l' éthanol Solutions. Ce graphique montre que chaque nanoparticule modifie sa conformation et sa surface devient hydrophile comme la teneur en éthanol du milieu de suspension diminue. Ceci est le mécanisme de travail du revêtement hydrophile avec des nanoparticules. Les barres d'erreur représentent l' erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 1 montre que la nanoparticule préparée dans 68% d' éthanol aqueux est désintégré en particules plus petites que le milieu de suspension environnante contient moins d' éthanol, de 68% à 50%. Dans cette gamme de teneur en éthanol, les barres d'erreur de potentiel zéta sont grandes, ce qui signifie que le la distribution de la charge de surface est assez large et les particules ne sont pas bien stabilisé. Lorsque la teneur en eau augmente, la valeur absolue du potentiel zêta augmente rapidement jusqu'à ce que la teneur en éthanol tombe à 30%. Cela signifie que la surface de chaque nanoparticule est fortement chargé et le caractère hydrophile de la surface des particules est considérablement augmentée. Après cela, le potentiel zeta ne change pas beaucoup parce que les nanoparticules forment des agrégats. Cette formation d'agrégat ne se produit pas lorsque la suspension des nanoparticules est utilisé pour le revêtement hydrophile, car les particules sont adsorbées sur la surface des matériaux. En bref, le procédé de revêtement hydrophile consiste à pulvériser la suspension de nanoparticules, l'adsorption des nanoparticules sur la surface du matériau cible, et l'exposition des molécules de protéines internes à l'air. En réalité, le processus de revêtement entier a lieu dans moins d'une minute.
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Figure 2. Image SEM adsorbées Nanoparticules. MEB montre la répartition des nanoparticules sur la surface d'une plaque de verre. En raison des nanoparticules uniformément réparties, la transmission de la lumière visible ne soit pas affectée de façon significative. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
En conséquence du revêtement avec des nanoparticules, des particules sont adsorbées sur la surface du matériau cible. La figure 2 montre les nanoparticules adsorbées sur la surface d'une plaque de verre. Cette image a été prise avec une émission-microscope électronique à balayage de terrain (SEM). Cette image MEB montre que toutes les tailles de particules ressemblent inférieure à 100 nm. Etant donné que l'échantillon a été revêtu par pulvérisation cathodique préalable à l'imagerie SEM, cependant, il devrait y avoir un certain rétrécissement de la taille des particules pendant lece processus. Cette image SEM montre que les nanoparticules sont bien dispersés sur la surface d'une plaque de verre et il y a suffisamment d'espace entre les particules de la lumière de passer à travers. Cette distribution spatiale des particules et de la petite taille des particules ( par exemple., De taille plus petite que la longueur d' onde de la lumière visible) expliquent pourquoi la transparence de la plaque de verre est peu affectée par le revêtement.
| avant le revêtement | après le revêtement | |
| Verre | 25,5 ± 1,5 ° | 8,9 ± 0,8 ° |
| polystyrène | 52,7 ± 1,2 ° | 6,8 ± 0,8 ° |
Tableau 1: Angle de contact des substrats avant et après revêtement avec Nanoparticules.
tableau 1 présente les données expérimentales mesurées par un angle de contact dynamique (DCA) de l' instrument. Dans cet essai, la méthode de Wilhelmy , la plaque a été utilisée pour déterminer l'effet du revêtement de nanoparticules sur la mouillabilité de la surface 9. Pour la mesure de l'angle de contact, des échantillons ont été préparés par trempage des plaques en matériau à tester dans la suspension nanoparticulaire et le rinçage avec un courant d'eau distillée pendant quelques secondes. La plaque a été préparé consécutivement immergé dans et retiré de l'eau distillée. Les courbes relatives la tension interfaciale à la profondeur d'immersion ont été tracées et utilisées pour calculer l'angle de contact récessif 10. Dans le tableau, on indique que la tension superficielle de deux exemples, le verre et une matière plastique (polystyrène), les gouttesde manière significative après l'enrobage.
Figure 3. Démonstration de revêtement hydrophile (1). De la moitié droite de la surface du polycarbonate est enduite de nanoparticules, tandis que la moitié gauche était non couché. Lorsque toute la surface a été aspergé avec un pulvérisateur d'eau, surface revêtue ne former des gouttelettes d'eau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'effet de revêtement peut facilement être visualisé en comparant l'effet de mouillage avant et après le revêtement. La figure 3 montre l'effet de revêtement hydrophile sur la surface d'une matière plastique en polycarbonate. Alors que la moitié droite de la surface supérieure a été appliquée, la moitié gauche était intacte. Saupoudrer sur les surface de ces surfaces démontre clairement l'effet de revêtement. Les formes de la moitié droite d'un très mince film d'eau, tandis que la moitié gauche forme des gouttelettes d'eau montrant que l'eau ne mouille pas la surface.
Figure 4. Démonstration de revêtement hydrophile (2). La fenêtre d'une automobile du siège du conducteur a été revêtue de nanoparticules alors fenêtre passager arrière était non. Lorsque les deux fenêtres ont été aspergés avec un pulvérisateur d'eau, surface revêtue ne former des gouttelettes d'eau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour la démonstration supplémentaire, la nanoparticule produit a été pulvérisée sur la surface du verre automobile (figure 4). La fenêtre du siège du conducteur a été revêtuenanoparticules, alors que la fenêtre du passager arrière n'a pas été recouverts. Lorsque de l'eau a été pulvérisée sur les deux vitres en verre, l'eau pulvérisée formée une mince couche d'eau sur le verre revêtu tandis que les gouttelettes d'eau sont formées sur le verre non revêtu. Cette photo montre clairement que le verre revêtu offre bien meilleure visibilité que non couchés l'un.
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Acknowledgments
Merci à M. Jason Adkins pour l'assistance technique d'experts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl cyanoacrylate (ECA) monomer | K&R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | Any pure ECA can be used. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | Gift from the company | Gliadin can be purchased from Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Instead of gliadin, any commercial gluten can be used. |
| HCl | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Acetone | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Methanol | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Ethanol (100%) | Any | Any reagent grade chemical can be used. | |
| Filter paper | Any | Any grade filter paper larger than 10 cm can be used. | |
| Cell culture square dish | Any | Any dish larger than 20 x 20 cm can be used. | |
| Coffee grinder | Any | Any coffee grinder can be used. | |
| Rotary evaporator | Any | Any rotary evaporator can be used. | |
| Freeze Dryer | Any | Any freeze dryer that can reach -70 °C can be used. | |
| Centrifuge | Any | Any centrifuge that can apply 1,000 x g can be used. | |
| Magnetic stirrer | Any | Any magnetic stirrer that can turn spin bar to 1,000 rpm can be used. | |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer | DLS from any company can be used. |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Carl Zeiss Inc. | Any SEM can be used. | |
| Dynamic Contact Angle (DCA) | Thermo Cahn Instruments | Any DCA can be used. |
References
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
