Abstract
Studiet av polymikrobiella interaktioner över taxonomiska riken som inkluderar svampar, bakterier och virus har inte tidigare undersökts med avseende på hur virus medlemmar i microbiome påverka efterföljande mikrob interaktioner med dessa virusinfekterade värdceller. Den samlevnad av virus med bakterier och svampar är huvudsakligen närvarande på slemhinneytor i munhålan och könsorgan. Slemhinneceller, särskilt de med ihållande kronisk eller ihållande latenta virusinfektioner, kan ha en betydande inverkan på medlemmarna i microbiome genom virus förändring i antal och typ av receptorer som uttrycks. Ändring i värdcellmembranet arkitektur skulle resultera i förändrad förmåga efterföljande medlemmar i normalfloran och opportunistiska patogener att inleda det första steget i biofilmbildning, dvs följsamhet. Denna studie beskriver en metod för kvantifiering och visuell undersökning av HSV påverkan på inledandet av biofilm bildning (vidhäftning) av S. aureus och C. albicans.
Introduction
Den mänskliga microbiome innehåller olika organismer från flera taxonomiska riken som delar geografiska regioner i kroppen. Anslutning till cellytor är ett viktigt första steg i biofilm formation, som är en del av microbiome kolonisering processen. Ingår i microbiome kan vara virus som orsakar kroniska och ihållande infektioner. Den kroniska cellinfektion av dessa virus kan orsaka en förändring i förmodade receptorn tillgänglighet. 1,2 Dessutom cell inträde av intracellulära patogener kan också påverka värd membran fluiditet / hydrofobicitet som i sin tur kan påverka fastsättning av andra microbiome medlemmar, inklusive bakterier och svampar . För att förstå det samspel som kan uppstå mellan dessa olika patogener som samar lokalisera i samma geografiska områden i mänskliga värden, måste vi kunna studera interaktionen av patogener som representerar hela spektrumet av taxonomiska riken närvarande vid slemhinneytan.
t "> Den Herpesviridae är en familj av mikrober som finns i 100% av människor som ständiga medlemmar av microbiome 3,4. Dessutom kan de också ständigt kasta både i närvaro och frånvaro av symtom. Specifikt, herpes simplex virus-1 och herpes simplex-virus-2 (HSV-1 och HSV-2, respektive) är permanenta medlemmar av microbiome i oronasopharynx och könsorgan. i immunkompetenta individer, både HSV-1 och HSV-2 orsakar gingivostomatitis, liksom genital herpes 5-8. vid dessa platser, HSV orsakar en latent infektion kännetecknas av kronisk ihållande asymtomatiska viral shedding 9. Införsel av HSV i celler resulterar i förändringar i ytan uttryck för nectins, heparansulfat, lipidaggregat och herpesvirus inträde medlare / tumörnekros factor receptor (HVEM / TNFr) 10-25. Dessa potentiellt representerar delade receptorer för vissa bakterier och svampar, t ex S. aureus och C. albicans, som medan opportunistiska patogener,kan också uppehålla sig som medlemmar av mucosal microbiome av oronasopharynx 26,27. Inom oronasopharynx S. aureus och C. albicans upptar två distinkta områden av kolonisering. I värdar med naturliga tänder, är den orala mukosan som delas av HSV-1 och C. albicans, medan de främre nasala näsborrarna upptas av S. aureus 28. Trots in vitro resultat som S. aureus ansluter sig till mun epitelceller, 29,30 S. aureus är sällan isoleras från muntliga prov när normal vävnad är närvarande 29,30. Lite är känt om könsorganen co-kolonisations nischer utöver de kliniska resultaten som S. aureus är förknippad med aerob vaginit, som kännetecknas av genital inflammation, utsläpp och dyspareuni, medan C. albicans producerar slemhinneskada som liknar den som observerades i munhålan 31-35. Även om dessa medlemmar av orala och genitala microbiOme tvär taxonomiska riken lite är känt om deras interaktion som den påverkar deras förmåga att initiera biofilm formation genom att ansluta sig till värdcellytan fem. Detta protokoll har faktiskt tillämpas för att fastställa de funktionella konsekvenserna av co-kolonisering / infektion.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV-stammar och hantering
Obs: Rekombinant icke-spridning HSV-1 (KOS) gL86 och HSV-2 (KOS) 333gJ - med beta-galaktosidas reporter aktivitet användes tillhandahölls av V. Twiari 36,37.
- Använda virus från en enda massa och förvara vid -80 ° C med en 1: 1 förhållande av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 20% fetalt bovint serum (FBS) och skumma mjölk fram till användning. Innan viral massa lagring, bestämma viruskoncentration av o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) och 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) -analys.
- Bestämma virus livskraft och mångfald av infektion (MOI) av X-Gal-färgning för varje experimentanalyskörning med användning av reporter virus inträde assay, såsom tidigare beskrivits (fig 1) 14.
- Späd virus (Opt-MEM) till önskad MOI. Fix monolager (paraformaldehyd, 0,5 ml / brunn) före färgning. Placera virus viabilitet kontroller i en separat microtiter plattan parallellt med polymikrobiella analysplattor.
2. HeLa 299 cellhanterings
- Växa vid 37 ° C, 5% CO2 i DMEM med 4,5 g / L glukos, 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), gentamicin (50 ug / ml) och L-glutamin. Passage celler vid 80% sammanflödet med trypsin lösning (etylendiamintetraättiksyra, 0,53 M EDTA, 0,05% trypsin, 5 ml / kolv).
3. C. albicans Hantering
Notera: C. albicans erhållna från ett kliniskt laboratorium källa lagras vid -80 ° C i Remmel skummjölk 2x medium.
- Kultur frysta lager på Sabouraud Dextros Medium (37 ° C). Efter 24 timmar subkultur C. albicans Onto Fungisel medium (37 ° C; 48 h) för användning.
- Generera groddar röret (GT) former (plocka representativa kolonier, 3 ml FBS, 3 tim, 37 ° C, Abs 600, 0,3). Efter inkubation, tvätta GT (HBSS, 2x, 4000 xg). Lägg tvättas GT till uppvärmd HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT former bör vara 99% av celler som observerats som bestäms av hemocytometer räkna.
- Gör jästform (YF) lager suspensioner genom att plocka representativa Fungisel kolonier (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Räkna antalet YF former / ml mikroskopiskt med användning av en hemocytometer. YF former bör vara 99% av celler som observerats som bestäms av hemocytometer räkna.
- Gör arbeta svamp lager (250 pl GT eller YF lager i 25 ml HBSS, 37 ° C, 10 5 CFU / ml)
4. S. aureus Hantering
- Store S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel skumma mjölk 2x). Kultur på fårblod-agar (5%; 37 ° C; 24 h). Plocka representativa kolonier och överföra till mannitol saltmedium inom 2 dagar för lager (37 ° C, 18 timmar).
- Göra S. aureus lager suspension (3 ml HBSS, 1,32 Abs 600, 10 8 CFU / ml)
- Gör arbeta S. aureus lager (100 plav beståndet i 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).
5. Candida och S. aureus Suspensioner
- Gör blandad C. albicans och S. aureus suspension (250 pl YF eller GT lager och 100 ^ S. aureus lager i 25 ml HBSS).
6. polymikrobiella Biofilm Assay
- Seed plattor med 96 brunnar med 200 | il av 2 x 10 5 HeLa-celler / ml (85% konfluens nivå). Bergplattor (30 - 45 min; 37 ° C) före inkubering (37 ° C; 5% CO2 inkubator; 18 h). Tvätta monolager (1x, Opt-MEM) sedan utsäde med HSV (HSV-1 (KOS) gL86 eller HSV-2 (KOS) 33 GJ - i 100 ^ Opt-MEM, MOI 50 och 10). Inkubera plattorna (3 h; 37 ° C; 5% CO2). Använd endast en virusstam per dag.
- Tvätta infekterade monoskikt (1x; fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Mg 2 och Ca 2; 100 | j, l). Ersätt PBS med varm HBSS lämnar 25 & #181; l i varje brunn.
- Lägg YF, GT och / eller S. aureus arbets suspensioner (100 pl, mål till cellförhållande = 5: 1, n = 16). såsom anges i tabell 1 Inkubera plattorna (statisk, 30 min, 37 ° C, 5% CO2).
- Efter inkubation, aspirera en kolumn i taget omedelbart återfyllning med 300 | il PBS med Mg 2 och Ca 2. Upprepa detta steg två gånger sedan lägga radio immunoprecipitation assay lysbuffert (RIPA, filtersteriliseras, 200 pl av en 1:50 utspädning).
- Snabbt mal sönder HeLa-cellysat placera sedan 50 pl på mannitol salter (MS) och / eller Fungisel (F) media (Figur 2). Sprida lysatet med användning av en glasstav böjd vid en 90 ° vinkel. Inkubera plattorna (18 h vid 37 ° C). Manuellt räkna antalet kolonier per platta. Kontroller består av S. aureus och / eller C. albicans anslutning till HSV-oinfekterade HeLa-celler.
7. Imaging studier </ P>
- Tvätta varje runda glastäck (12 mm, 50 ml aceton i 100 ml bägare). Torra och sterilisera täck (Kimwipes, glas petriskålar). Placera torra sterila täckglas i brunnarna på sterila plattor med 24 brunnar med alkohol flame steriliserade pincett.
- Lägga HeLa-celler (1 ml; 5x volym som används för plattor med 96 brunnar) till brunnarna i 24 brunnars plattor innehållande de tvättade sterila runda täckglas av glas. Tillsätt virus, bakterier och svampar enligt mallen (tabell 2) vid 5x volym används för 96 brunnar, sedan inkubera och process som beskrivs i steg 6.2.1 till 6,4 ovan.
- Efter den slutliga tvätten, fixera cellerna för mikroskopi genom att översvämma sliden med metanol och låta den avdunsta. Lagra plattorna vid RT tills färgning.
- För ljusfältsmikroskopi (1,000x slutlig ursprunglig förstoring) fylla brunnarna innehållande metanolfixerade täck med avjoniserat vatten. Omedelbart aspirera vatten. Täck varje täck med Grams kristallviolett. Tvätta täckglas fritt från icke-bundna fläck (avjoniserat vatten). Torra täck in situ fästa dem sedan med hård uppsättning monteringsmedium till en märkt slide (Figur 3).
- För fluorescensmikroskopi (100x mål, 1,000x slutlig ursprunglig förstoring) tvätta täck fri metanol i huvudsak såsom beskrivits i steg 7,4. Torka täckglas i brunnarna.
- Efter torkning, ta bort täckglas och placera dem på märkta bilder. Tillsätt sedan en tillräcklig mängd av 01:20 utspädning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad herpes simplex virus typ 1 + 2 gD-antikroppen för att täcka täckglas (1 - 5 | il).
- Inkubera objektglasen i en fuktkammare vid 37 ° C under 30 min. Efter inkubation, tvätta täckglasen i 4 byten av PBS.
- Efter den slutliga tvätten, tillbaka täckglas till den märkta bilden. Fläcken med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, fukt kammaren; 37 ° C under 30 min). Efter inkubation tvätta täck i 4 chanGES PBS, sedan fästa den märkta objektglas med hårt uppsättning monteringsmedium.
- Göra det möjligt för monteringsmedel för att härda under 24 timmar vid RT i mörker. Undersök täck under olje mål på antingen ett ljust fält mikroskop eller fluorescerande mikroskop med FITC och DAPI cutoff filter. Undersök bilder av åtminstone 50 fält (100 celler per organism minimum) för samlokalisering (Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nivån på robusthet av data kan erhållas från systemet som beskrivs i denna rapport visas i Figur 2 af 38. Genom att använda detta system moduleringen av stafylokocker och svamp interaktion med virusinfekterade celler och deras inverkan på varandras vidhäftning kan avgränsas. Dessa typer av studier kräver mikroskopisk undersökning av interaktionen, såsom visas i figurerna 3 och 4 38 för att avgöra huruvida den polymikrobiella interaktionen sker på samma celler. I denna studie interaktion differential cell observeras som en följd av HSV-modulering av stafylokocker och svamp vidhäftning som är virala artspecifik.
S. aureus och C. albicans (GT och YF) anslutit sig till samma HSV-infekterade HeLa-kontrollceller. Denna samlokalisering på celler tyder på en brist på fys ical slutledning med varandras HeLa cellvidhäftning, och att de uppmätta nivåerna av differentiell vidhäftning som uppmättes var sannolikt HSV-medierad (Figur 3A, A1) 38. Men på HSV-1 eller HSV-2 infekterade HeLa-celler ingen samlokalisering av stafylokocker och C. albicans observerades. (Figurerna 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Använda fluorescensmikroskopi (FITC-konjugerad anti-HSV-gD monoklonal antikropp) bekräftade vidare att S. aureus verkar inte samar lokalisera med C. albicans eller HSV-1 eller HSV-2 (figurerna 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Detta samarbete mellan HSV och Candida utvidgas till både jäst och köns rör former (figurerna 2A-F) av C. albicans. Denna specificitet för association mellan triad av mikrober återspeglar specificitet kolonisering sett på en mycket bredare skala i värd oronasopharynx slemhinna.
1 ">
Figur 1. X-gal-färgning Bilder av Dosering Dependent HSV-1 infektion i HeLa-celler. HeLa-celler infekterade med HSV-1 vid olika MOI och X-Gal färgade. (A) HeLa-celler i brunn i 96 brunnar med X-Gal färgade mock-infekterade HeLa cellkontroll; 20x initial förstoring; (B) HeLa-celler i brunn i 96-brunnsplatta med X-Gal färgade HeLa cell infekterad med HSV-1 vid en mångfald av infektion (MOI) på 10; 20x initial förstoring; (C) HeLa-celler i brunn i 96-brunnsplatta med X-Gal färgade HeLa cell infekterad med HSV-1 vid en mångfald av infektion (MOI) på 50; 20x initial förstoring; skala bar gäller för alla. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
filer / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Figur 2. Effekt av HSV-1 (fälten A, C, E) och HSV-2 (paneler B, D, F) vid multipliciteter av infektion (MOI) på 50 och 10 på Vidhäftning av S. aureus och / eller C. albicans till HeLa-celler. (A) S. aureus (Sa) bindning till HSV-1-infekterade celler i närvaro av C. albicans köns rör (GT) eller jästformer (YF); (B) S. aureus (Sa) bindning till HSV-2-infekterade celler i närvaro av C. albicans köns rör (GT) eller jästformer (YF); (C) C. albicans könsrören (GT) som binder till HSV-1-infekterade celler i närvaro av S. aureus (Sa), (D) C. albicans könsrören (GT) som binder till HSV-2-infekterade celler i närvaro av S. aureus (Sa); (E) C. albicans jäst former (YF) som binder till HSV-1-infekterade celler i närvaro av S. aureus (Sa); (F) C. albicans jäst former (YF) som binder till HSV-2-infekterade celler i närvaro av S. aureus (Sa). Alla datapunkter är Mean +/- SEM, n = 16 normaliserad till virusfria kontrollen. * = Signifikant skild (p <0,05) från oinfekterade HeLa cellkontroll. # = Signifikant skild (p <0,05) från parade punkt som anges av fästet; skala bar gäller för alla. 38 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Brist på S. aureus och C. albicans Interaktioner på HSV-1 och HSV-2-infekterade HeLa-celler. HSV-1 och HSV-2 infekterade (MOI 50) HeLa-cellmonoskikt med S. aureus och C. albicans (5: 1 målet till cell). För ljust fält mikroskopi, var cellmonoskikten färgades med Grams kristallviolett, undersöktes därefter med Ijusmikroskopi. Celler som var positiva för Candida eller S. aureus (100 enskilda celler per mikrob signal / per täck) var sekundärt skannas för närvaron av ytterligare mikrob samlokalisering signaler (1,000x initial förstoring). (A & A1) S. aureus (Sa) och C. albicans jästformer (YF) eller groddar röret bildar (GT) samlokalisering på oinfekterade HeLa-celler; (A2, infoga). Procent av HeLa-celler med samlokaliserade eller enskilda mikrober; (B - B3) Avsaknad av S.. aureus och C. albicans samlokalisering i närvaro av HSV-1; (C - C2) Brist på S. aureus och C. albicans samlokalisering i närvaro av HSV-2. Medelvärde ± SEM; skala bar gäller för alla. 38rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Brist på Co-lokalisering av S. aureus med C. albicans på HSV-1 eller HSV-2 infekterade HeLa-celler. HSV-infekterade HeLa-cellmonolager utmaning med S. aureus och C. albicans (5: 1 målet till cell) färgades (FITC-konjugerad anti HSV gD-antikroppen, och DAPI). Bilder är representativa för resultaten från screening av celler som var signal positivt för HSV sedan skannas för Candida och S. aureus (100 enskilda celler per mikrob signal per täck) som sedan sekundärt söks efter förekomsten av ytterligare mikrob samlokalisering signaler (1,000x initial förstoring, Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, infoga, DAPI färgning) samlokalisering med HSV-1; (B- B3) C. albicans samlokaliserade med HSV-2 (B1, infoga, C. albicans DAPI färgning). Medelvärde ± SEM; skala bar gäller för alla. 38 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| rör | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | YF | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| MEDIA | F | F | FRÖKEN | FRÖKEN | F | FRÖKEN | F | F | F | FRÖKEN | FRÖKEN | F | FRÖKEN | F | ||
| en | ||||||||||||||||
| B | ||||||||||||||||
| C | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| E | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| G | ||||||||||||||||
| H | ||||||||||||||||
Bord 1.
Allmän mall Fastställande av Microbial Anslutning i polymikrobiella Interaktioner GT = Candida albicans bakterie rör fenotyp. YF = C. albicans jäst formen fenotyp; MSSA = meticillin känslig Staphylococcus aureus; MS = mannitol saltmedium; F = Fungisel medium. Klicka god här för att ladda ner filen.
| Plate 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| endast HeLa-celler | HeLa + GT | HeLa + YF | HeLa + Sa | HeLa + GT + Sa | HeLa + YF + Sa | |
| en | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D | ||||||
| Plate 2 | ||||||
| HSV | HeLa-celler + HSV | HSV + HeLa + GT > | HSV + HeLa + YF | HSV + HeLa + Sa | HSV + HeLa + GT + Sa | HSV + HeLa + YF + Sa |
| en | ||||||
| B | ||||||
| C | ||||||
| D |
Tabell 2.
General Mall för visuell analys av polymikrobiella Interaktioner med HSV-infekterade och oinfekterade HeLa-celler GT = Candida albicans bakterie rör fenotyp. YF = C. albicans jäst formen fenotyp; SA = meticillin känslig Staphylococcus aureus; HSV = herpes simplex virus.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För närvarande ingen information finns tillgänglig på ett komplext samspel mellan permanent till halvpermanenta medlemmar i värd microbiome som korsar flera taxonomiska domäner, dvs prokaryota, eukaryota och virala. Därför har vi utvecklat en roman i modell vitro-system för att studera biofilm initiering av S. aureus och C. albicans på HSV-1 eller HSV-2 infekterade HeLa 229 (HeLa-celler) 38. HeLa cellmodellsystem presenterar en unik fördel. Detta beror på deras brist på ytan fibronektin uttryck, som fungerar som en receptor för både S. aureus och C. albicans 39-41. Eftersom den apikala 42 yta av slemhinnor epitel saknar normalt fibronektin, systemet närmare efterliknar som observerats i naturlig infektion och kolonisering 43-47. Således kan vi mer direkt undersöka den roll specifika viralt inträde receptor omsättning spelar i efterföljande vidhäftning av andra medlemmar i microbiome.
Med användning av ingångs skickliga icke sprider HSV-1 och HSV-2, dessa fynd visar att cellinträde av HSV-1 eller HSV-2 återger celler refraktära till superinfektion med S. aureus och samtidigt stärka C. albicans vidhäftning i en viruskoncentrationsberoende sätt (Figur 4). Intressant nog effekterna av HSV-1 på GT former vs. YF, var motsatsen till den som uppmätts för HSV-2, ett konstaterande som kan ha en betydande inverkan på främjandet av vaginal candidiasis i kliniska presentationer 48-51. Ur ett patogenes perspektiv, är det allmänt accepterat att GT fenotypen av C. albicans är den patogena formen, med YF den kommen tillståndet 51-54. Vidhäftning av C. albicans GT som co-inkuberades med S. aureus visade en förändrad mönster av bindning till HSV-infekterade HeLa-celler, jämfört med vad som uppmätts för YF - S. aureus-bindning. HSV-1 förbättrad vidhäftning av GT till HeLa-celler, men till en avseligt mindre utsträckning (p <0,05) än den som uppmätts för YF vidhäftning, såsom diskuterats ovan, det vill säga, 270% kontroll för YF vidhäftning och 190% kontroll för GT vidhäftning. Dessutom, medan S. aureus hade ingen effekt på HSV-1 förstärkning av GT-bindning, den coccus negeras den förbättrade vidhäftning förmedlad av närvaro av HSV-2. Det omvända mönstret observerades för S. aureus effekt på YF interaktion med virusinfekterade celler. Denna förkärlek för olika svamp former av HSV-1 (YF) vs. HSV-2 (GT) kan spela en roll styra underhåll av kommen tillstånd in vivo. När det gäller effekten av GT formen på S. aureus-bindning, GT avskaffade nästan helt HSV-1-hämning av stafylokock vidhäftning till HeLa-celler. I motsats, även om förmågan hos GT att associera med HSV-2 infekterade celler var signifikant ökad jämfört med HSV-1, närvaron av S. aureus blockerade HSV-2-medierad ökning av vidhäftning.
S. aureus -cell interaktion, eftersom S. aureus följs endast oinfekterade HeLa-celler. Vidare mikroskopisk undersökning av celler visar att Candida och HSV-1 och HSV-2 samlokaliserade. Används tillsammans här resultaten från denna studie parallell vivo observationer platsen specificitet för kolonisering indikerar användbarheten av denna modell för att studera polymikrobiella interaktioner.
Effektiv användning av det protokoll som beskrivs häri är beroende av en mångfald faktorer. För det första, användningen av spridnings deficient virus. Detta möjliggör en ren Examinaning av effekten viralt inträde och cellsignalering har på senare mikrobinteraktioner, utan komplikationen av förändringar som kan uppstå på grund av att omsluta förvärv innan de lämnar cellen. Dessutom, användning av defekt virus möjliggör en säkrare miljö för hantering av biosäkerhet klass två Pathogens. För det andra ger detta protokoll för användning av både virala och mikrober vidhäftnings varianter. Användning av varianter som bara binder till specifika receptorer tillåter avgränsning av delade receptorer mellan mikrober, eller alternativt att upptäcka nya receptorer. Genom användning av monoklonala antikroppar till receptorerna, finns det potential för visualisering av adhesin lokalisering på mikroben ytan och tillhandahåller ett verktyg för att studera förändrad adhesin uttryck. Detta protokoll är inte lämplig för studier av mikrober som inte selektivt kan isoleras på differentiell medium. Metodiken är också beroende av tillgången av monoklonal antikropp till virusspecifika proteiner. Även om enANALYS i denna studie har förbättrats genom storleksskillnaden mellan jäst och bakterier, användning av differentiellt fluorescerande taggade, t ex Texas röd, mikrob specifik monoklonal antikropp skulle vara ett effektivt arbete runt bör mikroberna i fråga vara av samma morfologi och storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
