Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemmelse af biofilm Initiation på virusinficerede celler af bakterier og svampe

Published: July 6, 2016 doi: 10.3791/54162
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

Abstract

Studiet af polymikrobielle interaktioner på tværs af de taksonomiske riger der omfatter svampe, bakterier og virus er ikke tidligere blevet undersøgt med hensyn til hvordan virale medlemmer af microbiome påvirke de efterfølgende mikrobe interaktioner med disse virusinficerede værtsceller. Den sameksistens af virus med bakterier og svampe er hovedsagelig til stede på slimhindeoverfladerne i mundhulen og genitale. Slimhindeceller, især dem med vedvarende kroniske eller vedvarende latente virusinfektioner, kunne have en betydelig indvirkning på medlemmer af microbiome gennem virus ændring i antallet og typen af ​​receptorer udtrykt. Ændring i host cellemembranen arkitektur ville resultere i ændret evne af efterfølgende medlemmer af den normale flora og opportunistiske patogener at indlede det første skridt i biofilm dannelse, dvs vedhæftning. Denne undersøgelse beskriver en fremgangsmåde til kvantificering og visuel undersøgelse af HSV effekt på initieringen af ​​biofilm formation (adhærens) af S. aureus og C. albicans.

Introduction

Den humane microbiome omfatter forskellige organismer fra flere taksonomiske riger der deler geografiske regioner i kroppen. Overholdelse celleoverflader er et vigtigt første skridt i biofilm dannelse, som er en del af microbiome kolonisering processen. Inkluderet i microbiome kan være vira, der forårsager kroniske og vedvarende infektioner. Den kroniske celle infektion med disse vira kan forårsage en ændring i formodede receptor tilgængelighed. 1,2 Derudover celleindtrængen af intracellulære patogener kan også påvirke vært membranfluiditeten / hydrofobicitet, hvilket igen kan ændre binding af andre microbiome medlemmer, herunder bakterier og svampe . For at forstå de interaktioner, der kan opstå mellem disse mange patogener, der co-lokaliserer i de samme geografiske regioner af humane vært, må vi kunne studere interaktionen af ​​patogener, der repræsenterer spektret af taksonomiske riger stede på slimhindeoverfladen.

t "> The Herpesviridae er en familie af mikrober til stede i 100% af mennesker som permanente medlemmer af microbiome 3,4. Desuden kan de også vedvarende kaste både i nærvær og fravær af symptomer. Specifikt herpes simplex virus-1 og herpes simplex virus-2 (HSV-1 og HSV-2, henholdsvis) er permanente medlemmer af microbiome i oronasopharynx og genitale område. i immun-kompetente individer, både HSV-1 og HSV-2 forårsager gingivostomatitis, samt genital herpes 5-8. på disse steder, HSV forårsager en latent infektion er karakteriseret ved kronisk persisterende asymptomatisk virusudskillelse 9. indtastning af HSV i celler resulterer i ændringer i overfladeekspression af nectins, heparansulfat, lipidklumper og herpesvirus entry mediator / tumornekrose factor receptor (HVEM / TNFr) 10-25. Disse repræsenterer potentielt delte receptorer for nogle bakterier og svampe, f.eks S. aureus og C. albicans, der mens opportunistiske patogener,kan også opholde sig som medlemmer af slimhinde microbiome af oronasopharynx 26,27. Inden for oronasopharynx S. aureus og C. albicans besætte to forskellige steder af kolonisering. I værter med naturlige tænder, er mundslimhinden deles af HSV-1 og C. albicans, medens de forreste nasale Nares er besat af S. aureus 28. Trods in vitro resultater, at S. aureus overholder mund epitelceller, 29,30 S. aureus er sjældent isoleres fra orale præparater, når normalt væv er til stede 29,30. Der vides kun lidt om kønsorganer co-kolonisering nicher ud over de kliniske fund, at S. aureus er forbundet med aerob vaginitis, kendetegnet ved genital inflammation, udledning og dyspareuni, mens C. albicans producerer slimhindelæsioner lignende, der blev observeret i mundhulen 31-35. Selv om disse medlemmer af den mundtlige og genital Microbiogle cross taksonomiske riger lidt er kendt om deres interaktion som det påvirker deres evne til at initiere biofilmdannelse gennem overholdelse værten celleoverfladen 5. Denne protokol er blevet effektivt anvendt til at bestemme de funktionelle konsekvenser af co-kolonisering / infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HSV-stammer og håndtering

Bemærk: Rekombinant ikke-sprede HSV-1 (KOS) gL86 og HSV-2 (KOS) 333gJ - med beta-galactosidase reporter aktivitet anvendte blev leveret af V. Twiari 36,37.

  1. Brug virus fra samme parti og opbevares ved -80 ° C ved en 1: 1-forhold mellem Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum (FBS) og skummetmælk indtil anvendelse. Før viral parti opbevaring, fastlægge viruskoncentration ved o-nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) assay.
  2. Bestem virus levedygtighed og infektionsmultiplicitet (MOI) af X-Gal-farvning for hver forsøgsgruppe analysekørsel hjælp reporter virus entry assay som tidligere beskrevet (figur 1) 14.
  3. Fortynd virus (Opt-MEM) til den ønskede MOI. Fix monolag (paraformaldehyd; 0,5 ml / brønd) før farvning. Placer kontrol virus levedygtighed i en separat microtiter plade parallelt med polymikrobielle assayplader.

2. HeLa 299 Cell Håndtering

  1. Vokse ved 37 ° C, 5% CO2 i DMEM med 4,5 g / l glucose, 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), gentamicin (50 ug / ml) og L-glutamin. Passage-celler ved 80% konfluens med trypsin-opløsning (ethylendiamintetraeddikesyre, 0,53 M EDTA, 0,05% trypsin, 5 ml / kolbe).

3. C. albicans Handling

Bemærk: C. albicans opnået fra en klinisk laboratorium kilde opbevares ved -80 ° C i Remmel skummetmælk 2x medium.

  1. Kultur frosset stock onto Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Efter 24 timers subkultur C. albicans onto Fungisel medium (37 ° C, 48 timer) til anvendelse.
  2. Generer kim rør (GT) former (pick repræsentative kolonier, 3 ml FBS, 3 timer, 37 ° C, Abs 600, 0,3). Efter inkubation vaskes GT (HBSS, 2x, 4000 xg). Tilføj vasket GT til opvarmet HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT former skal være 99% af cellerne observeret som bestemt af hæmocytometer tæller.
  3. Lav gær formular (YF) lager suspensioner ved at vælge repræsentative Fungisel kolonier (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Tæl antallet af YF formularer / ml mikroskopisk ved hjælp af et hæmocytometer. YF former skal være 99% af cellerne observeret som bestemt af hæmocytometer tæller.
  4. Gør arbejdet svampe lager (250 ul GT eller YF lager i 25 ml HBSS, 37 ° C, 10 5 CFU / ml)

4. S. aureus Handling

  1. Store S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel skummetmælk 2x). Kultur på fåreblodsagar (5%; 37 ° C; 24 timer). Pick repræsentative kolonier og overførsel til mannitol salte medium inden for 2 dage for lager (37 ° C, 18 timer).
  2. Make S. aureus stock suspension (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 CFU / ml)
    1. Gør arbejdet S. aureus stock (100 piaf bestanden i 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida og S. aureus Karantæner

  1. Foretag blandet C. albicans og S. aureus suspension (250 pi YF eller GT lager og 100 pi S. aureus lager i 25 ml HBSS).

6. polymikrobielle Biofilm Assay

  1. Seed plader med 96 brønde med 200 pi 2 x 10 5 HeLa celler / ml (85% konfluens niveau). Rock plader (30 - 45 min; 37 ° C) inden inkubation (37 ° C; 5% CO2-inkubator; 18 h). Vask monolag (1x; Opt-MEM) så frø med HSV (HSV-1 (KOS) gL86 eller HSV-2 (KOS) 33 GJ - i 100 pi Opt-MEM, MOI 50 og 10). Inkubér pladerne (3 timer; 37 ° C; 5% CO2). Kun bruge en virusstamme per dag.
  2. Vask inficerede monolag (1x; phosphatbufret saltvand (PBS) med Mg + 2 og Ca + 2; 100 pi). Erstat PBS med varm HBSS forlader 25 & #181; l i hver brønd.
    1. Tilføj YF, GT og / eller S. aureus arbejder suspensioner (100 pi, målgruppe til celle-forhold = 5: 1; n = 16). som angivet i tabel 1 Inkubér pladerne (statiske; 30 min; 37 ° C; 5% CO2).
  3. Efter inkubering aspireres én kolonne på et tidspunkt umiddelbart genpåfyldning med 300 pi PBS med Mg + 2 og Ca + 2. Gentag dette trin to gange derefter tilføje radio-immunopræcipitationsassay lysis buffer (RIPA, filter steriliseret, 200 pi af en 1:50 fortynding).
  4. Hurtigt udriv HeLa-cellelysat derefter placere 50 pi onto mannitol salte (MS) og / eller Fungisel (F) medier (figur 2). Spred lysatet med en glasstav bøjet i en 90 ° vinkel. Inkubér pladerne (18 timer ved 37 ° C). Manuelt tælle antallet af kolonier per plade. Kontroller består af S. aureus og / eller C. albicans overholdelse HSV-inficerede HeLa-celler.

7. Imaging Studies </ P>

  1. Vask hver runde dækglas (12 mm, 50 ml acetone i 100 ml bægerglas). Tørre og sterilisere dækglas (Kimwipes, glas petriskåle). Placer tørre, sterile dækglas i brøndene på sterile brønds plader 24 med alkohol flamme steriliseret pincet.
  2. Tilføj HeLa-celler (1 ml; 5x volumen anvendes til plader med 96 brønde) til brøndene i 24-brønds plader indeholdende de vaskede sterile runde dækglas. Tilsæt virus, bakterier og svampe efter skabelonen (tabel 2) ved 5x volumen anvendes til 96-brønds pladerne, derefter inkuberes og fremgangsmåde som beskrevet i trin 6.2.1 til 6,4 ovenfor.
  3. Efter den sidste vask, fikseres cellerne til mikroskopi ved at oversvømme objektglasset med methanol og lade den fordampe. pladerne ved stuetemperatur lagre indtil farvning.
  4. For lysfeltmikroskopi (1.000 x endelig oprindelige forstørrelse) fylde brøndene indeholdende methanol-fikserede dækglas med deioniseret vand. Umiddelbart aspirere vand. Dæk hver dækglasset med Grams krystalviolet. Wash Dækglas fri for ikke-bundet farvning (deioniseret vand). Tørre dækglas in situ derefter klæbe dem med hårdt sæt monteringsmedium til en mærket glas (figur 3).
  5. For fluorescensmikroskopi (100x mål; 1.000 x endelig oprindelig forstørrelse) vask dækglas fri for methanol væsentlige som beskrevet i trin 7.4. Tør dækglassene i brøndene.
    1. Efter tørring fjerne dækglas og placere dem på mærkede dias. tilføj derefter en tilstrækkelig mængde fortyndet 1:20 fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret herpes simplex virus type 1 + 2 gD-antistof til at dække dækglasset (1 - 5 pi).
    2. Glassene inkuberes tildækket i et fugtighedskammer ved 37 ° C i 30 minutter. Efter inkubation vaskes dækglassene i 4 hold PBS.
    3. Efter den sidste vask, returnere dækglas til den mærkede objektglas. Pletten med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, fugt kammer; 37 ° C i 30 minutter). Efter inkubering vaskes dækglassene i 4 chanGES PBS, derefter anbringe til den mærkede dias med hårdt sæt montering medium.
    4. Tillad monteringsmedium hærde i 24 timer ved stuetemperatur i mørke. Undersøg dækglas under olie målsætning om enten et lyst felt mikroskop eller fluorescerende mikroskop med FITC og DAPI cutoff filtre. Undersøg billeder af mindst 50 felter (100 celler pr organisme minimum) for co-lokalisering (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Niveauet for robusthed data opnåelige fra system beskrevet i denne rapport er vist i figur 2 af 38. Gennem brug af dette system kan afgrænses modulation af stafylokok og svampe interaktion med virusinficerede celler og deres effekt på hinandens tilslutning. Disse typer af undersøgelser kræver mikroskopisk undersøgelse af interaktionen, som vist i figur 3 og 4 38 med henblik på at afgøre, om polymikrobielle interaktion forekommer på de samme celler. I denne undersøgelse iagttages forskellen celle interaktion som følge af HSV-modulation af stafylokok og fungal adhærens der er virale artsspecifik.

S. aureus og C. albicans (GT og YF) levet op til de samme HSV-inficerede HeLa kontrol celler. Dette samarbejde lokalisering på celler indikerer en mangel på fys ical følgeslutning med hinandens HeLa celle vedhæftning og at de målte niveauer af forskellen vedhæftning målte sandsynligvis HSV-medieret (figur 3A, A1) 38. Men efter HSV-1 eller HSV-2 inficerede HeLa-celler ingen co-lokalisering af stafylokokker og C. albicans blev observeret. (Figurerne 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Under anvendelse af fluorescensmikroskopi (FITC-konjugeret anti-HSV-gD monoklonalt antistof) bekræftede endvidere, at S. aureus syntes ikke at co-lokalisere med C. albicans eller HSV-1 eller HSV-2 (figur 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Dette samarbejde mellem HSV og Candida udvidet til både gær og kim rør former (figur 2A-F) af C. albicans. Denne specificitet association mellem triaden af ​​mikrober afspejler specificitet kolonisering set på en langt bredere skala i værten oronasopharynx slimhinde.

1 "> figur 1
Figur 1. X-gal-farvning Billeder af Dosering Dependent HSV-1-infektion i HeLa-celler. HeLa-celler inficeret med HSV-1 ved forskellige MOI og X-Gal farves. (A) HeLa-celler i brønd af 96-brønds plade med X-Gal farvet mock-inficerede HeLa-celle kontrol; 20x indledende forstørrelse; (B) HeLa-celler i brønd af 96-brønds plade med X-Gal farvet HeLa celle inficeret med HSV-1 ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10; 20x indledende forstørrelse; (C) HeLa-celler i brønd af 96-brønds plade med X-Gal farvet HeLa celle inficeret med HSV-1 ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 50; 20x indledende forstørrelse; skala bar gælder for alle. Klik her for at se en større version af dette tal.

filer / ftp_upload / 54.162 / 54162fig2.jpg "/>
Figur 2. Virkning af HSV-1 (panel A, C, E) og HSV-2 (felt B, D, F) ved infektionsmultipliciteter (MOI) på 50 og 10 på adhærence af S. aureus og / eller C. albicans til HeLa-celler. (A) S. aureus (Sa) binding til HSV-1-inficerede celler i nærvær af C. albicans kimtråde (GT) eller gær former (YF); (B) S. aureus (Sa) binding til HSV-2 inficerede celler i nærvær af C. albicans kimtråde (GT) eller gær former (YF); (C) C. albicans mikroberør (GT) binder til HSV-1-inficerede celler i nærvær af S. aureus (Sa), (D) C. albicans mikroberør (GT) binder til HSV-2 inficerede celler i nærvær af S. aureus (Sa); (E) C. albicans gær former (YF) -binding til HSV-1-inficerede celler i nærvær af S. aureus (Sa); (F) C. albicans gær former (YF) -binding til HSV-2 inficerede celler i nærvær af S. aureus (Sa). Alle datapunkter er Mean +/- SEM, n = 16 normaliseret til virusfri kontrol. * = Signifikant forskellige (p <0,05) fra uinficerede HeLa celle kontrol. # = Signifikant forskellige (p <0,05) fra parret punkt angivet med beslag; skala bar gælder for alle. 38 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Manglende S. aureus og C. albicans interaktioner på HSV-1 og HSV-2 inficerede HeLa-celler. HSV-1 og HSV-2 inficerede (MOI 50) HeLa-cellemonolag med S. aureus og C. albicans (5: 1 target til celle). For lyse felt mikroskopi blev cellemonolag farvet med Grams krystalviolet, derefter undersøgt ved lysmikroskopi. Celler, der var positive for Candida eller S. aureus (100 individuelle celler pr mikrobe signal / pr dækglas) blev sekundært scannes for tilstedeværelsen af yderligere mikrobe co-lokaliseringssignaler (1.000 x oprindelige forstørrelse). (A & A1) S. aureus (Sa) og C. albicans gær formularer (YF) eller kim rør former (GT) co-lokalisere på inficerede HeLa-celler; (A2, indsæt). Procent af HeLa-celler med co-lokaliserede eller individuelle mikrober; (B - B3) Manglende S.. aureus og C. albicans co-lokalisering i nærvær af HSV-1; (C - C2) Manglende S. aureus og C. albicans co-lokalisering i nærvær af HSV-2. Middelværdi ± SEM; skala bar gælder for alle. 38rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Mangel på Co-lokalisering af S. aureus med C. albicans på HSV-1 eller HSV-2 inficerede HeLa-celler. HSV-inficerede HeLa-cellemonolag udfordring med S. aureus og C. albicans (5: 1 target til celle) farves (FITC-konjugeret anti HSV gD-antistof, og DAPI). Billeder er repræsentative for resultaterne fra screening af celler, der var signal positive for HSV derefter scannet for Candida og S. aureus (100 individuelle celler pr mikrobe signal pr dækglas), der blev derefter sekundært scannes for tilstedeværelsen af yderligere mikrobe co-lokalisering signaler (1.000 x forstørrelsen; Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, indsætte, DAPI farvning) co-lokalisere med HSV-1; (B- B3) C. albicans co-lokaliseret med HSV-2 (B1, indsætte, C. albicans DAPI farvning). Middelværdi ± SEM; skala bar gælder for alle. 38 Klik her for at se en større version af dette tal.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
Rør GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
MEDIER F F FRK FRK F FRK F F F FRK FRK F FRK F
EN
B
C
D
E
F
G
H

Tabel 1.
Generel skabelon Bestemmelse af Mikrobiel Overholdelse i polymikrobielle Interaktioner GT = Candida albicans kim rør fænotype.; YF = C. albicans gær formular fænotype; MSSA = methicillin følsomme Staphylococcus aureus; MS = mannitol salte medium; F = Fungisel medium. Klik her for at downloade denne fil.

plade 1 1 2 3 4 5 6
Kun HeLa-celler HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
EN
B
C
D
plade 2
HSV HeLa-celler + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
EN
B
C
D

Tabel 2.
General Skabelon til visuel analyse af polymikrobielle Interaktioner med HSV-inficerede og Ikke-inficerede HeLa-celler GT = Candida albicans kim rør fænotype.; YF = C. albicans gær formular fænotype; SA = methicillin følsomme Staphylococcus aureus; HSV = herpes simplex-virus.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I øjeblikket ingen oplysninger om komplekse vekselvirkninger mellem permanent til semi-permanente medlemmer af værten microbiome der krydser flere taksonomiske domæner, dvs. prokaryote, eukaryote og virale. Derfor udviklede vi en hidtil ukendt in vitro modelsystem til at studere biofilm initiering af S. aureus og C. albicans på HSV-1 eller HSV-2 inficerede HeLa 229 (HeLa) -celler 38. Den HeLa celle modelsystem er en enestående fordel. Dette skyldes deres manglende overfladen fibronectin ekspression, der tjener som en receptor for både S. aureus og C. albicans 39-41. Da den apikale 42 overflade af mucosale epitel mangler normalt fibronectin, dette system nærmere efterligner observeret i naturlig infektion og kolonisering 43-47. Således er vi i stand til mere direkte at undersøge den rolle specifikke viral indgang receptor omsætning spiller i efterfølgende tilslutning af andre medlemmer af microbiome.

Brug af entry dygtige ikke-spredning HSV-1 og HSV-2, viser disse resultater, at celleindtrængen af HSV-1 eller HSV-2 gengiver celler refraktære over for super-infektion med S. aureus, samtidig med at C. albicans vedhæftning i en virus koncentrationsafhængig måde (figur 4). Interessant, effekten af HSV-1 på GT former vs YF, var det modsatte af det målt for HSV-2, en konstatering, som kan have en betydelig indvirkning på fremme af vaginal candidiasis i kliniske præsentationer 48-51. Fra et patogenese perspektiv er det generelt accepteret, at GT fænotype af C. albicans er den patogene form, med YF den kommensale tilstand 51-54. Vedhæftning af C. albicans GT, som blev co-inkuberet med S. aureus viste en ændret mønster til at binde til HSV-inficerede HeLa-celler, sammenlignet med den målt for YF - S. aureus binding. HSV-1 forøget adhærens af GT til HeLa-celler, men til en signasentligt mindre grad (p <0,05) end den målt for YF adhærens, som beskrevet ovenfor, dvs. 270% kontrol for YF adhærens og 190% kontrol for GT adhærens. Derudover mens S. aureus havde ingen virkning på HSV-1 forstærkning af GT bindende bestemmer coccus negeret den forbedrede vedhæftning medieret af tilstedeværelsen af HSV-2. Det omvendte mønster blev observeret for S. aureus effekt på YF interaktion med virusinficerede celler. Denne forkærlighed for forskellige fungale former ved HSV-1 (YF) vs. HSV-2 (GT) kan spille en rolle dirigere opretholdelse af kommensale tilstand in vivo. Med hensyn til virkningen af GT form på S. aureus binding, GT næsten helt afskaffet HSV-1 hæmning af stafylokok overholdelse HeLa-celler. I modsætning hertil selvom evne GT at associere med HSV-2 inficerede celler blev signifikant forøget sammenlignet med HSV-1, tilstedeværelsen af S. aureus blokerede HSV-2 medieret stigning i vedhæftning.

S. aureus-celle-interaktion, eftersom S. aureus klæbet udelukkende til ikke-inficerede HeLa-celler. Endvidere mikroskopisk undersøgelse af celler viser, at Candida og HSV-1 og HSV-2 co-lokaliseret. Anvendes sammen her resultaterne fra denne undersøgelse parallelle in vivo observationer websted specificitet for kolonisering indikerer anvendeligheden af denne model for studiet af polymikrobielle interaktioner.

Effektiv anvendelse af protokollen beskrevet heri er afhængig af en række faktorer. Først anvendelsen af ​​spredning deficient virus. Dette muliggør en ren undersøgelser eftertion af effekten viral indrejse og cellesignalering har tilbagevendende mikrobe interaktioner, uden komplikation af ændringer, der kan opstå som følge af indhylle-erhvervelse forud for forlader cellen. Desuden brug af mangelfulde virus giver mulighed for en mere sikkert miljø for håndtering af Biosafety Class Two patogener. For det andet, denne protokol giver mulighed for brug af både virale og mikrobe compliance varianter. Brug af varianter, der kun binder til specifikke receptorer tillader afgrænsning af fælles receptorer mellem mikrober eller alternativt påvisningen af ​​hidtil ukendte receptorer. Gennem anvendelse af monoklonale antistoffer til receptorerne, er der mulighed for visualisering af adhesin lokalisering på mikrobe overflade og tilvejebringer et værktøj til at studere ændret adhæsin ekspression. Denne protokol er ikke egnet til undersøgelse af mikrober, der ikke kan selektivt isoleret på differentielt medium. Metodologien er også afhængig af tilgængeligheden af ​​monoklonalt antistof til virusspecifikke proteiner. selv om enNALYSE i denne undersøgelse blev styrket ved differentiel størrelse mellem gær og bakterier, anvendelse af differentielt fluorescens mærkede, f.eks Texas rød, mikrobe specifikt monoklonalt antistof ville være en effektiv work-around bør mikroberne pågældende være af samme morfologi og størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

Infektion polymikrobielle biofilm herpes simplex virus, Overholdelse
Bestemmelse af biofilm Initiation på virusinficerede celler af bakterier og svampe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plotkin, B. J., Sigar, I. M.,… More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter