Abstract
No estudo sobre a patogénese de encefalite viral, o método de infecção é crítica. A primeira das duas principais vias infecciosos para o cérebro é o percurso hemática, que envolve a infecção de células endoteliais e pericitos do cérebro. O segundo é o intracerebroventricular (ICV) de rota. Uma vez dentro do sistema nervoso central (SNC), os vírus podem espalhar-se para o espaço subaracnóide, meninges, plexo coróide e através do líquido cefalorraquidiano. Em modelos experimentais, os primeiros estágios da distribuição viral CNS não estão bem caracterizados, e não está claro se apenas algumas células são inicialmente infectado. Aqui, foi analisada a distribuição de partículas de citomegalovírus (CMV) durante a fase aguda da infecção, denominado viremia primária, seguindo ICV ou intravascular (IV) injecção no cérebro neonatal de rato. No modelo de injecção ICV, 5 ul de CMV de murino (MCMV) ou microesferas fluorescentes foram injectadas no ventrículo lateral na midpoint entre a orelha e o olho, utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 27 G. No modelo de injecção IV, foi usada uma seringa de 1 ml com uma agulha de 35 g. Um transiluminador foi usado para visualizar a veia temporal superficial (facial) do rato neonatal. Nós infundido 50 ul de microesferas fluorescentes ou MCMV na veia temporal superficial. Os cérebros foram colhidas em diferentes pontos de tempo após a injecção. Genomas MCMV foram detectados usando o método de hibridação in situ. microesferas fluorescentes ou proteína verde fluorescente que expressam partículas MCMV recombinantes foram observadas por microscopia fluorescente. Estas técnicas podem ser aplicadas a vários outros agentes patogénicos para investigar a patogénese da encefalite.
Introduction
Ao estudar a encefalite virai, a distribuição inicial de partículas virais é muito importante para compreender patogênese da doença e para identificar alvos virais no cérebro. A maioria dos vírus variam em tamanho de 20 a 300 nm, embora o pandoravírus é mais do que 700 nm de tamanho 1. A distribuição das partículas virais na fase aguda da infecção podem depender do tamanho das partículas, a distribuição de receptores celulares, ou a afinidade dos receptores celulares para os vírus. Em modelos animais, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placenta directa, e intravenosa (IV), as infecções foram utilizados para estudar a patogénese da encefalite viral. ICV inoculação com vírus é muitas vezes usado para estabelecer infecções centrais do sistema nervoso (CNS) em camundongos. Estudos utilizando esta técnica relatam infecção generalizada, particularmente de células nas zonas peri e em regiões do cérebro em contato direto com o líquido cefalorraquidiano (LCR), Similar para os efeitos da ventriculoencephalitis viral. O pequeno tamanho de vírus adeno-associado (AAV) partículas (de 20 - 25 nm de diâmetro) facilita a sua disseminação em todo o cérebro em infecções ICV 2-4. Intraperitoneal 5, placentários direta 6 e IV injeções 7 representam administração sistêmica hematogênica. A penetração das partículas virais através da barreira sangue-cérebro (BBB) permite-lhes alcançar o parênquima do cérebro neonatal, representando nódulos microgliais difusas 8,9.
Citomegalovírus (CMV) é um vírus comum, que pertence à família do vírus do herpes. Nos Estados Unidos, 50% - 80% das pessoas tiveram a infecção por CMV pela idade 40. infecções por CMV raramente são prejudiciais, mas podem causar doenças em pacientes imunocomprometidos e fetos. De todos os partos, 0,2% - 2% nascem com CMV 10, resultando em sintomas graves como microcefalia, calcificações periventricular, hipoplasia cerebelar, microftalmia, e atrofia do nervo óptico 11,12. Além disso, retardo mental, perda auditiva neurossensorial, defeitos visuais, convulsões e epilepsia ocorrem em cerca de 10% das crianças infectadas com CMV não fatalmente 13,14. disfunção do SNC é o sintoma característico mais comum de CMV anomalia congênita. Mais crianças estão permanentemente desativado cada ano por CMV congênita que pela síndrome de Down, síndrome alcoólica fetal, ou espinha bífida 15. Não há vacinas contra a CMV disponíveis no presente, apelando para a necessidade de uma vacina segura e eficaz. Estudar a interacção de partículas de CMV com os seus receptores na fase mais inicial da infecção é importante para compreender o efeito da vacinação.
Ventriculoencephalitis e nódulos microgliais difusas são as duas principais características patológicas da CMV encefalite 16. Tem sido incerto como as partículas de CMV (150-300 nm), distribuídos através do cérebro na fase aguda da infecção umND como a distribuição de receptores celulares e a sua afinidade para os vírus contribuir para a propagação virai. Kawasaki et al. Avaliaram ICV e IV infecções do ponto de vista da distribuição de partículas e os seus receptores (integrina β1) na fase inicial da infecção. Descobrimos que a disseminação de partículas CMV e a expressão de integrina β1 estão bem correlacionados numa fase mais inicial da infecção, tanto ICV e infecções IV 8. infecção ICV é um modelo de ventriculoencephalitis e infecção IV é um modelo de nódulos microgliais difusas. O estudo da dinâmica de partículas virais ou fluorescentes daria informações úteis sobre o efeito do tamanho de partícula, as interacções virais com receptores celulares, e o mecanismo de certificação penetração no cérebro. O protocolo seguinte pode ser utilizado para investigar qualquer infecção viral e vetor viral no sistema nervoso central.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Hamamatsu da School of Medicine.
1. Preparação de MCMV (Smith estirpe) e recombinante M32-enhanced green fluorescent protein (EGFP) -MCMV
- Gerar recombinante M32-EGFP-MCMV de acordo com o método como se segue (1,2-1,9), e como anteriormente descrito 8.
- Use vírus recombinantes derivadas da estirpe Smith de wild-tipo MCMV (número de acesso: U68299). Inserir EGFP (4.361 pares de bases; pb) entre 37089 e 41450 pb (M32 - M31 lócus) no genoma do MCMV por recombinação homóloga.
- Amplificar por reação em cadeia da polimerase do MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, deixou flanqueando sequência e M31 (37.089 - 39.246 bp, certo flanqueando locos gênicos sequência utilizando os seguintes iniciadores: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(iniciador directo), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Iniciador reverso); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (iniciador directo), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(iniciador inverso).
- Insira o locus M32 no vector expressando EGFP utilizando locais de restrição NheI e BamHI. Insira o locus M31 para a M32-EGFP -recombinant plasmídeo usando sites AflII e Xbal. Clivar o M32 - EGFP - sequência de M31 com NheI e AflII do M32 - EGFP - M31 plasmídeo de recombinação e dissolver em H 2 O.
- Transfectar o construto clivado para os núcleos de MCMV (estirpe Smith) infectados com células NIH3T3 24 horas pós-infecção (hpi), utilizando um sistema de electroporação para induzir a recombinação homóloga.
- Aos 3 dias pós-infecção, a co-cultura das células com rato não infectado fibroblastos embrionários (MEFs) a uma proporção de 1 / 1.000 em placas de seis poços e para focos tela que expressam EGFP de células infectadas.
- Harvest os sobrenadantes contendo vírus a partir dos poços contendo verde focos fluorescentes e diluir dez vezes. Para a purificação, escolha poços que apresentam individuais focos fluorescentes verdes.
- Quando todos os focos resultantes da infecção visor expressão EGFP-limitando a diluição, a preparação de vírus é puro, o que indica que nenhum vírus de tipo selvagem permanece. Quantificar o vírus pelo método de placa-ensaio tal como anteriormente descrito 17.
- Trate MCMV em gabinetes de biossegurança certificadas a nível de biossegurança 2 vestindo luvas e máscara.
- Passagem MCMV (estirpe Smith) e MCMV recombinante em MEFs preparados a partir de 12 dias de idade embriões de ratinho ICR como previamente descrito 17.
- Remover as células a partir dos sobrenadantes de culturas MEF infectados por centrifugação a 3000 × g durante 20 min a 16 ° C.
- Ultracentrífuga os sobrenadantes durante 40 min a 70.000 x g. Ressuspender as peletes contendo viriões em 1 ml de solução salina tamponada com Tris e transferir para um s linear pré-formadogradiente orbitol (25% - 70%). Ultracentrífuga novamente a 70.000 x g durante 18 60 min.
- Colher a banda contendo virion com uma seringa. Agregar as viriões colhidas por um passo de ultracentrifugação adicional a 70000 × g durante 40 min.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenar a -80 ° C até as experiências de infecção.
- Quantificar a título de vírus pelo método de placa-ensaio tal como anteriormente descrito 19.
- Visualizar a expressão EGFP das partículas de MCMV recombinante (excitação a 489 nm, emissão a 508 nm) por microscopia de fluorescência (Figura 1A) e a estrutura da partícula por meio de microscopia electrónica de transmissão (TEM) 8 (Figura 1B).
2. Preparação de microesferas fluorescentes Vermelho do Nilo
- carboxilo compra fluorescente Nilo microesferas vermelhas e colocar 500 ul de microesferas em tubos de acordo com diâmetro (0,04- 0,06 mm, cerca de 3,63 x 10 12 partículas; 0,1-0,3 uM, cerca de 5,75 x 10 10 partículas; e 1,7-2,2 mm, cerca de 6,85 x 10 7 partículas).
- Tratar pérolas com 500 mL de NaOH 0,1 M durante cerca de 1 dia para remover quaisquer endotoxinas e voltar a suspender as pérolas em água estéril à temperatura ambiente.
- Adsorver os grânulos de O / N com soro de ratinho a 10% obtidos a partir de ratinhos C57BL / 6, à TA, antes da utilização.
- Para separar agregados, vortex as contas e sonicate completamente antes de usar.
3. Injecção ICV de MCMV e fluorescentes microesferas em Ratos Neonatais
- Manter ratinhos ICR grávidas normais em uma instalação com temperatura controlada sob um 12 hr ciclo de luz / escuridão. Os recém-nascidos são designados como P 0,5 no dia do nascimento.
- Esterilizar uma seringa de 10 mL e uma agulha de 27 G com álcool a 70%.
- Carregar a solução de injecção (5 mL) contendo MCMV ou micro fluorescentegrânulos para dentro da agulha por puxar cuidadosamente o êmbolo da seringa.
- Contenha rato neonatal (P 0.5), colocando o mouse sobre gelo por 3-4 min. Uma vez que o animal está sob anestesia, utilizar o método de resposta de igual pitada para determinar a profundidade de anestesia.
- Marcar o local de injecção com uma caneta de laboratório não-tóxicos em um local aproximadamente 0,7-1,0 mm ao lado da sutura sagital e 0,7 - 1,0 milímetros caudal a partir da bregma neonatal (Figura 2A).
- Inserir a agulha 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio no local de injecção marcado. Para referência, marquem 2 mm a partir da ponta da agulha com uma máquina de não-tóxico.
- Lentamente injectar 5 ul de MCMV (aproximadamente 5 x 10 5 PFU) no ventrículo lateral sem abrir o couro cabeludo (Figura 2B).
- Noutro grupo de ratinhos, injectar uma solução de 5 ul contendo microesferas fluorescentes (0,1-0,3 uM, cerca de 5,75 x 10 8 partículas) poro mesmo método.
- retirar a agulha devagar 10-20 seg após a interrupção do movimento de êmbolo para evitar o refluxo.
- Para recuperar, manter a ratinhos durante 5 - 10 min em um recipiente quente até o movimento e capacidade de resposta geral são restauradas.
- Colher os cérebros, tal como descrito na secção 5 a uma gama de pontos de tempo (3, 12, 24, 48, e 72 h pós-injecção).
4. injecção IV de MCMV ou fluorescente microesferas em Ratos Neonatais
- Contenha rato neonatal (P 0.5), colocando o mouse sobre gelo por 3-4 min.
- Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 35 G para a injecção intravenosa de MCMV em P 0,5 neonatos.
- Use um transilluminator (veia Finder) para visualizar a veia superficial temporal (facial). Antes da injecção, garantir o recém-nascido ao transilluminator usando fita cirúrgica (Figura 2C).
- Enquanto estiver usando lupas (1.5X), infundir-se lentamente 50 mL de MCMV (aproximadamente 5,45 ×; 10 9 partículas) ou microesferas fluorescentes (0,04 - 0,06 mm, cerca de 3,63 x 10 11 partículas; 0,1 - 0,3 um, cerca de 5,75 x 10 9 partículas; e 1,7 - 2,2 mm, cerca de 6,85 x 10 6 partículas) na veia temporal superficial (Figura 2D).
- Após a remoção da agulha, utilizar gaze contendo álcool a 70% para aplicar a pressão no local da injecção até que a hemorragia cesse.
- Dê o recém-nascido cerca de 5 min em um recipiente quente para se recuperar antes de voltar para a jaula.
- Colher os cérebros, tal como descrito na secção 5 a uma gama de pontos de tempo (3, 12, 24, e 72 h) após a injecção.
5. Cérebro Preparação Amostra de Tecido para as secções de parafina
- Coloque os neonatos injetados em um pequeno prato de plástico em gelo picado.
- Uma vez que o animal está sob anestesia, use o método de resposta toe-pitada para determinar a profundidade de anesthesI a.
- Faça um corte centrais ou dois fim horizontal finais através da caixa torácica para abrir a cavidade torácica.
- Faça um corte no átrio com uma tesoura afiada. Infundir solução de paraformaldeído a 4% (PFA) para dentro do átrio. Pare de perfusão quando são observados movimentos espontâneos (PFA dança) e iluminado-color do fígado. Não desangrar.
- Dissecar o recém-nascido (como previamente descrito 20) pelo primeiro retirar a cabeça usando um par de tesouras.
- Fazer uma incisão na linha média ao longo do tegumento do pescoço para o nariz para expor o crânio.
- Colocar a ponta de um par de tesouras para a íris forâmen magno de um lado, com cuidado deslizando ao longo da superfície interna do crânio.
- Adicione um corte que se prolonga para a extremidade distai da superfície posterior do crânio, e fazer um corte idêntico no lado contralateral. Limpar o crânio em torno do cerebelo.
- Cuidadosamente descascar o crânio de um lado para evitar danos no cérebro. Repita esteprocedimento no outro lado do cérebro.
- Com uma espátula, cortar os bulbos olfativos e ligações nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro.
- Delicadamente separar o cérebro da cabeça, aparando qualquer dura que ainda conectar o cérebro ao crânio com uma tesoura e retire o cérebro.
- Colocar o cérebro em um frasco de fixador contendo PFA a 4%, pelo menos 10 vezes o volume do cérebro durante 24 h a 4 ° C.
- Desidratar o tecido através de uma série de banhos de etanol graduadas para deslocar a água e, em seguida infiltrado com cera de parafina, formando um bloco. Corte o bloco de parafina com um micrótomo em fatias 4 mm de espessura 21.
- Desparafinar e hidratar as lâminas dos cérebros infectados 22. Avance para hibridização in situ de secções embebidas em parafina.
6. Cérebro preparação de tecido de amostra para cortes congelados
- Remover o cérebro seguindo os passos descritos em 5,1-5,11.
- Para observar as microesferas fluorescentes e M32-EGFP-MCMV, colocar o cérebro ressecado em cryomolds de fundo plano. Adicionar a incorporação meio para cobrir completamente a amostra cérebro. Snap congelar os cryomolds em n-hexano pré-arrefecida (-80 ºC), usando uma pinça para segurar a borda das cryomolds antes de fixar-lo para o mandril.
- Para realizar o corte, conecte o bloco de tecido congelado sobre o mandril criostato pré-resfriado. Transferir o tecido congelado com o mandril em uma câmara de criostato e baixar a temperatura para entre -10 e -20 ° C, e cortar as fatias de cerca de 8-10 mm de espessura 23.
- Fixar as secções com cytofixative (mistura de álcool isopropílico e polietileno glicol) por pulverização. Air secar as secções durante 30 min a RT imediatamente após a pulverização, e armazená-los a - 80 ºC até à sua utilização.
- Equilibrar as secções de volta para a TA e lavar três vezes com PBS.
- Manchar as seções com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) -conjugated Gsimplicifolia B4 riffonia isolectina a uma concentração de 1: 100 durante 10 min em PBS a RT (Figura 5) ou com anticorpo CD31 conjugado com PE a uma concentração de 1: 100 durante 30 min em PBS a RT (Figura 6).
- Lavam-se as secções com PBS três vezes.
- Após a lavagem, coloração das secções com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para visualizar os núcleos das células. Montar as secções de reagente anti-desbotamento e DAPI imagem (excitação a 345 nm, emissão a 455 nm), a EGFP (excitação a 489 nm, emissão a 508 nm), e Vermelho do Nilo (excitação a 553 nm, emissão a 637 nm) com um microscópio de fluorescência (Figuras 3, 5, 6).
7. fluorescente in situ fluorescente (FISH) para embebidos em parafina secções
- Prepare a sonda FISH marcado diretamente com fluoróforo de DNA de hibridização in situ pela tradução nick usando um cromossomo artificial bacteriano contendo toda MCMV DNA genOMe (pSM3fr) 19. A concentração da sonda FISH é de 0,1 ug / ul.
- Desparafinar e hidratar as lâminas dos cérebros infectados 22.
- Tratar as secções de tecido com RNase (100 ug / ml em PBS) para detecção do DNA viral.
- Executar recuperação de antígeno com um NP40 a 0,05%, 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) a 95-98 ° C durante 20 min. Arrefecer as lâminas até à TA durante 20 min.
- Em uma coloração frasco Coplin vidro, lavar as lâminas em água pura três vezes durante 2 minutos de cada vez. Executar um passo adicional de recuperação de antigénio com um pepsina a 0,06%, solução de HCl 0,01 N durante 5 min a 37 ° C.
- Lavar as lâminas três vezes em água pura durante 2 min de cada vez num frasco Coplin coloração de vidro.
- Desidratar as secções de tecido de novo, transferindo as lâminas de 70% de etanol, 85% de etanol, e em seguida a 100% de etanol.
- Para a preparação de 10 ml de tampão de hibridação, mistura de 1,25 ml em sais de hibridação in situ (3 M de NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de fosfato de sódio pH 6,8, EDTA 50 mM) com 5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 50% de sulfato de dextrano, 250 pL de 50x solução de Denhardt, 125 uL de 100 mg / ml de ARNt, e 875 ul de H 2 O.
- Dilui-se a sonda de ADN directamente marcado com fluoróforos que reconhecem todo o genoma MCMV aleatoriamente no tampão de hibridação. O volume final deve ser de 10 ul de tampão de hibridação (7 ul, sonda 1 ul (0,1 ug / uL) e 2 ul de água destilada).
- Adicione a mistura de sonda (10 ul) a cada slide e cobrir com uma lamela (15 × 15 mm). Selar a lamela com cimento de borracha. Desnaturar a sonda mistura durante 5 min a 85 ° C, e completar o passo de hibridação O / N a 42 ° C.
- Lavam-se as lâminas com 0,3% de NP40, SSC 0,4x a 73 ° C durante 2 min; com NP40 a 0,1%, 0,4x SSC a 73 ° C durante 1 min; e com 2x SSC duas vezes.
- Contracoloração os núcleos com DAPI (10 ng / ml) e cubra a lâmina com uma lamela.
- monteas secções de reagente anti-desbotamento e DAPI imagem (excitação a 345 nm, emissão a 455 nm) e a EGFP (excitação a 489 nm, emissão a 508 nm) com um microscópio fluorescente (Figura 4).
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Representative Results
Em estudos sobre a patogénese da encefalite viral, o método de infecção é importante. A via hemática representa uma infecção aguda das células endoteliais e pericitos do cérebro, enquanto o percurso ICV representa uma infecção aguda propagação através do LCR através do espaço subaracnóide, alcançando as meninges e plexo coróide. Para analisar a primeira distribuição de partículas em encefalite aguda, hibridização in situ a detecção dos genomas MCMV e observação directa de partículas M32-EGFP-MCMV ou microesferas fluorescentes foram usadas.
Geração de MCMV recombinante (M32-EGFP-MCMV)
O protocolo ilustra como recombinante M32-GFP-MCMV foi gerado. EGFP foi inserido entre 37089 e 41450 pb (M32-M31 lócus) no genoma do MCMV por recombinação homóloga. Um EGFP protein foi fundida com uma proteína virai (M32) e EGFP foi expresso dentro das partículas virais. Após a recombinação homóloga, uma preparação de vírus foi considerada pura quando todos os focos resultantes da infecção limitante da diluição exibido expressão EGFP, indicando que nenhum vírus de tipo selvagem permaneceu. Pode levar vários procedimentos de diluição para purificar o vírus recombinante. A Figura 1A mostra sinais de EGFP de purificada MCMV recombinante (M32-EGFP-MCMV) e Figura 1B mostra uma imagem TEM de partículas M32-EGFP-MCMV contendo o genoma do vírus no núcleo virai .
Injeção intracerebroventricular e injeção intravascular
A Figura 2 mostra os locais de injecção de rato neonatal (P 0.5) em que o vírus ou microesferas foram injectados através da via ICV ou via IV. Em ICV, o local da injecção é, no ponto médio entrea orelha e o olho, numa localização aproximadamente 0,7 - 1,0 milímetros lateralmente à sutura sagital e 0,7 - 1,0 milímetros caudal a partir da bregma neonatal (Figura 2A). A agulha deve ser injectado no ventrículo lateral 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio (Figura 2B). A Figura 2C e 2D mostram que MCMV ou microesferas são injectados na veia facial temporal dos ratinhos neonatais. Num transiluminador e ampliação óculos são ferramentas úteis para visualizar claramente pequenas veias.
Distribuição de Partículas Virais / Genomas e microesferas fluorescentes
As figuras seguintes mostram a distribuição de partículas virais / genomas e microesferas fluorescentes na fase aguda. A Figura 3 mostra os sinais microbead de secções congeladas do cérebro. A Figura 3A e 3B mostram odistribuição dos 0.1 -. 0,3 uM fluorescentes micropérolas Vermelho do Nilo na área marginal (MA) (figura 3A) e o plexo coróide e zona subventricular (SVZ) (Figura 3B) em 2 horas após a injecção ICV Figura 3C e 3D mostram a distribuição dos 0,1 - 0,3 mm fluorescentes microesferas vermelhas do Nilo no MA e área vascular (Figura 3C) e do plexo coróide e SVZ (Figura 3D) em injeção de 2 horas pós IV. É provável que, após injecção ICV e IV, as partículas não se espalhou uniformemente em toda a imediatamente parênquima. Em vez disso, eles ficaram na SVZ, MA, e na área vascular na fase de infecção aguda. O tamanho das partículas é o factor principal que afecta a sua distribuição no cérebro na fase aguda após injecção ICV e IV. A Figura 4 mostra o peixe do genoma do MCMV nas secções embebidas em parafina do cérebro. O genoma do MCMV (manchas verdes) foi detectado noSVZ a 3 h após a injecção ICV (Figura 4B). Os genomas MCMV (pontos verdes) foram detectados no MA e área vascular às 3 horas após a injecção IV (Figura 4C). A distribuição do MCMV (Figura 4) e microesferas (Figura 3) eram muito semelhantes. A Figura 5 mostra os perfis de distribuição de tamanho dependente de microesferas nas secções congeladas do cérebro após a injecção IV. Micropérolas com diâmetros de 1,7 - 2,2 ^ M (Figura 5B), 0,1 - 0,3 um (Figura 5D), e 0,04-0,06 uM (Figura 5E) são mostrados, respectivamente. Microesferas menores tinham uma tendência para ser extravasado para fora da área vascular no parênquima. A Figura 6 mostra a distribuição de partículas de M32-EGFP-MCMV nas secções congeladas do cérebro. Sinais GFP ponto (partículas M32-EGFP-MCMV) foram observados principalmente no MA (Figura 6A) e plexo coróide e SVZ (
Figura 1:. Geração de partículas recombinante M32-EGFP-MCMV (A) ultracentrifugado M32-EGFP-MCMV são vistas como pontos verdes por microscopia fluorescente. Barra de escala:. 2,4 m (B) Microscopia eletrônica de transmissão revela que partículas M32-EGFP-MCMV possuem uma estrutura vírus típico. Barra de escala: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Locais de Injeção do Rato Neonatal. (A, B) de injecção ICV de 5 ul de MCMV (aproximadamente 5 x 10 5 PFU) ou de 5 micro-esferas ul (cerca de 5,75 x 10 9 partículas). (A) O local de injecção é, no ponto médio entre a orelha e o olho (em um local de aproximadamente 0,7-1,0 mm ao lado da sutura sagital e 0,7 -. 1,0 milímetros caudal a partir da bregma neonatal) (B) a 27 L de agulha com uma seringa de 10 mL é utilizado para a injecção no ventrículo lateral 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio. (C, D) ou MCMV micropérolas são injectados na veia facial temporal dos ratinhos neonatais. (C) (D) Uma seringa de 1 ml com uma agulha 35 G é usado para executar a injeção IV do MCMV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3: Visualização de fluorescentes Nilo microesferas vermelhas no cérebro (A, B) de 0,1 - 0,3 mm sinais micropérolas fluorescentes Vermelho do Nilo (vermelho) são observados na MA (A) e do plexo coróide e SVZ (B) em 2 horas após a injecção ICV (C, D) 0.1 -. 0,3 uM micropérolas fluorescentes vermelho do Nilo introduzidos no cérebro neonatal de rato por injecção IV a injecção de pós 2 horas. microesferas vermelhas do Nilo são observados em the MA e área vascular (C) e do plexo coróide e SVZ (D). O quadrado branco é ampliada na inserção ampliada no canto superior direito de (D) (A, C) Barra de escala:. 50 mm (B, D) Barra de escala:. 150 mm. As setas indicam microesferas vermelhas do Nilo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Distribuição MCMV Genoma no ratinho cérebro a seguir à injecção ICV e IV Injecção (A) A vista inferior de ampliação.. O quadrado branco indica onde a imagem ampliada (B) foi capturado. (B) O genoma MCMV (pontos verdes) é detectado pela primeira vez no SVZ às 3 horas após a injecção ICV. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-fenilindol) é usado para o ácido nuclear nuclear) coloração (. Barra de escala:. 30 um (C) O genoma do MCMV (manchas verdes) é detectada na área vascular e meninges injecção em 12 horas após IV. DAPI é utilizado para a coloração de ácido nuclear. Barra de escala: 30 ^ m. As setas indicam genoma MCMV representante (pontos verdes). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. A relação entre o diâmetro de microesferas e a distribuição das microesferas microesferas vermelho fluorescente nilo (50 ul) são introduzidos no cérebro de ratinho neonato por injecção IV. Em cortes congelados preparados 2 horas após a injecção, os sinais vermelhos do Nilo (vermelho, indicadas pelas setas) são observados e em torno da Vasculárea de ar do parênquima. A área vascular está manchado com lectina fluorescente (verde) (A, B) de 1,7 -.. 2.2 mm microesferas (A) A visão menor ampliação. O quadrado branco indica onde a imagem ampliada (B) foi capturado (B) o quadrado branco é ampliada como a inserção ampliada no canto superior direito de (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 mm microesferas (C) A menor visão de ampliação. O quadrado branco indica onde a imagem ampliada (D) foi capturado (D) o quadrado branco é ampliada como a inserção ampliada no canto superior direito de (D) (E, F) 0.04 -... 0,06 mm microesferas (E) O menor visão de ampliação. O quadrado branco indica onde a imagem ampliada (F) foi capturado. (F) o quadrado branco é ampliada como a inserção ampliada no canto superior direito da
Figura 6: Observação de partículas do vírus na Infecção fase aguda. (A, B) de ponto sinais EGFP (partículas M32-EGFP-MCMV) são observados principalmente no MA (indicado pelas setas; A), plexo coróide e SVZ (indicado pelas setas; B) a 2 horas após a injecção ICV. Os quadrados brancos são ampliados como as inserções ampliada no canto superior direito (A) e (B). Barra de escala:. 20 um (C, D) para a injecção de três horas pós IV, as partículas de MCMV (verde, indicados por setas) são encontrados dentro e fora da área vascularo parênquima (C), plexo coróide, e SVZ (D) (vermelho: células CD31-positivas). Os quadrados brancos são ampliados como as inserções ampliada no canto superior direito (C) e (D). Barra de escala:. 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em modelos animais, ICV, intraperitoneal, placentária directa, infecções e IV têm sido utilizados para estudar a patogénese da encefalite viral. Estamos focados em modelos ICV e injeção IV de ratos neonatal para a simplicidade dos procedimentos e os benefícios da injeção direta de partículas para a região de destino. Embora a infecção intraperitoneal é um método fácil, partículas virais espalhados sistemicamente através de um processo de 5,24 indireta. infecção placentária Direct é um bom método para estudar a infecção sistêmica embrionário. No entanto, este método requer treinamento especial para produzir resultados estáveis e tem uma baixa taxa de sucesso. O método de infecção é também um processo indirecto através da placenta e é difícil controlar a quantidade de injecção no feto em cada ensaio 6. À medida que o rato neonatal é muito susceptível a vírus, tais como CMV, neste estudo, foi possível comparar a distribuição de partículas virais e que a de células infectadas com os primeiros PHAsE de infecção. O modelo de injecção ICV é benéfico para estudar o comportamento infecção que ignora a certificação 25, enquanto que o modelo de infecção IV é um modelo de infecção sistémica, semelhante à infecção natural, incluindo a interacção do vírus com a certificação.
Com o método de injecção ICV, temos a certeza de penetrar pelo menos 2 mm de profundidade no crânio. A agulha foi mantido dentro dos ventrículos cerebrais para cerca de 10 - 20 segundos para evitar o refluxo dos ventrículos 26. Quando feito com cuidado, ICV injeção é um fácil método in vivo e rápido. No entanto, injecções, por vezes imprecisas incluindo refluxo indesejado ou penetração profunda / superficial da agulha para o cérebro pode acontecer. procedimentos cuidadosos e observações após a injecção são necessários para realizar este protocolo com sucesso. Considerando-se os erros de injeção, só incidiu sobre os padrões de distribuição das partículas e não na quantidade, e não observaram os efeitos do tratamento de drogass ou anticorpos funcionais em nosso estudo.
Existem vários procedimentos para executar a injeção IV neonatal murino, através de vários sites como veias superficiais temporais, veia jugular externa, e do seio retro-orbital. A veia temporal superficial do recém-nascido é facilmente visualizado usando uma lente transilluminator e ampliação. A injeção pode ser completada por um único indivíduo experiente, com um alto sucesso rate.We escolheu a veia temporal superficial como o local de injecção IV. O método de injeção IV requer alguma formação como posicionar o mouse neonatal eo procedimento de injeção. O chefe do rato neonatal deve ser posicionado com fita para a veia temporais para estar no topo e plana. A agulha 35 G deve ser inserido dentro do recipiente o suficiente para que a ponta da agulha é completamente rodeado pelo navio. Num transiluminador e ampliação óculos são ferramentas úteis para visualizar claramente pequenas veias. A injeção de grandes volumes de até 100ul deve ser infundida lentamente para confirmar o fluxo do conteúdo. Em caso de falha da injecção na primeira tentativa, o outro lado da veia temporal é disponível para outro ensaio. Após a injeção, os filhotes experimentar desconforto mínimo e recuperar rapidamente. Não está claro por que uma média de um em cada 20 filhotes experimentar grande sofrimento e não se recuperam. No entanto, a baixa taxa de ocorrência desse evento danos minimamente todo o projeto experimental.
Como o método de injeção IV tem uma alta taxa de sucesso (mais de 80%), poderíamos comparar o padrão de distribuição com e sem tratamentos sistémicos, tais como drogas ou anticorpos funcionais. Temos anteriormente conduzida uma experiência em que ratos neonatais foram injectados com anticorpos anti-β1 integrina anticorpos bloqueadores funcionais (50 uL a 20 ug / g), anticorpos de controlo ou de isotipo (50 uL a 20 ug / g) na veia temporal superficial de ratinhos neonatais. Uma hora injecção de anticorpos post, 5 × 106 PFU (50 ul) de MCMV foram infundidas no outro lado da veia temporal. O número de células positivas por MCMV-secção de CD29 anti-rato de hamster (β1 cadeia de integrina, clonar Ha2 / 5) tenha sido tratada com cérebro foram significativamente mais baixos quando comparados com a de isotipo tratados com anticorpo cérebro 8. Usando o mesmo método em futuras investigações, os efeitos das drogas ou anticorpos neutralizantes contra o vírus pode ser determinado por observação da distribuição de partículas virais e as células infectadas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
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