Abstract
mantarlar, bakteriler ve virüs içeren taksonomik krallıklar arasında polimikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi önceden mikrobiyomları viral üyeleri bu virüs bulaşmış konak hücreleri ile sonraki mikrop etkileşimleri nasıl etkilediği ile ilgili incelenmiş değildir. bakteri ve mantarlar ile virüs birlikte yaşama ağız boşluğu ve genital mukoza yüzeyleri üzerinde esas olarak mevcuttur. Mukozal hücrelerin, kalıcı kronik veya kalıcı geç viral enfeksiyonları, özellikle de ifade edilen reseptör, önemli sayıda virüs değiştirilerek mikrobiyomu üyeleri üzerindeki etkisini ve türü olabilir. Ev sahibi hücre membranı mimarisinde Modifikasyon biyofilm, yani yapışma ilk adımı başlatmak için normal flora ve fırsatçı patojenlerin daha sonraki üye değiştirilmiş yeteneğine neden olur. Bu çalışma, biofil başlatılmasından HSV etkisinin ölçülmesi ve görsel inceleme için bir yöntem tarif ederS. m formasyonu (yapışma) aureus ve C. albicans.
Introduction
İnsan mikrobiyomları vücudunda coğrafi bölgeleri paylaşan birden taksonomik krallıklardan farklı organizmaların içerir. hücre yüzeylerine yapışma mikrobiyomları kolonizasyon sürecinin bir parçasıdır biyofilm, önemli bir ilk adımdır. mikrobiyomları dahil kronik ve inatçı enfeksiyonlara neden virüsler olabilir. Bu virüslerin kronik hücre enfeksiyon, farazi reseptörü durumunu bir değişikliğe neden olabilir. Ek olarak 1,2, hücre içi patojenler ile hücre girişi da sırayla bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere, diğer mikrobiyomları üyelerinin eki değiştirebilir ana membran akışkanlığını / hidrofobiklik etkileyebilecek . İnsan konağın aynı coğrafi bölgelerde lokalize co bu çoklu patojen arasında oluşabilir etkileşimleri anlamak için, biz mukozal yüzeyinde mevcut taksonomik krallıkların spektrumunu temsil patojenlerin etkileşimini incelemek gerekir.
t "> Herpesviridae mikrobiyomu daimi üyeleri olarak insanlarda% 100 mevcut mikropların ailesidir 3,4. Buna ek olarak aynı zamanda sürekli semptomlarının varlığı ve yokluğunda hem döken edilebilir. Spesifik olarak, herpes simplex virüs-1 ve herpes simplex virüs-2 (HSV-1 ve HSV-2 sırasıyla) oronasopharynx ve genital bölgesindeki mikrobiyomu daimi üyeleridir. bağışıklık yetkin kişiler, her iki HSV-1 ve HSV-2 neden gingivostomatit yanısıra genital herpes 5-8. bu bölgelerde, HSV kronik kalıcı nectins, heparan sülfat, lipid sallar ve herpes virüs giriş arabulucu yüzey ifadesinde değişiklikler hücreler sonuçlara HSV 9. entry dökülme viral asemptomatik / tümör nekrozu ile karakterize bir gizli enfeksiyona neden faktör reseptörü (HVEM / TNFR) 10-25. bazı bakteriler ve mantarlar, örneğin, S. aureus ve C. albicans Bu potansiyel olarak ortak temsil alıcıları, fırsatçı patojenler ise,Ayrıca oronasopharynx 26,27 mukozal mikrobiyomları üyeleri olarak bulunabilir. Oronasopharynx S. içinde aureus ve C. albicans kolonizasyon iki ayrı siteler işgal. Doğal diş ana olarak, oral mukoza, HSV-1 ve C tarafından paylaşılır albicans, anterior nazal nares S. tarafından işgal edilirken aureus 28. Ancak, rağmen, in vitro bulgular S. aureus ağız epitel hücrelerine yapışır, 29,30 S. Normal doku 29,30 mevcut olduğunda aureus seyrek Oral örneklerden izole edilir. Küçük klinik bulguların ötesinde genital yol ko-kolonizasyon niş ile ilgili bilinen S. aureus C iken, genital iltihap, akıntı ve disparoni ile karakterize, aerobik vajinit ile ilişkilidir albicans ağız boşluğu 31-35 gözlenene benzer bir mukozal lezyonlar. Böylece, ağız ve genital microbi bu üyelerin her ne kadaronların etkileşimine ilişkin bilinen küçük ome çapraz taksonomik krallıklar konak hücre yüzeyinde 5 bağlılık yoluyla biyofilm oluşumunu başlatmak için bu etkileri kendi yeteneği gibi. Bu protokol etkin bir ko-kolonizasyon / enfeksiyon fonksiyonel sonuçlarını belirlemek amacıyla uygulanmıştır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV Suşlar ve Taşıma
Not: Rekombinan olmayan yayılan HSV-1 (KOS) gL86 ve HSV-2 (KOS) 333gJ - V. Twiari 36,37 tarafından sağlanan kullanılan beta-galaktosidaz raportör etkinliği ile.
- 1 -80 ° C de, tek bir parça ve deposundan virüs kullanabilir: Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı,% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile (DMEM) 1 oranında ve kullanılana kadar yağsız süt. Viral çok depolama önce, O-nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galactopyranoside (X-Gal) deneyi virüs konsantrasyonunu belirlemek.
- Daha önce (Şekil 1) 14 tarif edildiği gibi, raportör virüs giriş deneyi kullanılarak her bir deney tahlili çalıştırmak için X-Gal boyaması ile virüs canlılığı ve enfeksiyon (MOI) bir çokluğunu belirlemek.
- İstenen İçişleri Bakanlığı virüs (Opt-MEM) seyreltin. tek tabakalar (paraformaldehit; 0.5 ml / oyuk) saptamak lekelenme. Ayrı bir microti virüs canlılığı kontrolleri yerleştirinpolimikrobiyal tahlil plakaları paralel olarak ter plakası.
2. HeLa 299 Hücre İşleme
- 4.5 g / L glikoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), gentamisin (50 ug / ml) ve L-glutamin ile DMEM içinde 37 ° C,% 5 CO2 de büyür. Tripsin çözeltisi ile% 80 izdiham Geçiş hücreleri (% 0.05 tripsin, etilendiamintetraasetik asit, 0.53 M EDTA, 5 ml / şişe).
3. C. albicans Taşıma
Not: C Klinik laboratuar bir kaynaktan elde edilen albicans orta 2x yağsız süt REMMEL -80 ° C'de saklanır.
- Kültür Sabouraud Dekstroz Orta (37 ° C) üzerine stok donmuş. 24 saat altkültür C sonra Fungisel ortamı üzerine albicans (37 ° C, 48 saat) kullanım için.
- Mikrop tüpünü (GT) formları oluşturun (3 ml FBS, temsili koloniler almak 3 saat, 37 ° C, Abs 600, 0.3). inkübasyondan sonra, GT yıkama (HBSS; 2x, 4000 xg). (37 ısıtıldı HBSS ile yıkandı, GT ekleme# 176; C; 0.32 Abs 600). GT formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır.
- Temsili Fungisel koloniler seçerek maya formu (YF) stok süspansiyonları olun (HBSS, 3 ml 0.32 Abs 600). YF formlarının sayısını / mikroskopik hemasitometre kullanarak ml. YF formları hemositometre sayımı ile tespit edildiği üzere gözlenen hücre% 99 olmalıdır.
- Mantar stok çalışma yapmak (25 ml HBSS GT veya YF stokunun 250 ul; 37 ° C; 10 5 CFU / ml)
4. S. aureus Taşıma
- Mağaza S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel süt 2x yağsız). koyun kanlı agara Kültürü (% 5; 37 ° C; 24 saat). temsili koloniler seçin ve hisse senedi için 2 gün içinde orta tuzları mannitol transfer (37 ° C, 18 saat).
- S. olun aureus stok süspansiyonu (3 mi HBSS; 1.32 Abs 600, 10 8 CFU / mL)
- S. çalışma yapmak aureus stok (100 ul25 ml HBSS stoklar; 10 5 CFU / ml).
5. Candida ve S. aureus Süspansiyonlar
- Karışık C olun albicans ve S. aureus süspansiyon (250 ul YF veya GT stok ve 25 ml HBSS 100 ul S. aureus stok).
6. polimikrobik Biyofilm Deneyi
- 2 x 10 5 HeLa hücre / ml 200 ul (% 85 birleşen seviyesi) Tohum 96 oyuklu plakalar. Kaya plakaları (30-45 dakika; 37 ° C), inkübasyondan önce (37 ° C,% 5 CO2 kuluçka, 18 saat). Yıkama mono tabakaları (1x; Opt-MEM) daha sonra HSV ile tohum (HSV-1 (KOS) gL86 veya HSV-2 (KOS) 33 GJ - 100 ul Opt-MEM; MOI 50 ve 10). Inkübe edin (37 ° C, 3 saat,% 5 CO2). günde sadece bir virüs suşu kullanın.
- Enfekte tek tabakaları yıkayın (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, Mg + 2 ve Ca + 2 ile (PBS); 100 ul). 25 & # bırakarak sıcak HBSS ile PBS değiştirin181; her bir L.
- YF, GT ve / veya S. ekle (hücre oranı = 5 hedef 100 ul: 1, n = 16), S. aureus çalışma süspansiyonlar. Tablo 1 'de gösterildiği gibi inkübe edin (statik; 30 dakika; 37 ° C,% 5 CO2).
- İnkübasyondan sonra, her seferinde aspire bir sütun hemen Mg + 2 ve Ca + 2 ile 300 ul PBS ile yeniden doldurmak. (1:50 seyreltme 200 ul;, filtre sterilize RIPA) radyo-immünopresipitasyon tahlil lizis tamponu eklemek sonra da iki kez bu adımı yineleyin.
- Hızla HeLa hücre lisatı daha sonra manitol tuzları (MS) ve / veya Fungisel (F) ortam (Şekil 2) üzerine 50 ul koyun Karışım. 90 ° açıyla cam çubuk bükülmüş kullanarak lizat yayıldı. (37 ° C'de 18 saat) inkübe edin. El ile plaka başına koloni sayısını saymak. Kontroller S. oluşur aureus ve / veya C HSV-bulaşmamış HeLa hücrelerinde albicans bağlılık.
7. Görüntüleme Çalışmaları </ P>
- Her yuvarlak cam lamel yıkayın (12 mm; 50 ml aseton ml beher 100). Kuru ve sterilize lamelleri (Kimwipes, cam petri). Alkol alev sterilize forseps ile steril bir 24 yuvalı plakalara ait kuyucuklar içerisine, kuru steril lamelleri yerleştirin.
- yıkandı, steril yuvarlak cam lamelleri içeren 24 gözlü plakalara, HeLa hücreleri (96 gözlü levhalar için kullanılan 5x hacmi 1 mi) eklenir. Adımda yukarıda belirtilen 6.4 6.2.1'de tarif edildiği gibi inkübe ve işlem, 5X 96 gözlü levhalar için kullanılan ses şablonun (Tablo 2) 'e uygun bir virüs, bakteri ya da mantarları ekleyin.
- Son yıkamadan sonra, metanol ile slayt sel ve buharlaşmasına izin vererek mikroskopi için hücreleri düzeltin. boyanma kadar oda sıcaklığında plakaları saklayın.
- Aydınlık alan mikroskobu (1,000x nihai orijinal büyütme) için deiyonize su ile metanol-sabit lamelleri içeren kuyu doldurun. Hemen su aspire. Grams kristal viyole ile her lamel örtün. Yıkama olmayan bağlı leke (deiyonize su) ücretsiz lamelleri. In situ Kuru lamelleri sonra etiketli slayt montaj orta sert seti (Şekil 3) ile yapışır.
- floresan mikroskobu (100x objektif; 1,000x son orijinal büyütme), adım 7.4 açıklandığı gibi yıkama esas metanol ücretsiz lamelleri. kuyularda lamelleri kurulayın.
- Kuruduktan sonra, kapak fişleri kaldırmak ve etiketli slaytlar üzerine koyun. (- 5 ul 1) Daha sonra floresan izotiyosiyanat (FITC) ile birleştirilmiş bayır Herpes Simplex virüs tip 1:20 seyreltme lamel kapsayacak şekilde 1 + 2 gD antikoru yeterli miktarda ilave edin.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir nem odasında slaytlar inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS 4 değişiklikler lamelleri yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, etiketli slayt lamel dönün. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (, nem odası; 30 dakika için 37 ° C DAPI) ile leke. İnkübasyondan sonra 4 Chan lamelleri yıkamaPBS ges, daha sonra sabit set montaj orta ile etiketlenmiş slayt yapıştırın.
- montaj orta karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat boyunca tedavi etmek için izin verin. parlak bir alan mikroskobu veya FITC ve DAPI kesme filtreleri ile floresan mikroskop ya petrol hedefi altında lamelleri inceleyin. Eş-lokalizasyonu (Şekil 4) için en az 50 alanlar (organizma başına en az 100 hücre) fotoğraflarını inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu raporda tarif edilen sistem elde edilebilen veri sağlamlık düzeyi Şekil 2, af 38 'de gösterilmiştir. Bu sistemin kullanılmasıyla viral yönden enfekte hücreleri ve birbirlerinin yapışma üzerindeki etkisi ile stafilokok ve mantar etkileşimin modülasyonuna tarif edilebilir. Polimikrobiyal etkileşimi, aynı hücreler üzerinde oluşup oluşmadığını tespit etmek için, Şekil 3 ve 4 38 'de gösterildiği gibi bu tür çalışmalar etkileşim mikroskopik inceleme gerektirmektedir. Bu çalışmada, farklı hücre etkileşim spesifik viral türler olan stafilokok ve mantar yapışma HSV-modülasyon sonucunda görülmektedir.
S. aureus ve C. Aynı HSV ile enfekte olmayan HeLa kontrol hücrelerine yapıştırılır albicans (GT ve YF). hücreleri üzerinde bu ko-lokalizasyon phys eksikliğini gösterir Ölçülen diferansiyel bağlılık ölçülen düzeyler birbirlerinin HeLa hücre yapışması ve bu ical çıkarım HSV-aracılı (Şekil 3A, A1) 38 olasılığı vardı. Bununla birlikte, HSV-1 veya HSV-2 üzerine HeLa hücrelerinde stafilokoklar ve C hiçbir ko-lokalizasyonunu enfekte albicans gözlenmiştir. (Şekil 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Floresan mikroskobu kullanılarak (FITC-konjuge anti-HSV-gD monoklonal antikoru) ayrıca doğruladı S. aureus C ile birlikte lokalize görünmedi albicans veya HSV-1 veya HSV-2 (Şekil 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). HSV ve Candida arasındaki bu işbirliğinin, hem maya ve germ tüp formları C. (Şekil 2A-F) genişletilmiş albicans. Mikropların üçlüsü arasındaki ilişki Bu özgünlüğü konak oronasopharynx mukozada çok daha geniş bir ölçekte görülen kolonizasyon özgünlüğünü yansıtmaktadır.
1 ">
HeLa hücrelerinde dozaj bağımlı HSV-1 enfeksiyonları Şekil 1. X-gal ile boyama Resimlerde. Lekeli çeşitli MOI ve X-Gal HSV-1 ile enfekte edilmiş HeLa hücreleri. X-Gal lekeli sözde-enfekte HeLa hücre kontrolü ile 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (A) HeLa hücreleri; 20x ilk büyütme; (B) bir enfeksiyon çokluğu 10 (MOI) HSV-1 ile enfekte edilmiş X-Gal lekeli HeLa hücre 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu HeLa hücreleri; 20x ilk büyütme; Enfeksiyon çokluğu 50 (MOI) HSV-1 ile enfekte edilmiş X-Gal lekeli HeLa hücre 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (C), HeLa hücreleri; 20x ilk büyütme; bar için geçerli ölçek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
dosyaları / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
(Panel A, C, E) Enfeksiyon çokluklar de ve HSV-2 (panel B, D, F), 50 ve 10 (MOI) S. yapışması ile ilgili HSV-1 Şekil 2. Etkisi aureus ve / veya C HeLa hücrelerinde albicans. (A) S. aureus (Sa) C varlığında, HSV-1 ile enfekte edilmiş hücrelere bağlanmasını albicans germ tüpleri (GT) ya da maya formları (YF); (B) S. aureus (Sa) C varlığında, HSV-2 ile enfekte olmuş hücrelere bağlanması albicans germ tüpleri (GT) ya da maya formları (YF); (C) C S. mevcudiyetinde, HSV-1 ile enfekte edilmiş hücrelere bağlanma albicans tohumu borular (GT) aureus (SA), (d) C S. mevcudiyetinde, HSV-2 ile enfekte olmuş hücrelere bağlanması albicans tohumu borular (GT) aureus (sa); (E) C S. mevcudiyetinde, HSV-1 ile enfekte edilmiş hücrelere bağlanma albicans maya formları (YF) aureus (sa); (F) C S. mevcudiyetinde, HSV-2 ile enfekte olmuş hücrelere bağlanması albicans maya formları (YF) aureus (Sa). Bütün veri noktaları, ortalama olarak +/- SEM, n = 16 normalize virüssüz kontrole. * = Enfekte HeLa hücre kontrolünden önemli ölçüde farklı (p <0.05). dirsek ile gösterilen eşleştirilmiş noktadan # = önemli ölçüde farklı (p <0.05); Ölçek çubuğu herkes için geçerlidir. 38 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
S. Şekil 3. eksikliği aureus ve C. HSV-1 ve HSV-2 ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde ilgili albicans etkileşimler. S ile HSV-1 ve HSV-2 ile enfekte olmuş (MOI 50) HeLa hücre mono tabakaları aureus ve C. albicans (5: hücreye 1 hedef). Parlak alan için mikroskopi, hücre mono tabakaları daha sonra ışık mikroskopisi ile incelendi Gram kristal viyole ile boyandı. Candida veya S için pozitif hücreler aureus (mikrop sinyal başına 100 ayrı hücre / lamel başına) ikincil ek mikrop co-lokalizasyon sinyalleri varlığı (1,000x ilk büyütme) için tarandı. (A & A1) S. aureus (SA) ve C albicans maya formları (YF) ya da germ tüp formları (GT) enfekte edilmemiş HeLa hücreleri üzerinde birlikte lokalize; (A2, insert). ko-lokalize ya da tek tek mikroplarla HeLa hücrelerinin yüzdesi; (B - B3) S. eksikliği. aureus ve C. HSV-1 mevcudiyetinde albicans eş lokalizasyonu; (Cı - C2) S. eksikliği aureus ve C. HSV-2'nin mevcudiyetinde albicans ko-lokalizasyon. Ortalama ± SEM; Ölçek çubuğu herkes için geçerlidir. 38rYer = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
S. Eş lokalizasyonu Şekil 4. eksikliği C ile aureus albicans HSV-1 veya HSV-2 ile enfekte olmuş HeLa hücreleri üzerinde. S ile HeLa hücre mono tabakaları meydan HSV bulaşmış aureus ve C. albicans (5: 1 hücreye hedef) boyanmıştır (FITC-konjüge anti-HSV gD antikoru ve DAPI). Resimler daha sonra Candida ve S. taranan HSV için sinyalin pozitif hücrelerin tarama elde edilen bulgular temsilcisi aureus sonra ikincil ek mikrop co-lokalizasyon sinyallerinin varlığı için tarandı (lamel başına mikrop sinyal başına 100 ayrı hücreler) (1,000x ilk büyütme; Nikon). (A - A4) C albicans (A2, insert; DAPI boyama) co-lokalize HSV-1 ile; (B- B3) C albicans ko-lokalize HSV-2 (B1, insert, C. DAPI boyama albicans) ile. Ortalama ± SEM; Ölçek çubuğu herkes için geçerlidir. 38 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| tüpler | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| MEDYA | F | F | BAYAN | BAYAN | F | BAYAN | F | F | F | BAYAN | BAYAN | F | BAYAN | F | ||
| bir | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| E | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
Tablo 1.
Polimikrobik Etkileşimleri Mikrobiyal bağlılık Genel Şablon Tayini GT = Candida albicans germ tüp fenotip.; YF = C albicans maya formu fenotip; MSSA = metisiline duyarlı Staphylococcus aureus; MS ortamı manitol tuzları =; F = Fungisel orta. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
| Levha 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| HeLa hücreleri, sadece | HeLa + GT | HeLa + YF | HeLa + Sa | HeLa + GT + Sa | HeLa + YF + Sa | |
| bir | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D | ||||||
| plaka 2 | ||||||
| HSV | HeLa hücreleri + HSV | HSV + HeLa + GT > | HSV + HeLa + YF | HSV + HeLa + Sa | HSV + HeLa + GT + Sa | HSV + HeLa + YF + Sa |
| bir | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D |
Tablo 2.
HSV bulaşmış ve Bulaşmamış HeLa Hücreleri ile polimikrobik etkileşimleri Görsel Analizi Genel Şablon GT = Candida albicans germ tüp fenotip.; YF = C albicans maya formu fenotip; SA metisilin duyarlı Staphylococcus aureus =; HSV Herpes simpleks virüsü =.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şu anda hiçbir bilgi, prokaryot ökaryot ve viral yani çoklu taksonomik etki, çapraz konak mikrobiyomları yarı daimi üyelerinin kalıcı arasındaki karmaşık etkileşimlerin mevcuttur. Bu nedenle S. biyofilm başlamasını incelemek için in vitro model sisteminde bir roman geliştirdi aureus ve C. HSV-1 veya HSV-2 albicans HeLa 229 (HeLa) hücreler 38 etkilemiştir. HeLa hücre model sistem benzersiz bir avantaj sunuyor. Bu, her iki S için bir reseptör görevi görür yüzey fibronektin ifade onların eksikliği, nedeniyle aureus ve C. albicans 39-41. Mukozal epitel apikal 42 yüzeyi normalde daha yakından doğal enfeksiyon ve kolonizasyonu 43-47 gözlenen mimiklerin fibronektin, bu sistemi yoksun beri. Böylece, daha doğrudan mikrobiyomları diğer üyeleri tarafından daha sonraki bağlılık rolü spesifik viral giriş reseptör ciro çalış incelemek mümkün.
Kullanma giriş yetkin olmayan yayılan HSV-1 ve HSV-2, bu bulgular HSV-1 veya HSV-2 hücre giriş S ile süper enfeksiyon dirençli hücreleri oluşturur göstermektedir aureus, C artırırken bir virüs konsantrasyon bağımlı bir tarzda albicans yapışma (Şekil 4). İlginçtir, YF vs GT formları HSV-1 etkileri, HSV-2, klinik sunumlar 48-51 vajinal kandidiyazis teşviki üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilen bir bulgu için ölçülen ters oldu. Bir patogenezi açısından bakıldığında, genel olarak kabul edilmektedir C. GT fenotip albicans YF ortakçı devlet 51-54 ile patojenik şeklidir. C yapışma S ile birlikte inkübe edildi albicans GT aureus YF için ölçülen edilene kıyasla, HSV bulaşmış HeLa hücrelerinde bağlanabilen değiştirilmiş bir modelini göstermektedir - S. aureus bağlanmasını. HSV-1 ama bir sig için, HeLa hücrelerinde GT yapışmasını gelişmişyukarıda tartışıldığı gibi bu, YF bağlılık için YF bağlılık ve GT bağlılık için 190% kontrolü için, yani% 270 kontrol ölçülen göre, önemli ölçüde daha az oranda (p <0.05). Buna ek olarak, ise S. aureus GT bağlanmasının HSV-1 geliştirilmesi üzerinde herhangi bir etki, kok HSV-2 ile aracılık ettiği gelişmiş yapışmasını etkisiz. Ters desen S. gözlendi virüs bulaşmış hücreleri ile YF etkileşimi aureus etkisi. HSV-1 HSV-2 (GT) vs (YF) farklı mantar formlar için bu tercih in vivo kommensal devletin bir rolü yönlendiren bakım oynayabilir. S. GT formunun etkisi ile ilgili olarak aureus bağlama, GT neredeyse tamamen HeLa hücrelerinde stafilokok bağlılığın HSV-1 inhibisyonu kaldırıldı. Bunun aksine, HSV-1, S. varlığı ile karşılaştırıldığında, HSV-2 ile enfekte olmuş hücreler ile ilişkilendirmek için GT kabiliyeti önemli ölçüde artmıştır, ancak aureus, yapışık olarak HSV-2 kaynaklı artışı bloke etmiştir.
S. engellemek için göründüğünü belirlemek için başardık aureus S. beri, etkileşim cell aureus bulaşmamış HeLa hücrelerinde sadece yapıştırılır. Bundan başka, hücrelerin mikroskobik inceleme, Candida ve HSV-1 ve HSV-2 ile birlikte lokalize olduğunu göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, polimikrobiyal etkileşimleri çalışma için bu modelin programı belirten kolonizasyonu için in vivo gözlemler bölgesi özelliği paralel bir arada burada kullanılır.
Bu tarifnamede tarif edilen protokol etkin kullanımı, çeşitli faktörlere bağlıdır. İlk olarak, yayılma eksik virüsün kullanımı. Bu temiz muayenesinde sağlaretki viral giriş ve hücre sinyalizasyon tion saran edinme öncesinde hücre bırakılmasından dolayı ortaya çıkabilir değişikliklerin komplikasyon olmadan, sonraki mikrop etkileşimleri vardır. Buna ek olarak, kusurlu virüsün kullanımı Biyogüvenlik Sınıfı İki patojenlerin taşınması için daha güvenli bir ortam sağlar. İkinci olarak, bu protokol, viral ve mikrop yapışma donanımlarında kullanılmasına imkan verir. Yalnızca belirli reseptörlere bağlanan varyantları kullanılması mikroplar ya da yeni bir reseptör alternatif olarak algılama arasında paylaşılan reseptörlerinin sınırlandırılmasını sağlar. reseptörlerine monoklonal antikorların kullanımı yoluyla, var mikrop yüzeyinde adezin lokalizasyonu görselleştirilmesi için potansiyeli ve değiştirilmiş adezin ekspresyonunu incelemek için bir araç sağlar. Bu protokol, seçici olarak ayırıcı ortamı üzerinde izole edilemez mikropların çalışma için uygun değildir. yöntem, aynı zamanda, virüs spesifik proteinlere monoklonal antikorun mevcudiyetine bağlıdır. Her ne kadarBu çalışmada nalysis söz konusu mikropların morfoloji ve büyüklük bakımından benzer olmalıdır etkili bir iş çevresinde olacağını maya ve bakteri, diferansiyel floresan etiketli kullanımı, örneğin Teksas kırmızı, mikrop spesifik monoklonal antikor arasındaki boyut farkı tarafından geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
