Abstract
В исследовании на патогенезе вирусного энцефалита, метод инфекции имеет решающее значение. Первый из двух основных инфекционных путей в мозге является гематогенный путь, который включает в себя заражение эндотелиальных клеток и перицитов головного мозга. Во-вторых, интрацеребровентрикулярное (ICV) маршрут. После того, как в центральной нервной системе (ЦНС), вирусы могут распространяться на субарахноидальное пространство, мозговые оболочки и сосудистом сплетении через спинномозговую жидкость. В экспериментальных моделях, самые ранние этапы ЦНС вирусного распространения не хорошо охарактеризованы, и остается неясным, являются ли изначально заражены только определенные клетки. Здесь мы проанализировали распределение цитомегаловирус (ЦМВ) частиц во время острой фазы инфекции, называется первичной виремии после ICV или внутрисосудистого (IV) инъекции в неонатальном мозге мыши. В модели инъекции ICV, 5 мкл мышиного цитомегаловируса (MCMV) или флуоресцентные микросферы вводили в боковой желудочек в midpoiнт между ухом и глазом с помощью 10-мкл шприца с иглой 27 G. В модели инъекции IV, использовали 1 мл шприц с иглой 35 G. Трансиллюминаторе был использован для визуализации поверхностной височной (лица) вены у новорожденных мышей. Мы проникнуты 50 мкл MCMV или флуоресцентных микрогранул в поверхностной височной вены. Мозги были собраны в различные моменты времени после инъекции. MCMV геномы были обнаружены на месте с использованием метода гибридизации в. Флуоресцентные микросферы или зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующие рекомбинантные частицы MCMV наблюдались методом флуоресцентной микроскопии. Эти методы могут быть применены ко многим другим патогенам для исследования патогенеза энцефалита.
Introduction
При изучении вирусный энцефалит, начальное распределение вирусных частиц очень важно понять патогенез заболевания и выявить вирусные мишени в головном мозге. Большинство вирусов в размере от 20 до 300 нм, хотя Pandoravirus более чем 700 нм в размере 1. Распределение вирусных частиц в острой фазе инфекции может зависеть от размера частиц, распределение клеточных рецепторов или аффинности клеточных рецепторов на наличие вирусов. В моделях на животных, интрацеребровентрикулярное (ICV), внутрибрюшинного, прямой плацентарных, и внутривенно (IV), инфекций, были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. ICV-инокуляции вируса часто используется для установления центральной нервной системы (ЦНС), инфекции у мышей. Исследования с использованием этой методики сообщают широко распространенную инфекцию, в частности клеток в перивентрикулярных зонах и в областях мозга, в непосредственном контакте с цереброспинальной жидкости (CSF), similaг к воздействию вирусных ventriculoencephalitis. Небольшой размер аденоассоциированного вируса (AAV) частиц (20 - 25 нм в диаметре) , облегчает их распространение по всему мозгу в ICV инфекций 2-4. Внутрибрюшинные 5, прямой плацентарные 6, и IV инъекции 7 представляют собой кроветворения системное введение. Проникновение вирусных частиц через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) позволяет им достичь паренхимы головного мозга новорожденных, представляющий диффузные микроглии узелки 8,9.
Цитомегаловирус (ЦМВ) является распространенным вирусом, который принадлежит к семейства вирусов герпеса. В Соединенных Штатах, 50% - 80% людей имели ЦМВ-инфекции по возрасту 40. ЦМВ инфекции редко бывают вредны, но могут вызывать заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом и плода. Из всех поставок, 0,2% - 2% родились с ЦМВ 10, в результате чего тяжелые симптомы , такие как микроцефалия, перивентрикулярном кальцификации, гипоплазии мозжечка, MICRофтальмия и атрофия зрительного нерва 11,12. Кроме того, умственная отсталость, нейросенсорная потеря слуха, дефекты зрения, захват и эпилепсия встречаются примерно у 10% не фатально ЦМВ-инфицированных младенцев 13,14. дисфункция ЦНС является наиболее распространенным характерным симптомом ЦМВ врожденных аномалий. Больше детей навсегда остаются инвалидами каждый год врожденной ЦМВ , чем синдром Дауна, фетальный алкогольный синдром, или расщелины позвоночника 15. Есть нет прививки против ЦМВ доступны в настоящее время, призывая к необходимости безопасной и эффективной вакцины. Изучение взаимодействия частиц CMV с их рецепторами в ранней фазе инфекции важно понять эффект вакцинации.
Ventriculoencephalitis и диффузные микроглии узелки являются двумя основными патологическими характеристиками ЦМВ энцефалит 16. Это было неясно, каким образом частицы CMV (150 - 300 нм) распространяется через мозг в острой фазе инфекции Aе, как распределение клеточных рецепторов и их сродства к вирусам способствуют вирусного распространения. Kawasaki и др. Оценивали ICV и IV инфекции с точки зрения распределения частиц и их рецепторов (β1 интегрина) в самой ранней стадии инфекции. Мы обнаружили , что распространение частиц CMV и экспрессию & beta ; 1 - интегрином хорошо коррелируют в ранней фазе инфекции в обоих ICV и IV инфекции 8. ICV инфекция является моделью ventriculoencephalitis и IV инфекция представляет собой модель диффузного микроглии узелков. Изучение динамики вирусных или флуоресцентных частиц бы дать полезную информацию о влиянии размера частиц, вирусных взаимодействий с клеточными рецепторами, и механизм проникновения ГЭБ в головном мозге. Следующий протокол может быть использован для исследования любой вирусной инфекции и вирусного вектора в ЦНС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы были одобрены Animal Care комитета Хамамацу университета Медицинской школы путем.
1. Получение MCMV (Smith) и штамм рекомбинантного M32 с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) -MCMV
- Генерировать рекомбинантный М32-EGFP-MCMV в соответствии с методом следующим образом (1.2 - 1.9) и , как описано ранее 8.
- Использование рекомбинантных вирусов, полученных из штамма Смита дикого типа MCMV (номер доступа: U68299). Вставьте EGFP (4361 пар оснований; п.н.) между 37,089 и 41,450 п.н. (M32 - M31 локуса) в геноме MCMV путем гомологичной рекомбинации.
- Amplify с помощью полимеразной цепной реакции с MCMV M32 (41450 - 39286 пар оснований , левый фланговые последовательности и M31 (37089 - 39,246 б.п., правая фланкирующие ген последовательность локусов с использованием следующих праймеров: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(прямой праймер), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Обратный праймер), М31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (прямой праймер), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(обратный праймер).
- Вставьте локус M32 в вектор EGFP-выражения с использованием сайтов рестрикции NheI и BamHI. Вставьте локус M31 в M32-EGFP -recombinant плазмиду с использованием AflII и XbaI сайты. Сколите M32 - EGFP - последовательность M31 с NheI и AflII от M32 - EGFP - M31 рекомбинации плазмиды и растворяют в H 2 O.
- Трансфекцию сколотую конструкции в ядрах MCMV (Smith штамма) -infected NIH3T3 элементы 24 ч после заражения (HPI) с использованием системы электропорации для индукции гомологичной рекомбинации.
- В 3-х дней после инфицирования, со-культивирования клеток с неинфицированными мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) при соотношении 1/1000 в шесть-луночных планшетах и экран для EGFP-экспрессирующие очагов инфицированных клеток.
- Harveй вирус, содержащий супернатанты из лунок, содержащих зеленый флуоресцентный фокусы и разбавленные в десять раз. Для очистки выбрать скважин, которые показывают одиночные зеленые флуоресцирующие фокусы.
- Когда все фокусы в результате экспрессии EGFP дисплея инфекция предельного разбавления, препарат вируса является чистым, что указывает, что ни один вирус дикого типа не остается. Количественно вируса методом бляшек анализа , как было описано ранее 17.
- Лечить MCMV в сертифицированных шкафах биобезопасности на уровне биологической безопасности 2 в перчатках и маске.
- Прохождение MCMV (Смит штамм) и рекомбинантный MCMV в MEFs , приготовленных из 12-дневных эмбрионов мышей ICR , как описано ранее 17.
- Удалить клетки из супернатантов инфицированных MEF культур центрифугированием при 3000 х г в течение 20 мин при 16 ° С.
- Ультрацентрифуга супернатанты течение 40 мин при 70000 × г. Ресуспендируют гранулы, содержащие вирионов в 1 мл Трис-забуференного солевого раствора и переносят на предварительно линейной Sorbitol градиент (25% - 70%). Ультрацентрифуга снова при 70000 х г в течение 60 мин 18.
- Урожай вириона, содержащего группу с помощью шприца. Гранул заготовленные вирионов дополнительной стадией ультрацентрифугированием при 70000 х г в течение 40 мин.
- не Ресуспендируют осадок в 1 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и хранят при -80 ° С до экспериментов инфекции.
- Количественно титра вируса методом бляшек анализа , как было описано ранее 19.
- Визуализируйте экспрессию EGFP рекомбинантных частиц MCMV (возбуждение при 489 нм, излучение на 508 нм) методом флуоресцентной микроскопии (рис 1А) и структуры частиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 8 (рис 1б).
2. Подготовка Nile красный флуоресцентный микрошариков
- Покупка карбоксильную флуоресцентный Нил красный микросферы и поместите 500 мкл микрошариков в пробирки по диаметру (0,04- 0,06 мкм, приблизительно 3,63 × 10 12 частиц; 0,1 - 0,3 мкм, примерно 5,75 × 10 10 частиц; и 1,7 - 2,2 мкм, приблизительно 6,85 × 10 7 частиц).
- Treat бусинки с 500 мкл 0,1 М NaOH в течение примерно 1 день, чтобы удалить любые эндотоксинов и ресуспендирования бусин в стерильной воде при комнатной температуре.
- Адсорбировать бусин O / N с добавлением 10% сыворотки мышей, полученной от мышей C57BL / 6, при комнатной температуре перед использованием.
- Отделить агрегаты, вихревые шарики и тщательно разрушать ультразвуком перед использованием.
3. ICV инъекция MCMV и флуоресцентных микрогранул в неонатальных мышей
- Поддержание нормальных беременных мышей ICR в контролируемой температурой объекта при 12-часовом цикле свет / темнота. Новорожденные обозначены как P 0,5 в день рождения.
- Стерилизовать 10-мкл шприц и иглу 27 G с 70% -ным спиртом.
- Загрузите раствора для инъекций (5 мкл), содержащий MCMV или флуоресцентного микро-бусинки в иглу, осторожно потянув за поршень шприца.
- Сдерживать неонатальной мыши (P 0.5), положив мышь на льду в течение 3 - 4 мин. После того, как животное находится под наркозом, используйте метод ответа схождение ущипнуть, чтобы определить глубину анестезии.
- Отметьте место инъекции с нетоксичным лабораторной ручкой в месте , приблизительно 0,7 - 1,0 мм сбоку от стреловидного шва и 0,7 - 1,0 мм каудально от неонатального темени (рис 2А).
- Вставьте иглу глубоко 2 мм, перпендикулярно к поверхности черепа в отмеченном месте инъекции. Для справки, отметьте 2 мм от кончика иглы с нетоксичным мейкера.
- Медленно вводят по 5 мкл MCMV (примерно 5 × 10 5 БОЕ) , в боковой желудочек , не открывая кожу головы (Фигура 2В).
- В другой группе мышей, вводят по 5 мкл раствора, содержащего флуоресцентные микрошарики (0,1 - 0,3 мкм, примерно 5,75 × 10 8 - частицы)тот же метод.
- Медленно снимите иглу 10 - 20 секунд после прекращения движения плунжера для предотвращения обратного потока.
- Для того, чтобы восстановить, сохранить мышей в течение 5 - 10 мин в теплом контейнере до движения и общая отзывчивость не будут восстановлены.
- Заготавливают мозги, как описано в разделе 5 в диапазоне моментов времени (3, 12, 24, 48 и 72 ч) после инъекции.
4. IV инъекция MCMV или флуоресцентных микрогранул в неонатальных мышей
- Сдерживать неонатальной мыши (P 0.5), положив мышь на льду в течение 3 - 4 мин.
- С помощью 1 мл шприц с иглой 35 G, чтобы выполнить внутривенную инъекцию MCMV в P 0,5 новорожденные.
- Используйте просвечивания (вена видоискатель) для визуализации поверхностной височной (лица) вены. Перед инъекцией, обеспечить новорожденного к просвечивания с использованием хирургической ленты (рис 2С).
- Во время ношения увеличительного стекла (1.5x), медленно влить 50 мкл MCMV (приблизительно 5,45 ×; 10 9 частиц) или флуоресцентные микросферы (0,04 - 0,06 мкм, приблизительно 3,63 × 10 11 частиц; 0,1 - 0,3 мкм, примерно 5,75 × 10 9 частиц, а 1,7 - 2,2 мкм, приблизительно 6,85 × 10 6 частиц) в поверхностной височной вены (Рисунок 2D).
- После удаления иглы, используйте марлю, содержащий 70% спирта, чтобы оказать давление на месте инъекции, пока кровотечение не прекратится.
- Дайте новорожденному примерно 5 мин в теплой контейнер, чтобы восстановиться перед возвращением его в клетку.
- Заготавливают мозги, как описано в разделе 5 в диапазоне моментов времени (3, 12, 24 и 72 ч) после инъекции.
5. ткани мозга Подготовка образцов для парафиновых срезов
- Поместите инъекционные новорожденные в небольшом пластиковом блюде на колотый лед.
- После того, как животное находится под наркозом, используйте метод ответа схождение ущипнуть, чтобы определить глубину anesthesНМА.
- Сделайте один или два центральных конца горизонтальные концевые разрезы через грудную клетку, чтобы открыть грудной полости.
- Сделайте разрез в атриум с острыми ножницами. Настаивать раствор 4% параформальдегида (PFA) в предсердии. Стоп перфузию при наблюдении спонтанное движение (PFA танец) и облегченный цвета печени. Не обескровить.
- Рассеките новорожденного (как описано ранее 20), сняв головку с помощью ножниц.
- Сделайте срединный разрез вдоль покровы от шеи к носу, чтобы выставить череп.
- Поместите острый конец пары ириса ножниц в затылочного отверстия с одной стороны, осторожно скольжения вдоль внутренней поверхности черепа.
- Сделайте разрез, проходящий к дальнему краю задней поверхности черепа, и сделать одинаковый разрез на противоположной стороне. Расчищают череп вокруг мозжечка.
- Осторожно отогните череп на одной стороне, чтобы предотвратить повреждение мозга. Повторите эту операциюПроцедура с другой стороны мозга.
- С помощью шпателя, разъединить обонятельные луковицы и нервные связи вдоль вентральной поверхности мозга.
- Аккуратно отделить мозг от головы, обрезка любой твердой мозговой оболочки, которая до сих пор подключить мозг к черепу с помощью ножниц, и извлечь мозг.
- Поместите мозг в пузырек закрепителя, содержащего 4% PFA, по крайней мере в 10 раз превышает объем мозга в течение 24 ч при 4 ° С.
- Обезвоживает ткани через серию градуированных этанола ванны для вытеснения воды, а затем пропитать парафином, образуя блок. Вырезать блок парафина с микротомом на срезы толщиной 4 мкм 21.
- Deparaffinize и регидрировать слайды инфицированных мозга 22. Перейдите к гибридизация для парафином.
6. Мозговая ткань Подготовка образцов для замороженных срезов
- Удалите мозг, следуя инструкциям, изложенным в 5.1 - 5.11.
- Для наблюдения флуоресцентных микрогранул и М32-EGFP-MCMV, поместите резецировали мозг на плоскодонных cryomolds. Добавить вложение среды, чтобы полностью покрыть образец мозга. Мгновенного замораживания cryomolds в предварительно охлажденный н - гексан (-80 ° C), с помощью щипцов для удержания краю cryomolds до присоединения его к патроне.
- Для секционирования, прикрепить блок замороженной ткани на предварительно охлажденному криостата патроне. Перенести замороженной ткани с патроном в криостат камеру и понизить температуру до от -10 до -20 ° С, и нарезать ломтиками примерно 8 - 10 мкм толщиной 23.
- Закрепить секции с cytofixative (смеси изопропилового спирта и полиэтиленгликоля) опрыскиванием. Воздух сухой секции в течение 30 мин при комнатной температуре сразу же после того, как опрыскивание, и хранить их при температуре - 80 ° С до дальнейшего использования.
- Равновесие разделы обратно до комнатной температуры и мыть три раза PBS.
- Пятно участки с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -conjugated Griffonia Simplicifolia isolectin B4 в концентрации 1: 100 в течение 10 мин в PBS при комнатной температуре (рис 5) или с PE-конъюгированным антителом CD31 в концентрации 1: 100 в течение 30 мин в PBS при комнатной температуре (рис 6).
- Промыть участки с PBS три раза.
- После промывки, испачкать секции с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации клеточных ядер. Установите разделы в анти-выцветанию реагента и DAPI изображения (возбуждение при 345 нм, эмиссия при 455 нм), EGFP (возбуждение при 489 нм, эмиссия при 508 нм), и Нил красный (возбуждение при 553 нм, эмиссия при 637 нм) с флуоресцентным микроскопом (Рисунки 3, 5, 6).
7. флуоресцентная in - situ гибридизация (FISH) для парафином
- Подготовьте FISH зонда , меченного непосредственно с флуорофором для ДНК гибридизация ник - трансляцией с использованием бактериальной искусственной хромосомы , содержащей весь ген ДНК MCMVОме (pSM3fr) 19. Концентрация FISH зонда составляет 0,1 мкг / мкл.
- Deparaffinize и регидрировать слайды инфицированных мозга 22.
- Обработать срезы ткани РНКазой (100 мкг / мл в PBS) для обнаружения вирусной ДНК.
- Выполнить поиск антигена с 0,05% NP40 в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) при температуре 95 - 98 ° С в течение 20 мин. Охлаждают скользит вниз до комнатной температуры в течение 20 мин.
- В сосуд для окрашивания стекла Коплин, мыть слайды в чистой воде три раза в течение 2 мин каждый раз. Выполнить дополнительный шаг извлечения антигена с 0,06% пепсина а, 0,01 н раствора HCl в течение 5 мин при 37 ° С.
- Полоскание слайды три раза в чистой воде в течение 2 мин каждый раз в сосуд для окрашивания стекла Коплин.
- Обезвоживают срезах тканей снова путем переноса слайдов из 70% этанола, до 85% этанола, а затем до 100% этанола.
- Для приготовления 10 мл буфера для гибридизации, смешайте 1,25 мл гибридизация солей (3 М NaCl, 100 мМ Трис в-HCl РН 8,0, 100 мМ фосфат натрия , рН 6,8, 50 мМ ЭДТА) с 5 мл деионизованной формамид, 2,5 мл 50% Декстрансульфат, 250 мкл 50х раствора Денхардта, 125 мкл 100 мг / мл т - РНК, и 875 мкл H 2 O.
- Развести ДНК-зонд, непосредственно мечено флуорофоров, которые распознают весь геном MCMV случайным образом в буфере для гибридизации. Конечный объем должен быть 10 мкл (7 мкл буфера гибридизации, 1 мкл зонда (0,1 мкг / мкл) и 2 мкл дистиллированной воды).
- Добавить зонд смеси (10 мкл) для каждого слайда и накрыть покровным (15 × 15 мм). Уплотнение покровное с резиновым клеем. Денатурации смеси зонда в течение 5 мин при 85 ° C, и завершают этап гибридизация o / n при 42 ° С.
- Вымойте слайды с 0,3% NP40, 0.4x SSC при 73 ° С в течение 2 мин; с 0,1% NP40, 0.4x SSC при 73 ° С в течение 1 мин; и с 2х SSC дважды.
- Контрастное ядер с DAPI (10 нг / мл) и покрывают слайд с покровным.
- горасекции в анти-выцветания реагента и изображения DAPI (возбуждение при 345 нм, эмиссия при 455 нм) и EGFP (возбуждение при 489 нм, эмиссия при 508 нм) с помощью флуоресцентного микроскопа (рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В исследованиях на патогенезе вирусного энцефалита, метод инфекции важно. Гематогенный путь представляет собой острую инфекцию эндотелиальных клеток и перицитов головного мозга, в то время как маршрут ICV представляет собой острую инфекцию распространяется через CSF через субарахноидальное пространство, достигая к мозговым оболочкам и сосудистом сплетении. Для анализа первого распределения частиц при остром энцефалите, гибридизация в выявлении геномы MCMV и непосредственное наблюдение частиц М32-EGFP-MCMV или флуоресцентных микрогранул были использованы.
Генерация рекомбинантного MCMV (М32-EGFP-MCMV)
Протокол показывает, как рекомбинантный M32-GFP-MCMV был создан. EGFP встраивали между 37,089 и 41,450 BP (М32-М31) локуса в геноме MCMV путем гомологичной рекомбинации. EGFP рrotein был слит с вирусным белком (М32) и выражалось EGFP в вирусные частицы. После гомологичной рекомбинации, препарат вируса считается чистым, если все фокусы в результате предельного разбавления инфекции отображается выражение EGFP, что указывает, что ни один вирус дикого типа не осталось. Может потребоваться несколько процедур разбавления для очистки рекомбинантного вируса. На рисунке 1А показывает EGFP сигналы очищенного рекомбинантного MCMV (М32-EGFP-MCMV) и фигуре 1В показана ТЕМ изображение частиц М32-EGFP-MCMV , содержащих геном вируса в вирусном ядре ,
Интрацеребровентрикулярное Injection и внутрисосудистого
На рисунке 2 показано , инъекционной участки у новорожденных мышей (P 0.5) , где вирус или микрогранулы инъецировали через маршрут ICV или маршрут IV. В ICV, место инъекции находится в средней точке междууха и глаза, в месте , приблизительно 0,7 - 1,0 мм сбоку от стреловидного шва и 0,7 - 1,0 мм каудально от новорожденных темени (рис 2А). Игла должна быть введена в боковой желудочек глубокие 2 мм, перпендикулярно к поверхности черепа (Фигура 2В). На рис 2С и 2D показывают , что последовательность MCMV или микрогранулы вводят в височную вену лицевого неонатальных мышей. Трансиллюминаторе и увеличительные стекла являются полезными инструментами, чтобы четко визуализировать мелкие вены.
Распределение вирусных частиц / геномов и флуоресцентных микрогранул
На следующих рисунках показано распределение вирусных частиц / геномов и флуоресцентных микрогранул в острой фазе. На рисунке 3 показана Microbead сигналы замороженных срезов мозга. Рисунок 3A и 3B показываютраспределение 0,1 -. 0,3 мкм флуоресцентных Нила красными микрогранул в краевой области (MA) (рис 3А) и сосудистом сплетении и субвентрикулярной зоны (SVZ) (рис 3B) в 2 ч после инъекции ICV Рисунок 3C и 3D показывают распределение из 0,1 - 0,3 мкм флуоресцентных Нила красными микрогранул в МА и сосудистой области (рис 3C) и сосудистом сплетении и СВЗ (рис 3D) в 2 ч после инъекции IV. Вполне вероятно, что после ICV и IV инъекции, частицы не сразу распространяться равномерно по всей паренхимы. Скорее всего, они остались в СВЗ, штат Массачусетс, и сосудистой области в острой фазе инфекции. Размер частиц является основным фактором , влияющим на их распределение в головном мозге в острой фазе следующего ICV и IV инъекции. Рисунок 4 показывает РЫБУ генома MCMV на парафиновых срезах мозга. MCMV геном (зеленые пятна) был обнаружен вСВЗ в 3 ч после инъекции ICV (4В). Геномы MCMV (зеленые пятна) были обнаружены в МА и сосудистой области в 3 ч после IV инъекции (рис 4в). Распределение MCMV (рисунок 4) и микрогранул (рисунок 3) были очень похожи. На рисунке 5 показаны зависящие от размера картины распределения микрогранул в замороженных срезов головного мозга после инъекции IV. Microbeads с диаметром 1,7 - 2,2 мкм (рис 5B), 0,1 - 0,3 мкм (рис 5D), и 0,04 - 0,06 мкм (рис 5д) показаны соответственно. Более мелкие микросферы имели тенденцию быть излившейся из сосудов зоны в паренхиме. На рисунке 6 показано распределение частиц М32-EGFP-MCMV в замороженном отделах головного мозга. GFP точечные сигналы (частицы М32-EGFP-MCMV) были в основном наблюдались в МА (6А) и сосудистом сплетении и СВЗ (
Рисунок 1:. Генерация частиц рекомбинантного M32-EGFP-MCMV (А) ультрацентрифуге М32-EGFP-MCMV рассматриваются как зеленые пятна с помощью флуоресцентной микроскопии. Шкала бар:. 2,4 мкм (В) просвечивающей электронной микроскопии показало , что частицы М32-EGFP-MCMV обладают типичной структурой вируса. Шкала бар: 77 нм.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Инъекции сайтов неонатального мыши. (А, В) ICV - инъекции 5 мкл MCMV (примерно 5 × 10 5 БОЕ) или 5 мкл микрошариков (приблизительно 5,75 × 10 9 частиц). (А) месте инъекции в средней точке между ухом и глазом (при расположение приблизительно 0,7 - 1,0 мм сбоку от стреловидного шва и 0,7 -. 1,0 мм каудально от новорожденных темени) (в) 27 G игла с 10-мкл шприца используется для инъекции в боковой желудочек глубиной 2 мм, перпендикулярно к поверхности черепа. (с, D) MCMV или микрогранулы вводят в височной лицевой вены неонатальных мышей. (с) (D) 1-мл шприц с иглой 35 G используется для выполнения внутривенной инъекции MCMV. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 3: Визуализация флуоресцентных Найл Ред микрогранул в мозге (A, B) 0,1 - 0,3 мкм флуоресцентные Nile красные микрошариков сигналы (красный) наблюдаются в МА (А) и сосудистом сплетении и СВЗ (B) в 2 ч сообщение ICV инъекции (C, D) 0,1 -. 0,3 мкм флуоресцентные Нил красные микросферы , введенные в неонатальном мозге мышей путем инъекции IV в 2 ч после инъекции. Нил красные микросферы наблюдаются в гое МА и сосудистая область (С) и сосудистое сплетение и СВЗ (D). Белый квадрат увеличивается в увеличенном вставке в верхнем правом углу (D) (A, C) Шкала бар:. 50 мкм (B, D) Шкала бар:. 150 мкм. Стрелки указывают Нила красные микрогранулы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: MCMV Геном распространения в головном мозге мышей После ICV инъекций и IV инъекций (А) вид снизу увеличения.. Белый квадрат показывает , где был захвачен увеличенное изображение (B). (В) MCMV геном (зеленые пятна) впервые обнаружен в СВЗ в 3 ч после инъекции ICV. DAPI (4 ';, 6-диамидино-2-фенилиндол) используется для ядерной кислоты (ядерной) окрашивания. Шкала бар:. 30 мкм (C) MCMV геном (зеленые пятна) обнаруживается в области сосудистой оболочки и ткани в 12 ч после инъекции IV. DAPI используется для окрашивания ядерной кислоты. Шкала бар: 30 мкм. Стрелки указывают представительный MCMV геном (зеленые пятна). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Взаимосвязь между диаметром микрогранул и распределение микрошариков Флуоресцентные Nile красный микросферы (50 мкл) вводят в неонатальном мозге мышей путем инъекции IV. В замороженных срезов готовили 2 ч после инъекции, Нил красные сигналы (красный, обозначенные стрелками) наблюдаются и вокруг vasculА.Р. площадь паренхимы. Сосудистый область окрашивали флуоресцентным лектина (зеленый) (A, B) 1,7 -.. 2,2 мкм микрогранул (А) вид снизу увеличения. Белый квадрат показывает , где был захвачен увеличенное изображение (B) (B) белый квадрат увеличивается в расширенной вставки в верхнем правом углу (B) (C, D) 0.1 -... 0,3 мкм микросферы (C) вид снизу увеличения. Белый квадрат показывает , где был захвачен увеличенное изображение (D) (D) белый квадрат увеличивается в расширенной вставки в верхнем правом углу (D) (E, F) 0.04 -... 0,06 мкм микросферы (E) вид снизу увеличения. Белый квадрат показывает , где был захвачен увеличенное изображение (F). (F) белый квадрат увеличивается в расширенной вставки в верхнем правом углу
Рисунок 6: Наблюдение вирусных частиц в фазе инфекции острого. (А, В) , EGFP точечные сигналы (частицы М32-EGFP-MCMV) в основном наблюдаются в ОЭ (указаны стрелками; А), сосудистом сплетении, и СВЗ (показано стрелками, б) при 2 ч после инъекции ICV. Белые квадраты увеличиваются , как увеличенные вставки в верхнем правом углу (А) и (В). Шкала бар:. 20 мкм (C, D) через 3 ч после инъекции IV, частицы MCMV (зеленый, обозначенные стрелками) находятся внутри и снаружи сосудистой областипаренхима (С), сосудистом сплетении, и СВЗ (D) (красный: CD31-позитивные клетки). Белые квадраты увеличиваются , как увеличенные вставки в верхнем правом углу (C) и (D). Шкала бар:. 20 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В моделях животных, ICV, внутрибрюшинного, прямой плацентарного и IV инфекций были использованы для изучения патогенеза вирусного энцефалита. Мы сосредоточили свое внимание на модели ICV и IV инъекций у новорожденных мышей для простоты процедур и в пользу непосредственного впрыска частиц в целевой области. Хотя внутрибрюшинного инфекция является простой способ, вирусные частицы распространяются системно посредством косвенного процесса 5,24. Прямая плацентарная инфекция является хорошим методом для изучения эмбриональных системной инфекции. Тем не менее, этот метод требует специальной подготовки для получения стабильных результатов и имеет низкий уровень успеха. Метод инфекции также косвенный процесс через плаценту и трудно контролировать количество инъекций в плод при каждом испытании 6. По мере того как неонатальный мышь очень восприимчивы к вирусов, таких как CMV, в данном исследовании мы могли бы сравнить распределение вирусных частиц и что инфицированных клеток на самых ранних ПГАе инфекции. Модель инъекции ICV является полезным для изучения поведения инфекция , которая обходит ГЭБ 25, в то время как модель инфекция IV является системной модели инфекции , напоминающие естественную инфекцию в том числе при взаимодействии вируса с ВВВ.
С помощью метода впрыска ICV, мы убедились, чтобы проникнуть по крайней мере, на 2 мм вглубь черепа. Игла хранится внутри желудочков головного мозга в течение приблизительно 10 - 20 секунд для предотвращения обратного потока из желудочков 26. Когда все сделано аккуратно, ICV инъекции является быстрый и простой в методе естественных условиях. Тем не менее, иногда неточные инъекции, включая нежелательные обратного потока или глубокого проникновения / неглубокой иглы в мозг может произойти. Тщательные процедуры и наблюдения после инъекции необходимы для выполнения этого протокола успешно. Учитывая ошибки впрыска, мы сосредоточились только на моделях распределения частиц, а не по количеству, а не наблюдали эффекты лечения лекарственного средстваs или функциональные антитела в нашем исследовании.
Есть несколько способов для выполнения мышиный неонатальной инъекции IV, через несколько сайтов, таких как поверхностных височных вен, наружной яремной вены, и ретро-орбитальной пазухи. Поверхностной височной вены новорожденному легко визуализируется с помощью просвечивания и увеличения линзы. Инъекция может быть укомплектован одним опытным человеком с большим успехом rate.We выбрал поверхностной височной вены в качестве места проведения IV инъекции. Метод инъекции IV требует определенной подготовки, таких как позиционирование неонатальной мыши и процедуру инъекции. Глава неонатальной мыши должен быть установлен с лентой для временной вены, чтобы быть на вершине и плоской. 35 G игла должна быть вставлена в сосуд достаточно далеко, что кончик иглы полностью окружен судна. Трансиллюминаторе и увеличительные стекла являются полезными инструментами, чтобы четко визуализировать мелкие вены. Введение больших объемов до 100мкл следует настаивать медленно, чтобы подтвердить поток содержимого. В случае выхода из строя инъекции на первом испытании, с другой стороны височной вены доступен для другого исследования. После инъекции, щенками испытывают минимальный стресс и быстро восстанавливаться. Не понятно, почему в среднем один из 20-ти щенкам испытывают страдания и крупный не восстанавливаются. Тем не менее, низкая частота возникновения этого события минимально повреждает весь экспериментальный дизайн.
Поскольку метод инъекции IV имеет высокий процент успеха (более 80%), мы могли бы сравнить картину распределения с и без системных процедур, таких как наркотики или функциональных антител. Ранее мы провели эксперимент, в котором неонатальные мышам вводили анти-β1-интегрина функциональные блокирующие антитела (50 мкл при 20 мкг / г) или изотипу контрольные антитела (50 мкл при 20 мкг / г) в поверхностной височной вене неонатальных мышей. Через час после инъекции антитела, 5 × 106 БОЕ (50 мкл) MCMV были введены в другую сторону височной вене. Число MCMV-положительных клеток на участке CD29 хомячка анти-крысы (& beta ; 1 интегрина цепи, клон На2 / 5) -обработанной мозга были значительно ниже при сравнении с этим изотипа антител обработанных мозга 8. Используя тот же метод, в будущих исследованиях, эффекты лекарственных средств или нейтрализующих антител к вирусам, могут быть определены путем наблюдения за распределением вирусных частиц и инфицированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
