Abstract
Изучение Полимикробные взаимодействий через таксономических царств, которые включают грибы, бактерии и вирусы не были ранее рассмотрены в отношении того, как вирусные члены микробиомом влияют на последующие микробные взаимодействия с этими инфицированных вирусом клеток-хозяев. Сожительства вируса с бактериями и грибами, главным образом присутствует на поверхности слизистой оболочки полости рта и половых путей. Слизистые клетки, особенно с постоянными хроническими или стойкими латентных вирусных инфекций, может оказать существенное влияние на членов микробиомом посредством вируса изменения в количестве и типе рецепторов, выраженных. Внесение изменений в архитектуре клетки - хозяина мембраны приведет к измененному способности последующих членов нормальной флоры и условно - патогенных микроорганизмов , чтобы инициировать первый шаг в формировании биопленки, т.е. присоединения. Это исследование описывает способ количественного и визуального изучения эффекта HSV на инициирование biofilформирование м (присоединение) из S. стафилококк и C. Albicans.
Introduction
Человек микробиомом включает в себя разнообразные организмы из различных таксономических царств, которые разделяют географические регионы в организме. Приверженность к поверхности клеток является важным первым шагом в формировании биопленки, которая является частью процесса микробиомом колонизации. Включенный в микробиомом могут быть вирусы, которые вызывают хронические и хронические инфекции. Хроническая инфекция клеток этими вирусами , может привести к изменению в мнимым доступности рецепторов. 1,2 Кроме того, проникновение в клетку путем внутриклеточных патогенов также может влиять на хост текучесть мембран / гидрофобность , которая в свою очередь может изменить прикрепление других членов микробиомом, в том числе бактерии и грибы , Для того, чтобы понять взаимодействия, которые могут возникнуть между этими несколькими патогенными микроорганизмами, которые совместно локализуются в одних и тех же географических регионах человеческого организма, мы должны иметь возможность изучать взаимодействие патогенных микроорганизмов, которые представляют спектр таксономических царств, присутствующих на поверхности слизистых оболочек.
т "> The Герпесвиридае семейство микробов , присутствующих в 100% людей в качестве постоянных членов микробиомом 3,4. Кроме того , они могут также быть постоянно пролил как в присутствии и в отсутствие симптомов. В частности, вируса простого герпеса-1 и вируса простого герпеса-2 (ВПГ-1 и ВПГ-2, соответственно) являются постоянными членами микробиомом в oronasopharynx и половых путей. в иммунокомпетентных лиц, как ВПГ-1 и ВПГ-2 вызывают гингивостоматит, а также генитальный герпес 5-8. на этих участках, ВПГ вызывает латентную инфекцию характеризуется хроническим персистирующим бессимптомным вирусовыделение 9. Вступление HSV в клетках приводит к изменениям в поверхностной экспрессии nectins, гепарансульфата, липидных плотах и герпесвирусов ввода посредника / некроза опухоли рецептор фактора (HVEM / TNFR) 10-25. Эти потенциально представляют собой общие рецепторы для некоторых бактерий и грибков, например , золотистого стафилококка и C. Albicans, которые в то время как условно - патогенными микроорганизмами,могут также находиться в качестве членов слизистого микробиомом из oronasopharynx 26,27. В oronasopharynx С. стафилококк и C. Albicans занимают две различные участки колонизации. В хостов с естественными зубами, слизистой оболочки полости рта разделяют HSV-1 и С. Albicans, в то время как передние носовые ноздри заняты S. стафилококк 28. Однако, несмотря на в пробирке выводы , что С. стафилококк прилипает ко рту эпителиальных клеток, 29,30 S. стафилококк нечасто изолирована от полости рта образцов при нормальной ткани присутствует 29,30. Мало что известно о половых путях со-колонизацию нишах , помимо клинических данных , что С. стафилококк связано с аэробного вагинита, характеризующийся воспалением половых органов, выделения и диспареунии, в то время как C. Albicans производит повреждения слизистой оболочки , аналогичные тому , что наблюдается в ротовой полости 31-35. Таким образом, хотя эти члены устного и генитального microbiекоторые крест таксономические царства мало известно об их взаимодействии , как это влияет на их способности инициировать образование биопленки за счет присоединения к поверхности клетки - хозяина 5. Этот протокол был эффективно применен для определения функциональных последствий совместного колонизации / инфекции.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HSV Штаммы и регулировать
Примечание: Рекомбинантный нерасплывающихся ВПГ-1 (KOS) gL86 и HSV-2 (нокаутов) 333gJ - с репортером активности бета-галактозидазы , используемой были предоставлены В. Twiari 36,37.
- Использование вируса из одной партии и хранят при -80 ° С в соотношении 1: 1 среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и не обезжиренного молока до использования. Перед вирусной хранения много, определяют концентрацию вируса с помощью о - нитрофенил-бета-D-галактопиранозида (ONPG) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозида (X-Gal) для анализа.
- Определение жизнеспособности вируса и множественности заражения (MOI) по X-Gal окрашивания для каждого экспериментального прогона анализа с использованием анализа проникновения вирусов репортер, как описано ранее (рисунок 1) 14.
- Развести вирус (Opt-MEM) до нужной МВД России. Fix монослоя (параформальдегид; 0,5 мл / лунку) перед окрашиванием. Поместите контроль жизнеспособности вируса в отдельном microtiтер пластины параллельно с Полимикробные планшеты для анализа.
2. HeLa 299 Cell Погрузочно-разгрузочные работы
- Расти при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в DMEM с 4,5 г / л глюкозы, 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС), гентамицин (50 мкг / мл) и L-глутамина. Пассаж клетки на 80% слияния с раствором трипсина (этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,53 М ЭДТА; 0,05% трипсина; 5 мл / колба).
3. С. Albicans Погрузочно - разгрузочные работы
Примечание: C. Albicans , полученные из клинической лаборатории источника хранят при -80 ° С в Remmel обезжиренного молока 2x среды.
- Культура замороженной на Сабуро декстроза (37 ° C). Через 24 часа субкультуры C. Albicans на среду Fungisel (37 ° С; 48 ч) для использования.
- Сформировать зародышевой трубку (GT) формы (выбрать репрезентативные колоний, FBS 3 мл, 3 ч, 37 ° C; Abs 600, 0.3). После инкубации, моют GT (HBSS; 2x; 4000 XG). Добавьте промытый GT к подогретой HBSS (37 &# 176; C; 0.32 Abs 600). GT формы должны быть 99% клеток, наблюдаемых как определено по количеству гемоцитометра.
- Сделать вид дрожжей (YF) маточные суспензии, подбирая репрезентативные Fungisel колоний (HBSS, 3 мл, 0,32 Abs 600). Подсчитайте количество YF форм / мл микроскопически с помощью гемоцитометра. YF формы должны быть 99% клеток, наблюдаемых как определено по количеству гемоцитометра.
- Сделайте работает грибковой запас (250 мкл GT или YF запаса в 25 мл HBSS; 37 ° C; 10 5 КОЕ / мл)
4. С. стафилококк Погрузочно - разгрузочные работы
- Магазин С. стафилококка ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel обезжиренного молока 2 раза). Культура на агаре с овечьей крови (5%; 37 & deg; С; 24 ч). Выберите представительные колонии и переносят в маннита солевую среду, в течение 2-х дней на складе (37 ° С; 18 ч).
- Сделать S. стафилококк сток подвеска (3 мл HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 КОЕ / мл)
- Совместная работа С. стафилококк акции (100 мклзапаса в 25 мл HBSS; 10 5 КОЕ / мл).
5. Кандида и S. стафилококк Суспензии
- Сделать смешанный C. Albicans и S. стафилококк суспензию (250 мкл YF или GT запасов и 100 мкл золотистого стафилококка запас в 25 мл HBSS).
6. Полимикробные биопленки Пробирной
- Семенной 96 - луночные планшеты с 200 мкл 2 х 10 5 HeLa клеток / мл (85%) уровень впадения. Рок пластины (30 - 45 мин; 37 ° С) до инкубации (37 ° C, 5% СО 2 инкубаторе; 18 ч). Вымойте монослоя (1x; Opt-MEM) , то Семя с HSV (ВПГ-1 (KOS) gL86 или HSV-2 (КОС) 33 ГДж - в 100 мкл Opt-MEM; MOI 50 и 10). Инкубируйте пластины (3 ч, 37 ° С, 5% СО 2). Используйте только один штамм вируса в день.
- Промыть зараженных монослоев (1x, фосфатно - солевой буфер (PBS) , с Mg + 2 и Са +2; 100 мкл). Заменить PBS с теплой HBSS оставив 25 & #181; л в каждую лунку.
- Добавить Ю.Ф., GT и / или S. Aureus рабочих суспензий (100 мкл, что мишень в соотношении клеток = 5: 1, N = 16). Как указано в таблице 1 Инкубируйте пластины (статические; 30 мин; 37 ° С, 5% СО 2).
- После инкубации аспирата один столбец в то время , немедленно заправку с 300 мкл PBS с Mg + 2 и Са +2. Повторите этот шаг дважды затем добавить радио-иммунопреципитация буфера для анализа лизиса (РИПО, стерилизовали через фильтр; 200 мкл 1:50 разведения).
- Быстро растирают клеточный лизат HeLa затем поместите 50 мкл на маннита солей (MS) и / Fungisel (F) средства массовой информации или (рисунок 2). Распространение лизата с использованием гнутого стекла стержня под углом 90 °. Инкубируйте пластин (18 ч при 37 ° С). Вручную подсчитывают количество колоний на чашку. Органы управления состоят из S. стафилококк и / или C. присоединение Albicans к HSV-неинфицированных клеток HeLa.
7. Исследования визуализации </ Р>
- Промыть каждый круглый покровного стекла (12 мм, 50 мл ацетона в 100 мл химический стакан). Сухие и стерилизовать покровные (Kimwipes; стеклянные чашки Петри). Поместите сухие стерильные покровные в лунки стерильных 24-луночные планшеты с алкоголем пламени стерилизованных пинцетом.
- Добавить клетки HeLa (1 мл; 5x объем используется для 96-луночных планшетов) в лунки 24-луночных планшетах, содержащих вымытые стерильные круглые покровные стекла. Добавьте вируса, бактерии и грибы , в соответствии с шаблоном (таблица 2) на скорости 5х Объем , используемый для 96 - луночные планшеты, а затем инкубировать и процесс , как описано в пунктах 6.2.1 до 6.4 выше.
- После последней промывки, фиксации клеток для микроскопии при затоплении слайд с метанолом и позволяя ей испариться. Храните пластины при комнатной температуре до окрашивания.
- Для светлой микроскопии (1,000x окончательное исходное увеличение) заполняют лунки, содержащие метанол фиксировали покровные деионизированной водой. Немедленно аспирация воды. Обложка каждого покровное с кристаллическим фиолетовым граммах, Вымойте покровные свободным от не связанного красителя (деионизированная вода). Сухие покровные в месте затем придерживаться их с монтажной средой с меченым слайде жесткий набор (рисунок 3).
- Для флуоресцентной микроскопии (100x цели; 1,000x окончательное исходное увеличение) мыть покровные свободный от метанола, по существу, как описано в пункте 7.4. Сухие покровные в лунках.
- После сушки, снимите крышку слипы и поместите их на меченых горками. Затем добавьте достаточное количество 1:20 разбавления флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -conjugated вируса простого герпеса типа 1 + 2 антитела Б-г, чтобы покрыть покровным (1 - 5 мкл).
- Инкубируйте слайдов в камере влажности при 37 ° С в течение 30 мин. После инкубации промойте покровные в 4-х изменений PBS.
- После последней промывки, возвращают покровное к меченым слайд. Пятно с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; камере влажности; 37 ° С в течение 30 мин). После инкубации промыть покровные в 4 чанGES ФБС, а затем прикрепить к меченым слайде с трудноизвлекаемыми установленной монтажной средой.
- Дайте гистологическая среда для отверждения в течение 24 ч при комнатной температуре в темноте. Изучите покровные по цели нефти на любом светлом поле микроскопа или флуоресцентного микроскопа с FITC и DAPI среза фильтров. Изучите фотографии , по крайней мере 50 полей (100 клеток на организм минимум) для совместной локализации (рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уровень надежности данных , полученных из системы , описанной в настоящем докладе показано на рисунке 2 аф 38. С помощью этой системы модуляции стафилококковой и грибковой взаимодействия с инфицированных вирусом клеток и их влияние на соблюдение друг друга может быть разграничены. Такого рода исследования требуют микроскопическое исследование взаимодействия , как показано на рисунках 3 и 4 на 38, чтобы определить , является ли полимикробными взаимодействие происходит на одних и тех же клетках. В этом исследовании взаимодействия различных клеток наблюдается в результате HSV-модуляции стафилококковой и грибковой присоединение что вирусный специфичны по видам.
С. стафилококк и С. Albicans (GT и YF) присоединились к тем же контрольными клетками HeLa HSV-неинфицированных. Эта совместная локализация на клетках указывает на отсутствие Phys скую умозаключение друг друга соблюдения HeLa клеток и того, что измеренные уровни дифференциального соблюдения измеренными, вероятно ВПГ-опосредованный (Фигура 3А, А1) 38. Тем не менее, при HSV-1 или HSV-2 не инфицированных клеток HeLa не совместной локализации стафилококков и C. Albicans наблюдалось. (Фиг.3В, В1, В2, В3, C1, C2). С помощью флуоресцентной микроскопии (FITC-конъюгированные анти-ВПГ-Б - жьей моноклональное антитело) также подтвердил , что С. стафилококк - видимому , не ко-локализуются с C. Albicans ни ВПГ-1 или ВПГ-2 (фиг.4А, А1, А2, А3, А4, В1, В2, В3). Это сотрудничество между HSV и кандида распространяется на обоих дрожжей и зародышевых форм трубки (рис 2A-F) С. Albicans. Эта специфика ассоциации между триады микробов отражает специфику колонизации видели в гораздо более широком масштабе в принимающей oronasopharynx слизистую оболочку.
1 ">
Рисунок 1. X-гал Окрашивание Фотографии Лекарственная Зависимая HSV-1 инфекции в клетках HeLa. HeLa клетки , инфицированные ВПГ-1 при различных MOI и X-Gal , окрашенном. (A) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal , окрашенном макете-инфицированных клеток HeLa контроля; 20x начальное увеличение; (Б) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal окрашенном HeLa клеток , инфицированных ВПГ-1 при множественности инфекции (MOI) 10; 20x начальное увеличение; (C) HeLa клеток в лунку 96 - луночного планшета с X-Gal окрашенном HeLa клеток , инфицированных ВПГ-1 при множественности инфекции (MOI) 50; 20x начальное увеличение; Шкалы относится ко всем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Файлы / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Влияние ВПГ-1 (панели A, C, E) и ВПГ-2 (панели B, D, F) при кратностей инфекции (MOI) 50 и 10 на прилипание S. стафилококк и / или C. Albicans к HeLa клеток. (A) S. стафилококк (Са) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии C. Albicans ростовых трубок (GT) или дрожжевые формы (YF); (В) С. стафилококк (Са) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии C. Albicans ростовых трубок (GT) или дрожжевые формы (YF); (С) С. Albicans ростовых трубок (GT) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa), (D) C. Albicans ростовых трубок (GT) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa); (Е) С. дрожжевые формы Albicans (YF) связывание с HSV-1 - инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa); (F) C. дрожжевые формы Albicans (YF) связывание с HSV 2-инфицированных клеток в присутствии S. стафилококк (Sa). Все точки данных среднее +/- SEM, п = 16 нормированы на безвирусного контроля. * = Значительно отличается (р <0,05) от неинфицированных контроля HeLa клеток. # = Значительно отличается (р <0,05) от парного точки, указанной кронштейном; Шкалы относится ко всем. 38 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Отсутствие S. стафилококк и C. Albicans взаимодействий на HSV-1 и HSV-2 инфицированных клеток HeLa. HSV-1 и HSV-2 инфицированных (MOI 50) монослоя клеток HeLa с S. стафилококк и C. Albicans (5: 1 мишень для ячейки). Для получения светлого поля микроскопия, клеточные монослои окрашивали кристаллическим фиолетовым по Граму, затем исследовали с помощью световой микроскопии. Клетки , которые были положительными для Candida или S. стафилококк (100 индивидуальных клеток на сигнал микроба / на покровное) были вторично сканируется на наличие дополнительных сигналов микроб совместной локализации (1,000x начальное увеличение). (A & A1) S. стафилококк (Sa) и C. дрожжевые формы Albicans (YF) или формы росток трубки (GT) совместно локализуются на неинфицированных клеток HeLa; (A2, вставить). Процент HeLa клеток с колокализуются или отдельных микробов; (B - B3) Отсутствие S.. стафилококк и C. Albicans совместная локализация в присутствии HSV-1; (C - C2) Отсутствие S. стафилококк и C. Albicans совместная локализация в присутствии HSV-2. Среднее значение ± SEM; Шкалы относится ко всем. 38rget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Отсутствие совместной локализации S. стафилококк с C. Albicans на HSV-1 или HSV-2 инфицированных клеток HeLa. HSV-инфицированных HeLa клеток монослоев вызов с S. стафилококк и C. Albicans (5: 1 мишень для клетки) окрашивают (FITC-конъюгированные анти ВПГ Б - г антитела, и DAPI). Фотографии являются репрезентативными результатами скрининга клеток , которые были положительный сигнал для HSV затем проверяется на Candida и S. стафилококк (100 индивидуальных клеток на микроба сигнала на покровное) , которые затем были вторично сканируемого на наличие дополнительных сигналов микроб совместной локализации (1,000x начальное увеличение; Nikon). (A - A4) C. Albicans (A2, вставка; DAPI окрашивание) совместно локализуется с HSV-1; (В- B3) C. Albicans колокализуются с HSV-2 (B1, вставка, C. Albicans DAPI окрашивание). Среднее значение ± SEM; Шкалы относится ко всем. 38 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||||||
| трубы | GT | Ю.Ф. | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | GT | Ю.Ф. | MSSA | GT / MSSA | YF / MSSA | ||||||
| СМИ | F | F | МИЗ | МИЗ | F | МИЗ | F | F | F | МИЗ | МИЗ | F | МИЗ | F | ||
| В | ||||||||||||||||
| С | ||||||||||||||||
| D | ||||||||||||||||
| Е | ||||||||||||||||
| F | ||||||||||||||||
| г | ||||||||||||||||
| ЧАС | ||||||||||||||||
Таблица 1.
Общие шаблона Определение микробной адгезии в Полимикробные взаимодействий GT = Кандида Albicans фенотип зародышевых трубки. YF = C. Albicans формы дрожжей фенотип; MSSA = метициллин чувствительного золотистого стафилококка; MS = маннитол соли среда; F = Fungisel среда. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
| пластина 1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| только HeLa клетки | HeLa + GT | HeLa + YF | HeLa + Sa | HeLa + GT + Sa | HeLa + YF + Sa | |
| В | ||||||
| С | ||||||
| D | ||||||
| пластина 2 | ||||||
| HSV | HeLa клетки + HSV | HSV + HeLa + GT > | HSV + HeLa + YF | HSV + HeLa + Sa | HSV + HeLa + GT + Sa | HSV + HeLa + YF + Sa |
| В | ||||||
| С | ||||||
| D |
Таблица 2.
Общие Шаблон для визуального анализа Полимикробные взаимодействий с HSV-инфицированных и неинфицированных клеток HeLa GT = Candida Albicans росток трубки фенотип. YF = C. Albicans формы дрожжей фенотип; SA = метициллин чувствительного золотистого стафилококка; HSV = вирус простого герпеса.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На данный момент информация не доступна на сложных взаимодействий между постоянными до полупостоянных членов принимающего микробиомом , которые пересекают несколько таксономических доменов, т.е. прокариот, эукариот и вирусные. Поэтому мы разработали роман в пробирке модельной системы для изучения инициации биопленки С. стафилококк и C. Albicans на HSV-1 или HSV-2 инфицированных HeLa 229 (HeLa) клеток 38. Модель системы HeLa клеток представляет собой уникальное преимущество. Это происходит из - за отсутствия экспрессии фибронектина поверхности, которая служит в качестве рецептора для обоих S. стафилококк и C. Albicans 39-41. Так как верхушечный 42 поверхность слизистых оболочек эпителий обычно не хватает фибронектин, эта система более тесно мимику , что наблюдаемые в естественной инфекции и колонизации 43-47. Таким образом, мы можем более непосредственно исследовать роль специфических играет вирусный оборот начального рецептора в последующем присоединения к нему других членов микробиомом,
Использование начального опытным нерасплывающихся HSV-1 и HSV-2, эти данные показывают , что вступление клеток ВПГ-1 или ВПГ-2 делает клетки невосприимчивыми к суперинфекции с S. стафилококк, при одновременном повышении C. соблюдение Albicans в концентрации вируса зависимым образом (рис 4). Интересно отметить , что влияние ВПГ-1 на GT формах против YF, был противоположен, измеренного для HSV-2, нахождения , которые могут оказать существенное влияние на продвижение вагинального кандидоза в клинических проявлениях 48-51. С точки зрения патогенеза, как правило , принято считать , что GT фенотип C. Albicans является патогенная форма, с YF комменсальной состояния 51-54. Приверженность С. Albicans GT , которые были совместно инкубировали с S. стафилококк показал измененную схему связывания с ВПГ-инфицированных клетках HeLa, по сравнению с измеренным для YF - С. связывание стафилококк. ВПГ-1 повышается приверженность GT к клеткам HeLa, но к сигчительно меньшей степени (р <0,05) , чем измеренная для соблюдения YF, как описано выше, то есть 270% контроль за соблюдением YF и контроля 190% для присоединения GT. Кроме того, в то время как С. стафилококк не оказывает никакого влияния на повышение HSV-1 связывания GT, то кокки сводит на нет повышенную приверженность опосредованного наличием ВПГ-2. Обратная картина наблюдалась для S. стафилококк влияние на YF взаимодействие с инфицированных вирусом клеток. Это пристрастие к различным грибковым форм ВПГ-1 (YF) против HSV-2 (GT) может играть роль направляющей поддержание комменсальной состояния в естественных условиях. Что касается эффекта формы GT на S. стафилококк связывания, то GT почти полностью отменили HSV-1 ингибирование стафилококковой присоединения к клеткам HeLa. В отличие от этого , хотя способность GT ассоциировать с HSV 2-инфицированных клеток была значительно увеличена по сравнению с HSV-1, присутствие S. стафилококк блокировали HSV-2 опосредованное увеличение приверженности.
S. стафилококк -клетки взаимодействие, так как S. стафилококк придерживалась исключительно неинфицированных клеток HeLa. Кроме того, микроскопическое исследование клеток показывают , что Кандида и ВПГ-1 и ВПГ-2 колокализуются. Используется вместе здесь результаты этого исследования параллельно естественных условиях наблюдений сайта специфичность для колонизации с указанием полезности этой модели для изучения Полимикробные взаимодействий.
Эффективное использование протокола, описанного в данном документе, зависит от множества факторов. Во-первых, использование дефицитного распространения вируса. Это дает чистый examinaние эффекта проникновения вируса и клеточной сигнализации имеет на последующих микробных взаимодействий, без усложнения изменений, которые могут произойти из-за обволакивают-приобретения до выхода из ячейки. Кроме того, использование неисправного вируса позволяет более безопасной среды для обработки биологической безопасности второго класса патогенам. Во-вторых, этот протокол позволяет использовать обоих вирусных и микробных вариантов прилипания. Использование вариантов, которые только связываются со специфическими рецепторами позволяет разграничение общих рецепторов между микробами, или, в качестве альтернативы обнаружения новых рецепторов. С помощью моноклональных антител к рецепторам, есть потенциал для визуализации локализации адгезина на поверхности микробной и предоставляет средство для изучения измененную экспрессию адгезина. Этот протокол не подходит для изучения микробов, которые не могут быть выборочно изолированы на дифференциальной среде. Методология также зависит от наличия моноклональных антител к вирус-специфических белков. Несмотря на то,нализ в этом исследовании , были расширены за счет разности размеров между дрожжей и бактерий, использование дифференцированно флуоресцентно помеченный, например , Texas Red, микроба специфическими моноклональными антителами будет эффективным обходным должны микробы в вопросе сходны по морфологии и размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma | 1397 | 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1x PBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100 x 15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150 x 15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100 x 13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12 mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
References
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
