Abstract
In het onderzoek naar de pathogenese van virale encefalitis, de infectie werkwijze kritisch. De eerste van de twee besmettelijke routes naar de hersenen de hematogene route, die infectie van de endotheelcellen en pericyten van de hersenen betreft. De tweede is de intracerebroventriculaire (ICV) route. Eenmaal binnen het centrale zenuwstelsel (CNS), kunnen virussen verspreiden naar de subarachnoïdale ruimte, meninges, choroidea plexus en via de cerebrospinale vloeistof. In experimentele modellen, zijn de vroegste stadia van CNS virale verspreiding niet goed gekarakteriseerd, en het is onduidelijk of alleen bepaalde cellen eerst geïnfecteerd. Hier hebben we de verdeling van cytomegalovirus (CMV) deeltjes geanalyseerd tijdens de acute fase van de infectie, genaamd primaire viremie na ICV of een intraveneuze (IV) injectie in de neonatale muizenhersenen. In de ICV injectie model, 5 pl van muizen CMV (MCMV) of fluorescente microbolletjes werden geïnjecteerd in het laterale ventrikel op de midpoint tussen het oor en oog met behulp van een 10-ul spuit met een 27 G naald. In de IV injectie model, een 1-ml spuit met een 35 G naald werd gebruikt. Een transilluminator werd gebruikt om de oppervlakkige temporale (gezichts) ader van de neonatale muis visualiseren. We toegediend 50 pl MCMV of fluorescerende microbolletjes in de oppervlakkige temporale ader. De hersenen werden geoogst op verschillende tijdstippen na de injectie. MCMV genomen werden gedetecteerd met de in situ hybridisatie methode. Fluorescente microbolletjes of groen fluorescent eiwit recombinant MCMV deeltjes werden waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Deze technieken kunnen worden toegepast op vele andere pathogenen aan de pathogenese van encefalitis onderzoeken.
Introduction
Bij het bestuderen virale encefalitis, de initiële verdeling van virale deeltjes is zeer belangrijk om ziekte pathogenese begrijpen en virale targets te identificeren in de hersenen. De meeste virussen variëren in grootte van 20 tot 300 nm, hoewel de Pandoravirus meer dan 700 nm in grootte 1. De verdeling van de virale deeltjes in de acute fase van de infectie kan afhangen van de grootte van de deeltjes, de verdeling van cellulaire receptoren, of de affiniteit van de cellulaire receptoren voor virussen. In diermodellen, intracerebroventriculair (ICV), intraperitoneale, directe placenta en intraveneuze (IV) zijn infecties gebruikt voor de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. ICV inoculatie met virus wordt vaak gebruikt om het centrale zenuwstelsel (CNS) infecties bij muizen vastgesteld. Studies met deze techniek melden wijdverspreide infectie, met name cellen in de periventriculaire gebieden en in gebieden van de hersenen in direct contact met de cerebrospinale vloeistof (CSF), similar de effecten van virale ventriculoencephalitis. De geringe omvang van adeno-geassocieerd virus (AAV) deeltjes (20 - 25 nm in diameter) vergemakkelijkt de verspreiding gehele hersenen ICV infecties 2-4. Intraperitoneale 5, directe placenta 6, en IV injecties 7 vertegenwoordigen hematogenic systemische toediening. De penetratie van virale deeltjes door de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen zij het parenchym van de hersenen neonatale bereikt, die diffuus microgliacellen knobbeltjes 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) is een veel voorkomende virus dat behoort tot de herpes virus familie. In de Verenigde Staten, 50% - heeft 80% van de mensen CMV-infectie hadden door de leeftijd 40. CMV-infecties zijn zelden schadelijk, maar kan ziekten bij immuungecompromitteerde patiënten en foetussen veroorzaken. Van alle leveringen, 0,2% - 2% worden geboren met een CMV-10, wat resulteert in ernstige symptomen zoals microcefalie, periventriculaire verkalking, cerebellaire hypoplasie, microogontsteking, en de oogzenuw atrofie 11,12. Bovendien, mentale retardatie, perceptief gehoorverlies, visuele gebreken, beslaglegging, en epilepsie komen voor in ongeveer 10% van de niet-dodelijk-CMV-geïnfecteerde zuigelingen 13,14. CNS dysfunctie is de meest voorkomende kenmerkende symptoom van CMV aangeboren afwijking. Meer kinderen worden permanent elk jaar uitgeschakeld door congenitale CMV dan door het syndroom van Down, foetaal alcohol syndroom, of spina bifida 15. Er zijn geen vaccins tegen CMV beschikbaar op dit opgeroepen tot een behoefte aan een veilig en effectief vaccin. Het bestuderen van de interactie van CMV deeltjes met hun receptoren in de eerste fase van de infectie is belangrijk om het effect van vaccinatie begrijpen.
Ventriculoencephalitis en diffuse microglia knobbeltjes zijn de twee belangrijkste pathologische kenmerken van CMV encefalitis 16. Het is onzeker hoe de CMV deeltjes (150-300 nm) verspreid door de hersenen in de acute fase van de infectie eennd hoe de verdeling van cellulaire receptoren en hun affiniteit voor virussen dragen tot de virale verspreiding. Kawasaki et al. Geëvalueerd ICV en IV infecties vanuit de verdeling van deeltjes en hun receptoren (β1 integrine) in de eerste fase van de infectie. We hebben gevonden dat de verspreiding van CMV deeltjes en de expressie van β1 integrine goed gecorreleerd in de vroegste fase van de infectie in zowel ICV en IV infecties 8. ICV-infectie is een model van ventriculoencephalitis en IV-infectie is een model van diffuse microglia knobbeltjes. Het bestuderen van de dynamica van virale of fluorescerende deeltjes nuttige informatie opleveren over het effect van deeltjesgrootte, virale interacties met cellulaire receptoren, en het mechanisme van BBB penetratie in de hersenen geven. Het volgende protocol kan worden gebruikt om een virale infectie en virale vector in het CZS te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van Hamamatsu Universiteit van de School of Medicine.
1. Bereiding van MCMV (Smith-stam) en recombinant M32-versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) -MCMV
- Genereren van recombinant M32-EGFP-MCMV volgens de werkwijze als volgt (1,2-1,9) en zoals eerder beschreven 8.
- Gebruik recombinante virussen afgeleid van de Smith stam van wild-type MCMV (toegangsnummer: U68299). Steek EGFP (4361 basenparen, bp) tussen de 37.089 en 41.450 bp (M32 - M31 locus) in de MCMV genoom door homologe recombinatie.
- Amplificeren door polymeraseketenreactie de MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, linker flankerende sequentie en M31 (37.089 - 39.246 bp, rechter flankerende sequentie genloci met de volgende primers: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(voorwaartse primer), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Omgekeerde primer), M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (voorwaartse primer) 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(omgekeerde primer).
- Plaats de M32 locus in de EGFP-expressie vector gebruikt NheI en BamHI restrictieplaatsen. Steek de M31 locus in de M32-EGFP -recombinant plasmide met behulp van AflII en Xbal sites. Klieven de M32 - EGFP - M31-sequentie met Nhel en AflII van de M32 - EGFP - M31 recombinatie plasmide en los op in H 2 O.
- Transfecteren de gesplitste construct in de kernen van MCMV (Smith-stam) geïnfecteerde NIH3T3-cellen 24 uur na infectie (hpi) door een elektroporatie systeem induceren van homologe recombinatie.
- Op 3 dagen na infectie, co-cultuur van de cellen met niet-geïnfecteerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in een verhouding van 1/1000 in zes-well platen en scherm-EGFP expressie foci van geïnfecteerde cellen.
- Harvest het virus bevattende supernatanten uit de putjes die groen fluorescerend brandpunten en verdunnen vertienvoudigd. Voor zuivering, kiest putten die ene groen fluorescerend brandpunten weer te geven.
- Wanneer alle foci als gevolg van de beperkende-verdunning infectie weergave EGFP expressie, het viruspreparaat zuiver, wat aangeeft dat er geen wild-type virus blijft. Kwantificeren virus door plaque-assay methode zoals eerder beschreven 17.
- Behandel MCMV in gecertificeerde bioveiligheid kasten op bioveiligheidsniveau 2 het dragen van handschoenen en een masker.
- Passage MCMV (Smith-stam) en recombinant MCMV in MEFs bereid uit 12-dagen oude ICR muizenembryo's zoals eerder beschreven 17.
- Verwijder cellen uit de supernatanten van geïnfecteerde MEF kweken door centrifugatie bij 3000 xg gedurende 20 minuten bij 16 ° C.
- Ultracentrifuge de supernatanten gedurende 40 min bij 70.000 x g. Resuspendeer de pellets die virions in 1 ml Tris-gebufferde zoutoplossing kopiëring op een voorgevormde lineaire sorbitol gradiënt (25% - 70%). Ultracentrifuge opnieuw bij 70.000 x g gedurende 60 minuten 18.
- Oogst de virion-bevattende band met een spuit. Pellet de geoogste virusdeeltjes met een extra stap ultracentrifugatie bij 70.000 xg gedurende 40 min.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij -80 ° C tot de infectie experimenten.
- Kwantificeren virustiter door de plaque-assay werkwijze zoals eerder beschreven 19.
- Visualiseer de EGFP expressie van het recombinante MCMV deeltjes (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm) van fluorescentie microscopie (figuur 1A) en de deeltjesstructuur van transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 8 (figuur 1B).
2. Voorbereiding van Nile Red Fluorescent Microkralen
- Aankoop carboxyl Nile rood fluorescerende microbolletjes en plaats 500 pl microkorrels in buizen volgens diameter (0,04- 0,06 urn, ongeveer 3,63 x 10 12 deeltjes; 0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 10 deeltjes; en 1,7-2,2 urn, ongeveer 6,85 x 10 7 deeltjes).
- Behandel korrels met 500 ul van 0,1 M NaOH gedurende ongeveer 1 dag één endotoxines te verwijderen en resuspendeer de kralen in steriel water bij kamertemperatuur.
- Adsorbeer de kralen O / N met 10% muizenserum verkregen uit C57BL / 6 muizen bij kamertemperatuur vóór gebruik.
- Aggregaten, vortex de kralen scheiden en ultrasone trillingen grondig voor gebruik.
3. ICV Injectie van MCMV en Fluorescent Microkralen in pasgeboren muizen
- Handhaaf normale zwangere ICR muizen in een temperatuur-gecontroleerde faciliteit onder een 12 uur licht / donker-cyclus. De pasgeborenen worden aangeduid als P 0,5 op de geboortedatum.
- Steriliseren van een 10-ul spuit en een 27 G naald met 70% alcohol.
- Laad de injectieoplossing (5 pl) bevattende MCMV of fluorescente micro-kralen in de naald door voorzichtig te trekken van de zuiger van de spuit.
- Restrain neonatale muis (P 0,5) door er met de muis op het ijs voor 3-4 min. Zodra het dier onder narcose is, gebruikt de toe-pinch respons methode om de diepte van de anesthesie te bepalen.
- Markeer de injectieplaats met een niet-toxisch laboratorium pen op een locatie ongeveer 0,7-1,0 mm lateraal van de pijlnaad en 0,7-1,0 mm caudaal van de neonatale bregma (Figuur 2A).
- Steek de naald 2 mm diepte, loodrecht op de schedel oppervlak op de gemarkeerde injectieplaats. Ter referentie, mark 2 mm van het uiteinde van de naald met een niet-toxisch maker.
- Injecteer langzaam 5 pl MCMV (ongeveer 5 x 10 5 PFU) in het laterale ventrikel zonder de hoofdhuid (figuur 2B).
- Bij een andere groep muizen, Injecteer 5 ul oplossing die fluorescerende microbolletjes (0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 8 deeltjes) vandezelfde methode.
- Verwijder langzaam de naald 10 - 20 seconden na het stopzetten van de zuiger beweging om terugstroom te voorkomen.
- Om te herstellen, houden de muizen voor 5-10 minuten in een warme container tot beweging en algemene responsiviteit worden hersteld.
- Oogst de hersenen zoals beschreven in hoofdstuk 5 op verschillende tijdstippen (3, 12, 24, 48 en 72 uur) na injectie.
4. IV Injectie van MCMV of Fluorescent Microkralen in pasgeboren muizen
- Restrain neonatale muis (P 0,5) door er met de muis op het ijs voor 3-4 min.
- Gebruik een 1 ml spuit met een 35 G naald op de intraveneuze injectie van MCMV uitvoeren P 0,5 pasgeborenen.
- Gebruik een transilluminator (ader finder) naar de oppervlakkige temporale (gezichts) ader te visualiseren. Vóór injectie, veilig de pasgeborene op de transilluminator met behulp van chirurgische tape (figuur 2C).
- Terwijl het dragen van vergrootglazen (1.5x), langzaam trekken 50 pi MCMV (ongeveer 5,45 ×; 10 9 deeltjes) of fluorescerende microbolletjes (0,04-0,06 micrometer, ongeveer 3,63 x 10 11 deeltjes, 0,1-0,3 urn, ongeveer 5,75 x 10 9 deeltjes en 1,7-2,2 urn, ongeveer 6,85 x 10 6 deeltjes) in de oppervlakkige temporale ader (Figuur 2D).
- Na verwijdering van de naald, gebruikt gaas met 70% alcohol druk uit op de injectieplaats totdat het bloeden stopt.
- Geef het pasgeboren kind ongeveer 5 minuten in een warme container om te herstellen alvorens terug te keren naar de kooi.
- Oogst de hersenen zoals beschreven in hoofdstuk 5 op verschillende tijdstippen (3, 12, 24 en 72 uur) na injectie.
5. Brain Tissue Monstervoorbereiding voor Paraffinecoupes
- Plaats de geïnjecteerde pasgeborenen in een kleine plastic schaaltje op crushed ijs.
- Zodra het dier onder narcose is, gebruikt de toe-pinch respons methode om de diepte te bepalen verdoIA.
- Maak een centrale of twee end horizontale einde snijdt door de ribbenkast het openstellen van de borstholte.
- Maak een snee in het atrium met een scherpe schaar. Infuseren 4% paraformaldehyde oplossing (PFA) in het atrium. Stop perfusie als spontane beweging (PFA dans) en lichter kleuren van de lever worden waargenomen. Niet exsanguinate.
- Ontleden de pasgeborene (zoals eerder beschreven 20) door eerst de kop met een schaar verwijderd.
- Maak een middellijn incisie langs het omhulsel van de hals aan de neus aan de schedel bloot te leggen.
- Plaats de punt van een paar irisschaar in het foramen magnum enerzijds goed glijden langs het binnenoppervlak van de schedel.
- Maak een snee te breiden tot de verste rand van het achterste schedel oppervlak, en maak een identieke bezuinigen op de contralaterale zijde. Ruim de schedel rond het cerebellum.
- Schuif nu voorzichtig de schedel enerzijds om schade aan de hersenen te voorkomen. Herhaal dezeaan de tegengestelde kant van de hersenen.
- Met behulp van een spatel, scheiden de reukkwabben en nerveus verbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen.
- Voorzichtig scheiden de hersenen uit het hoofd, trimmen elke dura die nog steeds de hersenen aan te sluiten op de schedel met een schaar en verwijder de hersenen.
- Plaats de hersenen in een flacon fixeermiddel met 4% PFA ten minste 10 maal het volume van de hersenen gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Dehydrateer het weefsel door een reeks van gegradeerde ethanol baden het water verplaatsen en vervolgens infiltreren met paraffine, vormen een blok. Snijd de paraffine blok met een microtoom in plakjes 4 micrometer dik 21.
- Deparaffinize en hydrateren de slides van de besmette hersenen 22. Overgaan tot in situ hybridisatie paraffine ingebedde secties.
6. Brain Tissue Monstervoorbereiding voor vriescoupes
- Verwijder de hersenen na het stappen in 5,1-5,11.
- Om de fluorescente microkralen en M32-EGFP-MCMV observeren, plaatst u de gereseceerd hersenen op vlakke bodem cryomolds. Voeg inbedding medium volledig te bedekken de hersenen monster. Snap bevriezen cryomolds in voorgekoelde n-hexaan (-80 ° C), middels een tang om de rand van de cryomolds houden vóór bevestiging aan de boorkop.
- Voor het snijden, hechten de bevroren weefsel blok op de voorgekoelde cryostaat boorkop. Breng het ingevroren weefsel met de klem in een cryostaatkamer en laat de temperatuur tussen -10 en -20 ° C, en snijd de plakjes ongeveer 8-10 urn dik 23.
- Bevestig de secties met cytofixative (mengsel van isopropylalcohol en polyethyleenglycol) door sproeien. Lucht drogen de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onmiddellijk na het sproeien en opgeslagen bij - 80 ° C tot verder gebruik.
- Evenwicht de secties terug naar RT en was drie keer met PBS.
- Vlekken op de secties met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd Griffonia simplicifolia isolectin B4 in een concentratie van 1: 100 gedurende 10 min in PBS bij kamertemperatuur (Figuur 5) of PE-geconjugeerde CD31 antilichaam bij een concentratie van 1: 100 gedurende 30 min in PBS bij kamertemperatuur (figuur 6).
- Was de secties met PBS driemaal.
- Na het wassen, vlekken op de secties met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om celkernen zichtbaar. Monteer de secties in anti-fade reagens en het DAPI (excitatie bij 345 nm, emissie bij 455 nm), EGFP (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm), en de Nile rood (excitatie bij 553 nm, emissie bij 637 nm) met een fluorescentiemicroscoop (figuren 3, 5, 6).
7. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) voor paraffine ingebedde secties
- Bereid de FISH probe direct gemerkt met fluorofoor voor DNA in situ hybridisatie door nick translatie met behulp van een bacterieel kunstmatig chromosoom met het hele MCMV DNA-genome (pSM3fr) 19. De concentratie van de FISH probe 0,1 ug / ul.
- Deparaffinize en hydrateren de slides van de besmette hersenen 22.
- Behandel de weefselsecties met RNase (100 ug / ml in PBS) om viraal DNA te detecteren.
- Voeren naar antigenen met een 0,05% NP40, 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) bij 95-98 ° C gedurende 20 min. Koel de objectglaasjes naar kamertemperatuur 20 min.
- In een glazen Coplin kleuring pot, was de dia's in zuiver water drie keer gedurende 2 minuten per keer. Voer een extra antigen retrieval stap met een 0,06% pepsine, 0,01 N HCl-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Spoel de objectglaasjes drie keer in zuiver water gedurende 2 minuten telkens in een glazen Coplin jar kleuring.
- Dehydrateer de weefselcoupes opnieuw in door de dia's uit 70% ethanol, 85% ethanol, en vervolgens tot 100% ethanol.
- Voor het bereiden 10 ml hybridisatiebuffer, meng 1,25 ml in situ hybridisatie zouten (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8,0, 100 mM natriumfosfaat pH 6,8, 50 mM EDTA) met 5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 50% dextraansulfaat, 250 gl 50x Denhardt's oplossing, 125 ul 100 mg / ml tRNA en 875 ul H2O
- Verdun het DNA probe direct gelabeld met fluoroforen die de hele MCMV genoom willekeurig in de hybridisatiebuffer herkennen. Het eindvolume moet 10 pl (7 pl hybridisatie buffer, 1 pl probe (0,1 ug / ul) en 2 ui gedestilleerd water).
- Voeg de sonde mix (10 pi) aan elke dia en dek af met een dekglaasje (15 × 15 mm). Seal het dekglaasje met rubber cement. Denatureren de probe-mengsel gedurende 5 minuten bij 85 ° C en vul het hybridisatiestap O / N bij 42 ° C.
- Was de dia's met 0,3% NP40, 0,4x SSC bij 73 ° C gedurende 2 min; met 0,1% NP40, 0,4x SSC bij 73 ° C gedurende 1 min; en met 2x SSC tweemaal.
- Tegenkleuring de kernen met DAPI (10 ng / ml) en hebben betrekking op de dia met een dekglaasje.
- bergde secties in anti-fade reagens en het DAPI (excitatie bij 345 nm, emissie bij 455 nm) en EGFP (excitatie bij 489 nm, emissie bij 508 nm) met een fluorescentiemicroscoop (figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij onderzoek naar de pathogenese van virale encefalitis, de infectie werkwijze belangrijk. De hematogene route vertegenwoordigt een acute infectie van de endotheelcellen en pericyten van de hersenen, terwijl de ICV route vertegenwoordigt een acute infectie zich via het CB door de subarachnoïdale ruimte, tot aan de hersenvliezen en choroid plexus. De eerste verdeling van deeltjes in acute encefalitis, in situ hybridisatie detectie van de MCMV genomen en directe observatie van M32-EGFP-MCMV deeltjes of fluorescerende microbolletjes analyse gebruikt.
Generatie van recombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV)
Het protocol illustreert hoe recombinant M32-GFP-MCMV werd gegenereerd. EGFP werd ingevoegd tussen 37.089 en 41.450 bp (M32-M31 locus) in MCMV genoom door homologe recombinatie. Een EGFP pProtein werd gefuseerd met een viraal eiwit (M32) en EGFP werd tot expressie gebracht in de virale deeltjes. Na homologe recombinatie, werd een viruspreparaat geacht zuiver als alle foci als gevolg van de beperkende-verdunning infectie weergegeven EGFP expressie, wat aangeeft dat er geen wild-type virus bleven. Het kan meerdere verdunning naar het recombinant virus te zuiveren. Figuur 1A toont EGFP signalen van gezuiverd recombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV) en een TEM beeld van M32-EGFP-MCMV deeltjes die het virusgenoom in de viruskern Figuur 1B toont .
Intracerebroventriculaire Injection en intravasculaire injectie
Figuur 2 toont de injectieplaatsen van neonatale muizen (P 0,5) wanneer virus of microkorrels via ICV route of intraveneus geïnjecteerd. In ICV, de injectie is in het midden tussenhet oor en oog op een locatie ongeveer 0,7-1,0 mm lateraal van de pijlnaad en 0,7-1,0 mm caudaal van de neonatale bregma (Figuur 2A). De naald moet worden geïnjecteerd in het laterale ventrikel 2 mm diepte, loodrecht op de schedel oppervlak (Figuur 2B). Figuur 2C en 2D tonen dat MCMV of microparels geïnjecteerd in de temporele gezicht ader van neonatale muizen. Een transilluminator en vergrootglazen zijn handige tools om duidelijk te visualiseren kleine aders.
De verdeling van virale deeltjes / genomen en TL Microkralen
De volgende figuren tonen de verdeling van virale deeltjes / genomen en fluorescerende microbolletjes in de acute fase. Figuur 3 toont de microbead signalen van ingevroren secties van de hersenen. Figuur 3A en 3B tonen deverdeling van de 0,1 -. 0,3 urn fluorescerend Nile rood microbeads in de randgebied (MA) (figuur 3A) en de choroid plexus en subventriculaire zone (SVZ) (figuur 3B) en 2 h na ICV injectie Figuur 3C en 3D tonen de verdeling van 0,1-0,3 urn fluorescerend Nile rood microbolletjes in de MA en vasculaire gebied (figuur 3C) en de choroid plexus en SVZ (figuur 3D) in 2 uur na IV injectie. Het is waarschijnlijk dat na ICV en intraveneuze injectie, deeltjes niet onmiddellijk gelijkmatig verspreid over het parenchym. Integendeel, zij bleef in de SVZ, MA, en vasculaire gebied in de acute infectie fase. De grootte van de deeltjes is de belangrijkste factor die de verdeling in de hersenen in de acute fase na ICV en IV injectie. Figuur 4 toont de FISH van het MCMV genoom op de paraffine ingebedde secties van de hersenen. De MCMV genoom (groene vlekken) werd gedetecteerd in deSVZ op 3 uur na ICV injectie (Figuur 4B). De MCMV genomen (groene vlekken) werden gedetecteerd in de MA en vasculaire gebied op 3 uur na IV injectie (Figuur 4C). De verdeling van de MCMV (figuur 4) en microkorrels (Figuur 3) waren zeer vergelijkbaar. Figuur 5 toont de grootte-afhankelijke verspreidingspatroon van microkorrels in de ingevroren secties van de hersenen na intraveneuze injectie. Microkorrels met een diameter 1,7-2,2 urn (figuur 5B), 0,1-0,3 urn (figuur 5D) en 0,04-0,06 urn (figuur 5E) respectievelijk getoond. Kleinere microkralen had de neiging uit het vasculaire gebied het parenchym te extravasatie. Figuur 6 toont de verdeling van M32-EGFP-MCMV deeltjes in ingevroren secties van de hersenen. GFP dot signalen (M32-EGFP-MCMV deeltjes) werden voornamelijk waargenomen in de MA (figuur 6A) en choroïdplexus en SVZ (
Figuur 1:. Generatie van recombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifuge M32-EGFP-MCMV deeltjes worden beschouwd als groene vlekken door fluorescentiemicroscopie. Schaal bar:. 2.4 micrometer (B) Transmissie elektronenmicroscopie blijkt dat M32-EGFP-MCMV deeltjes bezitten een typisch virus structuur. Schaal bar: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Injectie Sites van de Neonatale Mouse. (A, B) ICV injectie van 5 ui MCMV (ongeveer 5 x 10 5 PFU) of 5 gl microkralen (ongeveer 5,75 x 10 9 deeltjes). (A) De injectie is in het midden tussen het oor en oog (at een locatie ongeveer 0,7 - 1,0 mm lateraal van de pijlnaad en 0,7 -. 1,0 mm caudaal van de neonatale bregma) (B) a 27 G naald met een 10-ul injectiespuit wordt gebruikt voor de injectie in de laterale ventrikel 2 mm diep, loodrecht op de schedel oppervlak. (C, D) MCMV of microbolletjes worden geïnjecteerd in de temporele gezicht ader van neonatale muizen. (C) (D) een 1-ml spuit met een 35 G naald wordt gebruikt om de IV injectie van MCMV te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 3: Visualisatie van Fluorescent Nile Red Microkralen in de hersenen (A, B) 0,1-0,3 urn fluorescerend Nile rood microkralen signalen (rood) worden waargenomen in de MA (A) en de choroid plexus en SVZ (B) en 2 uur na ICV injectie (C, D) 0,1 -. 0,3 urn fluorescerend Nile rood microkralen ingebracht in de neonatale muizenhersenen door IV injectie 2 uur na injectie. Nile rood microbolletjes worden waargenomen in the MA en vasculaire gebied (C) en de choroid plexus en SVZ (D). De witte vierkant wordt uitvergroot in de uitgebreide insert in de rechterbovenhoek van (D) (A, C) Schaal bar:. 50 micrometer (B, D) Schaal bar:. 150 pm. Pijlen geven de Nijl rood microbolletjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MCMV Genome Distributie in de hersenen van muizen Na ICV injectie en IV Injection (A) De kleinere vergroting te bekijken.. De witte vierkant geeft aan waar de vergrote afbeelding (B) werd gevangen. (B) de MCMV genoom (groene vlekken) wordt voor het eerst ontdekt in de SVZ om 3 uur na ICV injectie. DAPI (4 ',, 6-diamidino-2-fenylindool) wordt gebruikt voor nucleaire acid (nucleaire) kleuring. Schaalbalk. 30 pm (C) De MCMV genoom (groene vlekken) gedetecteerd in het vasculaire stippellijn meninges op 12 uur na intraveneuze injectie. DAPI wordt gebruikt voor nucleaire zure kleuring. Schaal bar: 30 micrometer. Pijlen geven vertegenwoordiger MCMV genoom (groene vlekken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. De relatie tussen de diameter van Microkralen en de verdeling van de Microkralen Fluorescent Nijl rood microbolletjes (50 ui) worden ingebracht in neonatale muizenhersenen door IV injectie. In vriescoupes bereid 2 uur na injectie, Nile rood signalen (rood, aangeduid door pijlen) worden waargenomen in en rond de Vascular gebied van het parenchym. De vasculaire gebied is gekleurd met fluorescerend lectine (groen) (A, B) 1.7 -.. 2.2 micrometer microbolletjes (A) de kleinere vergroting te bekijken. De witte vierkant geeft aan waar de vergrote afbeelding (B) werd gevangen (B) het witte vierkant wordt vergroot als de uitgebreide insert in de rechterbovenhoek van (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 pm microbolletjes (C) de kleinere vergroting te bekijken. De witte vierkant geeft aan waar de vergrote afbeelding (D) werd gevangen (D) het witte vierkant wordt vergroot als de uitgebreide insert in de rechterbovenhoek van (D) (E, F) 0,04 -... 0,06 micrometer microbolletjes (E) de kleinere vergroting te bekijken. De witte vierkant geeft aan waar het vergrote beeld (F) werd gevangen. (F) het witte vierkant wordt vergroot als de uitgebreide insert in de rechterbovenhoek van
Figuur 6: Waarneming van virusdeeltjes in de acute infectie fase. (A, B) EGFP dot signalen (M32-EGFP-MCMV deeltjes) worden voornamelijk waargenomen in de MA (aangegeven door pijlen, A), choroid plexus en SVZ (aangegeven met pijlen; B) en 2 uur na ICV injectie. De witte vierkanten worden vergroot als de uitgebreide inzetstukken in de rechterbovenhoek van (A) en (B). Schaalbalk. 20 pm (C, D) Op 3 uur na intraveneuze injectie, worden de MCMV deeltjes (groen aangegeven met pijlen) binnen en buiten vond het vasculaire gebied vanhet parenchym (C), choroid plexus en SVZ (D) (rood: CD31-positieve cellen). De witte vierkanten worden vergroot als de uitgebreide inzetstukken in de rechterbovenhoek van de (C) en (D). Schaal bar:. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diermodellen, ICV, intraperitoneale, directe placenta en IV infecties zijn gebruikt om de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. Gefocusseerd op het ICV en IV injectie modellen van neonatale muizen voor de eenvoud van de procedure en het voordeel van directe injectie van deeltjes in het doelgebied. Hoewel intraperitoneale infectie is een eenvoudige methode, virusdeeltjes verspreid systemisch via een indirect proces 5,24. Direct placenta infectie is een goede methode embryonale systemische infectie te bestuderen. Echter, deze methode vereist een speciale opleiding om stabiele resultaten op en heeft een lage slagingspercentage. De infectie methode is ook een indirect proces de placenta en het is moeilijk om de hoeveelheid injectie in de foetus uitvoeren in verschillende proef 6. Aangezien de neonatale muis is zeer gevoelig voor virussen zoals CMV, in deze studie kan de verdeling van virale deeltjes en van geïnfecteerde cellen aan het begin phas vergelijke infectie. De ICV injectie model is gunstig voor de infectie gedrag dat de BBB 25 omzeilt bestuderen, terwijl de IV infectiemodel is een systemische infectie model lijkt op natuurlijke infectie inclusief de interactie van het virus met de BBB.
De ICV injectiemethode, hebben we ervoor minstens 2 mm diep in de schedel. De naald werd in de cerebrale ventrikels gedurende ongeveer 10 - 20 sec ter voorkoming van terugstroming de ventrikels 26. Indien goed gedaan ICV injectie is gemakkelijk in vivo methode. Echter, soms onjuiste injecties met inbegrip van ongewenste terugstroom of diepe / ondiepe penetratie van de naald naar de hersenen kan gebeuren. Zorgvuldige procedures en observaties na de injectie nodig zijn om dit protocol met succes uit te voeren. Gezien de injectie fouten, we alleen gericht op het verspreidingspatroon van de deeltjes en niet de hoeveelheid, en niet de effecten van behandeling met geneesmiddelen niet waarnemens of functionele antilichamen in onze studie.
Er zijn verschillende procedures om de muizen neonatale IV injectie, door middel van verschillende locaties uit te voeren, zoals oppervlakkige temporale aderen, externe halsader, en retro-orbitale sinus. De oppervlakkige temporale ader van de pasgeborene is eenvoudig gevisualiseerd met behulp van een transilluminator en vergroting lens. Injectie kan worden ingevuld door een enkele ervaren persoon met een hoog succespercentage rate.We koos voor de oppervlakkige temporale ader als de site van IV injectie. De intraveneuze injectie methode vereist enige training, zoals het positioneren van de neonatale muis en de injectie procedure. Het hoofd van de neonatale muis moet worden geplaatst met tape voor de temporale ader om op de top en een flatscreen. Het 35 G naald moet worden ingebracht in het vat ver genoeg dat de punt van de naald volledig wordt omgeven door het vat. Een transilluminator en vergrootglazen zijn handige tools om duidelijk te visualiseren kleine aders. Injectie van grote volumes tot 100gl moet langzaam worden geïnfundeerd om de stroom van de inhoud ervan te bevestigen. Bij uitval van de injectie eerste proef, de andere kant van de temporale ader is beschikbaar voor een nieuw proces. Na injectie, jongen ervaren minimale nood en snel te herstellen. Het is niet duidelijk waarom een gemiddelde van één van de 20 pups ervaren grote nood en niet herstellen. Echter, het lage tarief van het optreden van deze gebeurtenis minimaal beschadigt de hele experimentele opzet.
Als de IV injectie werkwijze een hoog slagingspercentage (meer dan 80%), kunnen we het verspreidingspatroon vergelijken met en zonder systemische behandelingen zoals geneesmiddelen of functionele antilichamen. We hebben eerder een experiment waarbij neonatale muizen (bij 20 ug / g 50 ul) of isotype controle-antilichamen (20 ug / g 50 pl) werden geïnjecteerd met anti-β1 integrine functionele blokkerende antilichamen in de oppervlakkige temporale ader van neonatale muizen uitgevoerd. Een uur na antilichaam injectie, 5 x 106 PFU (50 pl) van MCMV werden toegediend in de andere kant van de temporale ader. Het aantal MCMV-positieve cellen per sectie van hamster anti-rat CD29 (β1 integrine keten, klonen Ha2 / 5) behandelde hersenen waren significant lager bij het vergelijken met die van isotype-antilichaam behandelde hersenen 8. Met dezelfde werkwijze toekomstige onderzoeken, kunnen de effecten van drugs of neutraliserende antilichamen tegen virussen worden bepaald door het observeren van de verdeling van virale deeltjes en geïnfecteerde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
