Abstract
真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。
Introduction
人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。
tは">ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV株及び取扱い
注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。
- 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 入出力 -nitrophenyl-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-GAL）アッセイによりウイルス濃度を決定します。
- 前述のように、レポーターウイルス侵入アッセイを使用して各実験アッセイの実行のためのX-Gal染色により、感染のウイルス生存率および多重度（MOI）を決定する（ 図1）14。
- 希望のMOIに（オプトMEM）のウイルスを希釈します。染色の前に、単層（/ウェル0.5ミリリットルパラホルムアルデヒド）を修正しました。別々のmicroti中のウイルスの生存能力のコントロールを配置複数菌アッセイプレートと平行にタープレート。
2.のHeLa 299細胞の取扱い
- 4.5g / Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ゲンタマイシン（50μg/ ml）およびL-グルタミンを含むDMEM中で37℃、5％CO 2で成長します。トリプシン溶液で80％コンフルエンスで継代細胞（エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05％トリプシン; 5ミリリットル/フラスコ）。
3. C.取り扱いアルビカンス
注：C.臨床検査源から得アルビカンス媒体約2倍のスキムミルクRemmelに-80℃で保存します。
- 文化はサブローデキストロース培地（37℃）に株式を凍結しました。 24時間のサブカルチャーC.後Fungisel媒体へアルビカンス （37°C、48時間）の使用のため。
- 発芽管（GT）の形を生成（; 3ミリリットルFBSを、代表的なコロニーを選ぶ3時間、37℃、腹筋600、0.3）。インキュベーション後、GT洗浄（HBSSを、2倍、4,000×gでの）。 （37＆温めHBSSに洗浄GTを追加します。＃176; C; 0.32のAbs 600）。 GT形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。
- 代表Fungiselコロニーピッキングによって酵母形（YF）株式懸濁液を作る（HBSS、3ミリリットルを、0.32のAbs 600）。 /微視的に血球計数器を使用して、mlのYFのフォームの数をカウントします。 YF形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。
- 作業の真菌株（; 37℃; 10 5 CFU / mlの25ミリリットルHBSS中のGTまたはYF株式の250μl）を作ります
4. S.球菌取り扱い
- ストアS.黄色ブドウ球菌 ATCC 25923（-80°C; Remmelは牛乳の2倍を脱脂）。ヒツジ血液寒天培地（; 37℃、24時間、5％）上に培養。代表的なコロニーを選択し、株式のために2日以内に培地塩をマンニトールへの転送（37℃、18時間）。
- S.を作ります黄色ブドウ球菌ストック懸濁液（3ミリリットルHBSS; 1.32腹筋600; 10 8 CFU / ml）を
- S.作業してください黄色ブドウ球菌株（100μlの25ミリリットルのHBSSの株式の。 10 5 CFU / mlで）。
5. カンジダとS.球菌懸濁液
- メイク混合C.アルビカンスおよびS.黄色ブドウ球菌懸濁液（250μlのYFまたはGTの株式と25ミリリットルHBSS中の100μlの黄色ブドウ球菌株 ）。
6.複数菌バイオフィルムアッセイ
- 2×10 5 HeLa細胞/ mlの200μlの（85％のコンフルエンスのレベル）でシード96ウェルプレート。ロックプレート（30から45分、37℃）インキュベーション前（37℃、5％CO 2インキュベーター; 18時間）。ウォッシュ単層（1×;オプトMEM）をHSVにシード（HSV-1（KOS）gL86またはHSV-2（KOS）33 GJ - 100μl中のOpt-MEM; MOI 50及び10）。プレートをインキュベート（3時間、37℃、5％CO 2）。 1日に1回だけウイルス株を使用してください。
- 感染した単層（; Mgの2及びCa 2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）;100μlの1×）で洗浄します。 25＆＃残し暖かいHBSSでPBSを交換してください181;各ウェルのリットル。
- YF、GTおよび/ またはSを追加します。 表1に示されるように平板培養する（静的に、30分間、37°C、5％CO 2） 黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液（N = 16; 1、100μlの細胞比の目標= 5）。
- インキュベーション後、一度に吸引1列には、すぐにマグネシウム2およびCa +2で300μlのPBSで再充填します。ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー（;濾過滅菌; 1:50希釈の200μlのRIPA）を追加し二回、この手順を繰り返します。
- 急速にHeLa細胞溶解物は、次いでマンニトール塩（MS）及び/又はFungisel（F）培地（ 図2）の上に50μlのを配置し粉砕します。 90°の角度でガラス棒を曲げを使用して溶解液を広げます。 （37℃で18時間）培養します。手動でプレートあたりのコロニー数をカウントします。コントロールは、Sから成り黄色ブドウ球菌および/ またはC. HSV-非感染HeLa細胞へアルビカンス付着 。
7.イメージング研究</ P>
- 各ラウンドガラスカバースリップを洗ってください（12ミリメートル、50ミリリットルのアセトンミリリットルビーカー100中）。乾燥及び滅菌カバースリップ（キムワイプ;ガラスシャーレ）。アルコール火炎滅菌鉗子で滅菌24ウェルプレートのウェルに、乾燥、滅菌カバースリップを置きます。
- 洗浄滅菌ラウンドガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルに、HeLa細胞（96ウェルプレートに使用される5倍の体積1ミリリットル）を追加します。上記の手順6.4に6.2.1で説明したように、その後インキュベートし、プロセス、5×96ウェルプレートに使用する音量でテンプレート（表2）によれば、ウイルス、細菌および真菌を追加します。
- 最終洗浄後、メタノールでスライドをフラッディングし、それを蒸発させることにより、顕微鏡検査のために細胞を固定します。染色まで室温でプレートを保管してください。
- 明視野顕微鏡（1,000倍、最終的な元の倍率）のために脱イオン水でメタノール固定カバースリップを含むウェルを埋めます。すぐに水を吸引。グラムクリスタルバイオレットで各カバースリップをカバー。ウォッシュは、非結合染色（脱イオン水）の自由カバースリップ。 その場で乾燥したカバースリップは、その後、標識されたスライドにメディアをマウントハードセット（図3）とそれらを接着します。
- 蛍光顕微鏡（100倍の対物; 1,000倍、最終的な元の倍率）のためにステップ7.4で説明したように、洗浄は、基本的にメタノールの自由カバースリップ。ウェル中のカバースリップを乾燥させます。
- 乾燥させた後、カバースリップを削除し、ラベルされたスライド上に置きます。 （ - 5μL1）次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合単純ヘルペスウイルスのタイプの1：20希釈のカバースリップをカバーするために1 + 2のgD抗体を十分な量を追加します。
- 30分間、37℃で湿気チャンバー内でスライドをインキュベートします。インキュベーション後、PBSの4変化でカバースリップを洗います。
- 最終洗浄後、標識されたスライドにカバースリップを返します。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（;湿度室、30分間、37°C DAPI）で染色。インキュベーション後4ちゃんにカバースリップを洗いますPBSのGESは、その後、メディアをマウントハードセットで標識されたスライドに貼り付けます。
- マウンティング培地は暗所で室温で24時間硬化させます。 FITCおよびDAPIカットオフフィルターで明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡のいずれかで油浸対物レンズの下にカバースリップを調べます。共局在（ 図4）のために少なくとも50フィールド（生物ごとに最低100個の細胞）の写真を調べます。
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Representative Results
このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3および4 38に示すように、研究のこれらのタイプは、相互作用の顕微鏡検査を必要とします。この研究では、差動細胞の相互作用は、特定のウイルス種であるブドウ球菌および真菌付着のHSV-変調の結果として観察されます。
黄色ブドウ球菌およびC.アルビカンス （GTおよびYF）は、同じHSV非感染HeLa細胞の対照細胞に付着しました。細胞上のこの共局在は、物理ポートが不足していることを示し測定された差動順守の測定レベル互いのHeLa細胞接着性と、そのicalの推論は、HSV媒介（ 図3A、A1）38可能性が高かったです。しかし、HSV-1またはHSV-2時のHeLa細胞をブドウ球菌およびCのない共局在感染しませんアルビカンスが観察されました。 （ 図3B、B1、B2、B3、C1、C2）。 （FITC結合抗HSV-gDのモノクローナル抗体）、蛍光顕微鏡を用いて、さらにS.ことが確認され黄色ブドウ球菌は、Cと共局在した形跡はありませんアルビカンスもHSV-1またはHSV-2（ 図4A、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3）。 HSVとカンジダとの間のこの協力酵母および生殖管の両方の形式に拡張（ 図2A-F）Cのアルビカンス 。微生物のトライアドとの間の関連付けのこの特異性は、ホストoronasopharynx粘膜におけるより広範な規模で見た植民地の特異性を反映しています。
1 ">
HeLa細胞における用量依存性HSV-1感染の図1のX-gal染色写真。染色し、様々なMOIおよびX-galでHSV-1に感染したHeLa細胞。 X-Galの染色された偽感染HeLa細胞制御と、96ウェルプレートのウェル中の（A）HeLa細胞; 20倍の初期倍率。 （B）10の感染多重度（MOI）でのHSV-1に感染したX-GAL染色されたHeLa細胞で96ウェルプレートのウェル中のHeLa細胞。 20倍の初期倍率。 （C）50の感染多重度（MOI）でのHSV-1に感染したX-GAL染色されたHeLa細胞で96ウェルプレートのウェル中のHeLa細胞。 20倍の初期倍率。スケールバーは、すべてに適用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ファイル/ ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
図2 Sの付着の50及び10のHSV-1（パネルA、C、E）及びHSV-2（パネルB、D、F）感染多重度で（MOI）の影響黄色ブドウ球菌および/ またはC. HeLa細胞にアルビカンス 。 （A）S.球菌 （SA）はCの存在下でHSV-1感染細胞への結合しますアルビカンスの発芽管（GT）または酵母フォーム（YF）。 （B）S.球菌 （SA）はCの存在下でHSV-2に感染した細胞への結合しますアルビカンスの発芽管（GT）または酵母フォーム（YF）。 （C）C. Sの存在下でHSV-1感染細胞への結合アルビカンス発芽管（GT） 黄色ブドウ球菌 （SA）;（D）C. Sの存在下でHSV-2に感染した細胞に結合アルビカンス発芽管（GT） 黄色ブドウ球菌 （SA）。 （E）C. Sの存在下でHSV-1感染細胞への結合アルビカンス酵母フォーム（YF） 黄色ブドウ球菌 （SA）。 （F）C. Sの存在下でHSV-2に感染した細胞に結合アルビカンス酵母フォーム（YF） 黄色ブドウ球菌 （SA）。すべてのデータポイントは平均値+/- SEM、N = 16の正規化ウイルスフリーのコントロールに。* =非感染HeLa細胞のコントロールと有意に異なる（P <0.05）。ブラケットで示される対になった時点から＃=著しく異なった（p <0.05）。スケールバーは、すべてに適用されます。38は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
S. 図 3 欠如aureusおよびC. HSV-1およびHSV-2感染のHeLa細胞に対するアルビカンスの相互作用。S.とHSV-1およびHSV-2感染（MOI 50）のHeLa細胞単層aureusおよびC.アルビカンス （5：セルに1ターゲット）。明視野のための顕微鏡検査は、細胞単層は、その後、光学顕微鏡で検査し、グラムのクリスタルバイオレットで染色しました。 カンジダまたはS.について陽性であった細胞黄色ブドウ球菌 （微生物信号/カバースリップあたりあたり100個々のセル）が二次追加の微生物共局在化シグナルの存在（1,000倍初期倍率）のためにスキャンしました。 （A＆A1）S.黄色ブドウ球菌 （SA）とC.アルビカンス酵母形（YF）または発芽管形（GT）非感染HeLa細胞に共局在。 （A2、挿入 ）。共局在または個々の微生物とHeLa細胞の割合。 （B - B3）S.の欠如。 aureusおよびC. HSV-1の存在下でアルビカンス共局在。 （C - C2）S.の欠如aureusおよびC. HSV-2の存在下でアルビカンス共局在。平均±SEM;スケールバーは、すべてに適用されます。38目標確認= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
S.の共局在の図4.不足C.と球菌 HSV-1またはHSV-2感染のHeLa細胞に対するアルビカンス 。S.とHSV感染HeLa細胞単層の挑戦aureusおよびC.アルビカンス （5：1の細胞への標的）染色（FITC結合抗HSVのgD抗体、およびDAPI）。写真はその後、 カンジダとS.のためにスキャンHSVための信号陽性であった細胞のスクリーニングからの知見を代表するものであり、 球菌その後、二次追加の微生物共局在化シグナルの存在をスキャンした（カバースリップあたりの微生物信号あたり100個々の細胞）（1,000倍初期倍率;ニコン）。 （A - A4）C. アルビカンス （A2、挿入 、DAPI染色）HSV-1と共局在。 （B- B3）C.アルビカンスは 、HSV-2（B1、挿入 、Cは 。DAPI染色をアルビカンス ）と共局在します。平均±SEM;スケールバーは、すべてに適用されます。38は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| チューブ | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| メディア | F | F | ミズ | ミズ | F | ミズ | F | F | F | ミズ | ミズ | F | ミズ | F | ||
| A | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C言語 | ||||||||||||||||
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| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
表1。
複数菌相互作用における微生物の付着の一般的なテンプレートの決意 GT = カンジダ・アルビカンス発芽管表現型。 YF = C.アルビカンス酵母型表現型。 MSSA =メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌 ; MSは、媒体マンニトール塩を=。 F = Fungisel媒体。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
| プレート1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| のみHeLa細胞 | HeLa細胞+ GT | HeLa細胞+ YF | HeLa細胞+サ | HeLa細胞+ GT +サ | HeLa細胞+ YF +サ | |
| A | ||||||
| B | ||||||
| C言語 | ||||||
| D | ||||||
| プレート2 | ||||||
| HSV | HeLa細胞+ HSV | HSV + HeLa細胞+ GT > | HSV + HeLa細胞+ YF | HSV + HeLa細胞+サ | HSV + HeLa細胞+ GT +サ | HSV + HeLa細胞+ YF +サ |
| A | ||||||
| B | ||||||
| C言語 | ||||||
| D |
表2。
HSVに感染し、感染していないのHeLa細胞との複数菌の相互作用の視覚分析のための一般的なテンプレート GT = カンジダ・アルビカンス発芽管表現型。 YF = C.アルビカンス酵母型表現型。 SAは、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌を =。 HSVは、単純ヘルペスウイルスを=。ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "ターゲット=" _空白 ">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンスは、HeLa 229（HeLa細胞）の細胞38を感染させました。 HeLa細胞モデルシステムは、ユニークな利点を提供します。これは、両方のS.のための受容体として機能し、表面フィブロネクチン発現の欠如に起因していますaureusおよびC.アルビカンス 39-41。粘膜上皮の頂端42の表面は、通常より密接に自然感染と植民地化43-47で観察された模倣をフィブロネクチン、このシステムを欠いているので。したがって、我々はより直接的microbiomeの他のメンバーによって、その後の密着性における役割の特定のウイルスの侵入受容体の代謝回転の再生を検討することができます。
エントリ熟練非拡散HSV-1およびHSV-2を使用して、これらの発見は、HSV-1またはHSV-2の細胞侵入がSで超感染に対して不応性細胞をレンダリングすることを示します黄色ブドウ球菌は、C を向上させつつ、ウイルス濃度依存的にアルビカンスの順守（ 図4）。興味深いことに、YF対GTフォームのHSV-1の効果は、HSV-2、臨床プレゼンテーション48-51で膣カンジダ症の促進に大きな影響を与える可能性が発見のための測定とは逆でした。病原性の観点から、それは一般的にCのGT表現型と認められていますアルビカンス YF共生状態51-54で、病原型です。 C.の順守S.と共培養したアルビカンス GT YFについて測定と比較して黄色ブドウ球菌は 、HSVに感染したHeLa細胞への結合の変化したパターンを示した- S.黄色ブドウ球菌は、バインディング。 HSV-1はなく、SIGに、HeLa細胞にGTの付着を増強します上述したようにYFの遵守のために測定されたものよりもnificantly少ない程度に（p <0.05）、YFの付着およびGTの遵守のために190パーセントの制御のための、すなわち 、270パーセント制御。また、一方でS.黄色ブドウ球菌は、球菌がHSV-2の存在によって媒介される強化接着性を否定、結合GTのHSV-1の増強に影響を及ぼしませんでした。反転パターンは、Sについて観察されましたウイルス感染細胞とのYFの相互作用に関する球菌効果。 HSV-2（GT）対HSV-1によって異なる菌体のためのこの偏愛（YF）は、 生体内で共生状態の維持を指示する役割を果たしている可能性があります。 S上のGTフォームの効果に関して球菌結合、GTはほぼ完全にHeLa細胞へのブドウ球菌遵守のHSV-1阻害を廃止しました。対照的に、HSV-2に感染した細胞と会合するGTの能力を大幅にHSV-1、Sの存在下と比較して増加したものの黄色ブドウ球菌は、順守でHSV-2媒介性の増加を阻止しました。
Sをブロックするように表示されていることを決定することができました黄色ブドウ球菌は、S以来、相互作用を-cell 黄色ブドウ球菌は、非感染HeLa細胞のみに接着しました。さらに、細胞の顕微鏡検査は、 カンジダおよびHSV-1およびHSV-2共局在することを示します。この研究からの知見は、複数菌相互作用の研究のために、このモデルの有用性を示す定着にin vivoでの観察部位特異性を平行一緒にここで使用されます。
本明細書に記載されたプロトコルの有効活用は、種々の要因に依存しています。まず、スプレッド欠損ウイルスの使用。これは、クリーンなexaminaを可能にします効果ウイルスの侵入および細胞シグナル伝達の化は、前のセルを残すに取得を包むによる発生する可能性があります変化の合併症なしに、その後の微生物の相互作用にあります。また、欠陥のあるウイルスの使用は、バイオセイフティクラス二つの病原体の取り扱いのためのより安全な環境を可能にします。第二に、このプロトコルは、両方のウイルスおよび微生物付着変異体の使用を可能にします。のみ、特定の受容体に結合する変異体の使用は、微生物、または、新たな受容体の代わりに検出との間の共有受容体の描写を可能にします。受容体に対するモノクローナル抗体を使用することにより、そこに微生物の表面に付着局在の可視化の可能性があると変更されたアドヘシン発現を研究するためのツールを提供します。このプロトコルは、選択的に差動媒体上に分離できない微生物の研究には適していません。方法論はまた、ウイルス特異的タンパク質に対するモノクローナル抗体の利用可能性に依存しています。しかし本研究でnalysisは、問題の微生物は形態と大きさが似ている必要があり効果的な回避策となり酵母や細菌、示差蛍光タグ付けされたの使用、 例えばテキサスレッド、微生物特異的なモノクローナル抗体との間のサイズの差によって増強されました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
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