Abstract
I studien på patogenesen av viral encefalitt, er infeksjonen metode kritisk. Den første av de to hovedinfeksjonsveier til hjernen er det hematogenous rute som involverer infeksjon av endotelcellene og pericytes i hjernen. Den andre er intracerebroventrikulær (ICV) rute. Når innenfor det sentrale nervesystemet (CNS), kan virus spre seg til subarachnoid plass, hjernehinnene, og choroid plexus via spinalvæsken. I eksperimentelle modeller, er de tidligste stadiene av CNS viral distribusjon ikke godt karakterisert, og det er uklart om bare visse celler blir først smittet. Her har vi analysert fordelingen av cytomegalovirus (CMV) partikler under den akutte fase av infeksjonen, betegnet primær viremi etter ICV eller intravaskulær (IV) injeksjon i den neonatale mus hjernen. I ICV injeksjons modellen, ble 5 ul murine CMV (mCMV) eller fluorescerende mikrokuler injiseres inn i den laterale ventrikkel i midpoint mellom øret og øyet ved anvendelse av en 10-mL sprøyte med en 27 G nål. I IV-injeksjon modellen, ble en 1 ml sprøyte med en 35 G nål anvendes. En transilluminator ble brukt til å visualisere den overfladiske temporal (ansikts) åre av den neonatale mus. Vi tilført 50 ul mCMV eller fluorescerende mikroperler inn i overfladiske temp blodåre. Hjerner ble innhøstet ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon. MCMV genomer ble påvist ved hjelp av in situ hybridisering metode. Fluorescent mikroperler eller grønt fluorescerende protein uttrykker rekombinante mCMV partiklene ble observert av fluorescerende mikroskopi. Disse teknikkene kan brukes på mange andre patogener for å undersøke patogenesen av encefalitt.
Introduction
Når man studerer viral encefalitt, er den initiale fordeling av virale partikler meget viktig å forstå sykdom patogenese, og å identifisere virale mål i hjernen. De fleste virus varierer i størrelse fra 20 til 300 nm, selv om Pandoravirus er mer enn 700 nm i størrelse 1. Fordelingen av de virale partikler i den akutte fase av infeksjonen kan være avhengig av størrelsen av partiklene, fordelingen av cellulære reseptorer, eller affiniteten av de cellulære reseptorer for virus. I dyremodeller intracerebroventrikulær (ICV), intraperitoneal, direkte placenta, og intravenøs (IV) infeksjoner har blitt brukt til å studere patogenesen av viral encefalitt. ICV inokulering med virus blir ofte brukt til å etablere sentralnervesystemet (CNS) infeksjoner i mus. Studier ved hjelp av denne teknikken rapportere utbredte infeksjoner, særlig av celler i periventrikulær soner og i områder av hjernen i direkte kontakt med cerebrospinalvæske (CSF), Similär til effekten av viral ventriculoencephalitis. Den lille størrelsen på adeno-assosiert virus (AAV) partikler (20 - 25 nm i diameter) letter deres spredning i hele hjernen i ICV infeksjoner 2-4. Intraperitoneal 5, direkte placenta 6, og IV injeksjoner 7 representerer hematogenic systemisk administrasjon. Inntrengning av viruspartikler gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB) gjør det mulig for dem å nå parenchyma av den neonatale hjerne, som representerer diffuse mikrogliaceller knuter 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) er et vanlig virus som tilhører herpesvirusfamilien. I USA, 50% - har 80% av befolkningen hadde CMV infeksjon etter alder 40. CMV infeksjoner er sjelden skadelig, men kan forårsake sykdom hos immunsupprimerte pasienter og fostre. Av alle leveranser, 0,2% - er 2% født med CMV 10, noe som resulterer i alvorlige symptomer som microcephaly, periventrikulær forkalkning, lillehjernen Hypoplasia, micrøyebetennelse, og synsnerven atrofi 11,12. Videre forekomme mental retardasjon, sensorinevralt hørselstap, synsfeil, beslag og epilepsi i ca 10% av ikke-uopprettelige CMV-infiserte spedbarn 13,14. CNS dysfunksjon er den mest vanlige karakteristiske symptomet på CMV medfødt avvik. Flere barn er permanent deaktivert hvert år av medfødt CMV enn ved Down syndrom, føtalt alkoholsyndrom, eller ryggmargsbrokk 15. Det finnes ingen vaksine mot CMV tilgjengelig på det nåværende, ringer for et behov for en trygg og effektiv vaksine. Å studere interaksjonen av CMV-partikler med deres reseptorer i den tidligste fase av infeksjonen er viktig å forstå virkningen av vaksinasjon.
Ventriculoencephalitis og diffuse mikrogliaceller knuter er de to viktigste patologiske kjennetegn ved CMV encefalitt 16. Det har vært usikkert hvor CMV-partikler (150-300 nm) spredd gjennom hjernen i den akutte fase av infeksjonen ennd hvordan fordelingen av cellulære reseptorer og deres affinitet for virus bidra til viral spredning. Kawasaki et al. Har evaluert ICV og IV infeksjoner fra perspektivet av fordelingen av partiklene og deres reseptorer (β1 integrin) i den tidligste fase av infeksjonen. Vi har funnet at spredning av CMV-partikler og ekspresjonen av integrin β1 er godt korrelert i den tidligste fase av infeksjonen i både ICV og IV infeksjoner 8. ICV infeksjon er en modell av ventriculoencephalitis og IV infeksjon er en modell av diffuse mikrogliaceller knuter. Studerer dynamikken i virale eller fluorescerende partikler vil gi nyttig informasjon om effekten av partikkelstørrelse, viral interaksjon med cellulære reseptorer, og mekanismen for BBB penetrasjon i hjernen. Den følgende protokoll kan benyttes for å undersøke eventuelle virusinfeksjoner og virusvektor i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøksprotokoller ble godkjent av Animal Care komité Hamamatsu University of School of Medicine.
1. Utarbeidelse av mCMV (Smith stamme) og rekombinant M32-forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) -MCMV
- Generer rekombinant M32-EGFP-mCMV henhold til fremgangsmåten som følger (1.2 til 1.9), og som tidligere beskrevet 8.
- Bruke rekombinante virus utledet fra Smith-stamme av villtype mCMV (deponeringsnummer: U68299). Sett EGFP (4,361 basepar, bp) mellom 37 089 og 41 450 bp (M32 - M31 locus) i mCMV genomet ved homolog rekombinasjon.
- Amplifisere ved polymerasekjedereaksjon mCMV M32 (41 450 - 39 286 bp, venstre flankerende sekvens og M31 (37 089 - 39 246 bp, til høyre flankerende sekvens genloci ved å bruke de følgende primere: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(fremover primer), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(Revers primer); M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3' (fremover primer), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(revers primer).
- Sett M32 locus inn i EGFP-uttrykke vektor ved hjelp NheI og BamHI restriksjonssetene. Sett M31 locus inn i M32-EGFP -recombinant plasmid hjelp AflII og Xbal nettsteder. Spalter M32 - EGFP - M31 sekvens med Nhel og AflII fra M32 - EGFP - M31 rekombinasjon plasmid og løses i H 2 O.
- Transfektere spaltes konstruksjonen i kjerner av mCMV (Smith-stamme) -infected NIH3T3-celler 24 timer etter infeksjon (hpi) ved hjelp av en electroporation system for å indusere homolog rekombinasjon.
- 3 dager etter infeksjon, ko-kultur av cellene med uinfiserte mus embryonale fibroblaster (MEFs) ved et forhold på 1 / 1.000 i seks-brønns plater og skjerm for EGFP-uttrykk foci av infiserte celler.
- Harvest virus-inneholdende supernatanter fra brønnene inneholdende grønn fluorescerende foci og fortynnet tidobbelt. For rensing, velger brønner som viser enkle grønne fluorescerende foci.
- Når alt foci som følge av begrensende fortynning infeksjon skjerm EGFP uttrykk, er det virus-preparat ren, noe som indikerer at ingen villtypevirus forblir. Kvantifisere viruset ved plakk-assay-metoden som tidligere beskrevet 17.
- Unn mCMV i sertifiserte biosikkerhet skap på biosikkerhetsnivå 2 iført hansker og maske.
- Passasje mCMV (Smith-stamme) og rekombinant mCMV i MEFs fremstilt fra 12-dager gamle ICR-mus embryoer som tidligere beskrevet 17.
- Fjerne celler fra supernatantene av infiserte MEF kulturene ved sentrifugering ved 3000 x g i 20 minutter ved 16 ° C.
- Ultrasentrifuge supernatantene i 40 min ved 70000 x g. Resuspender pelleten inneholdende virioner i 1 ml tris-bufret saltvann og overføre til en forhåndsdannet lineært sorbitol gradient (25% - 70%). Ultrasentrifuge på nytt ved 70 000 x g i 60 minutter 18.
- Høste virion-inneholdende bånd med en sprøyte. Pellet høstet viruspartikler med ytterligere ultracentrifugation skritt 70000 x g i 40 minutter.
- Resuspender pelleten i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) og oppbevares ved -80 ° C inntil de smitteforsøk.
- Kvantifisere virustiter ved plakk-assay-metoden som beskrevet tidligere 19.
- Visual EGFP ekspresjon av de rekombinante mCMV partikler (eksitasjon ved 489 nm, emisjon ved 508 nm) av fluorescerende mikroskopi (figur 1A), og partikkelstruktur ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 8 (figur 1B).
2. Utarbeidelse av Nile Red Fluorescent mikro
- Kjøps karboksyl fluorescerende Nile røde mikroperler og legg 500 mL av mikroperler i rør ifølge diameter (0,04- 0,06 mikrometer, ca 3,63 × 10 12 partikler; 0,1 til 0,3 mikrometer, ca 5,75 × 10 10 partikler; og 1,7 til 2,2 pm, omtrent 6,85 x 10 7-partikler).
- Behandle perler med 500 mL av 0,1 M NaOH i ca. en dag for å fjerne endotoksiner og resuspender perler i sterilt vann ved RT.
- Adsorberes perlene O / N med 10% museserum erholdt fra C57BL / 6-mus ved romtemperatur før bruk.
- For å skille aggregater, vortex perlene og sonicate grundig før bruk.
3. ICV Injeksjon av mCMV og Fluorescent mikro inn Neonatal Mus
- Opprettholde normale gravide ICR mus i et temperaturkontrollert anlegg under en 12 timers lys / mørke syklus. Den nyfødte er utpekt som P 0,5 på dagen av fødselen.
- Sterilisere en 10-mL sprøyte og en 27 G nål med 70% alkohol.
- Last injeksjonsoppløsningen (5 mL) som inneholder mCMV eller fluorescerende mikroperler inn nålen ved å trekke sprøytestempelet.
- Beherske neonatal mus (P 0,5) ved å sette musen på isen for 3-4 min. Når dyret er under narkose ved å bruke tå-klemme respons metode for å bestemme dybden av anestesi.
- Mark injeksjonsstedet med en ikke-giftig laboratorium penn på et sted ca 0,7 til 1,0 mm lateralt for sagittal sutur og 0,7 til 1,0 mm hale fra nyfødt bregma (figur 2A).
- Sett nålen 2 mm dype, vinkelrett på skalleoverflaten på den merkede injeksjonsstedet. For referanse, merk 2 mm fra spissen av nålen med en ikke-giftig maker.
- Sakte injisere 5 ul av mCMV (ca. 5 x 10 5 PFU) inn i den laterale ventrikkel uten å åpne hodebunnen (figur 2B).
- I en annen gruppe av mus, injiserer en 5 ul oppløsning inneholdende fluorescerende mikroperler (0,1 til 0,3 um, ca. 5,75 x 10 8-partikler) avden samme metode.
- Sakte fjerne nålen 10-20 sek etter seponering stempelet bevegelse for å hindre tilbakestrømning.
- For å komme seg, holde musene i 5 - 10 min i en varm beholder til bevegelse og generell respons er gjenopprettet.
- Høste hjerner som beskrevet i kapittel 5 på en rekke tidspunkter (3, 12, 24, 48, og 72 hr) etter injeksjonen.
4. IV Injeksjon av mCMV eller Fluorescent mikro inn Neonatal Mus
- Beherske neonatal mus (P 0,5) ved å sette musen på isen for 3-4 min.
- Bruke en 1 ml sprøyte med en 35 G nål for å utføre den intravenøse injeksjon av mCMV i P 0,5 nyfødte.
- Bruk en transilluminator (vene finder) for å visualisere den overfladiske temporal (ansikts) blodåre. Før injeksjon sikre den nyfødte til transilluminator ved hjelp av kirurgisk tape (figur 2C).
- Mens bruk forstørrelsesglass (1,5 X), sakte sette 50 ul mCMV (ca. 5,45 ×; 10 9 partikler) eller fluorescerende mikroperler (0,04 - 0,06 mikrometer, ca 3,63 × 10 11 partikler; 0,1 - 0,3 mikrometer, ca 5,75 × 10 9 partikler, og 1,7 - 2,2 mikrometer, ca 6,85 × 10 6 partikler) i den overfladiske temp blodåre (figur 2D).
- Når nålen er fjernet, kan du bruke gasbind som inneholder 70% alkohol for å legge press på injeksjonsstedet inntil blødningen opphører.
- Gi den nyfødte ca 5 min i en varm beholder for å gjenopprette før det sendes til buret.
- Høste hjerner som beskrevet i kapittel 5 på en rekke tidspunkter (3, 12, 24 og 72 timer) etter injeksjon.
5. hjernevev Prøvepreparering for parafinsnitt
- Plasser de injiserte nyfødte i en liten plastskål på knust is.
- Når dyret er under narkose ved å bruke tå-klemme respons metode for å bestemme dybden av anesthesia.
- Gjør ett sentralt eller to end horisontale ende skjærer gjennom brystkassen for å åpne opp brysthulen.
- Lag et kutt i atrium med skarp saks. Sette mot 4% paraformaldehyde (PFA) løsning inn i atriet. Stopp perfusjon når spontan bevegelse (PFA dans) og lettet-farge på leveren blir fulgt. Ikke exsanguinate.
- Dissekere den nyfødte (som tidligere beskrevet 20) ved først å fjerne hodet ved hjelp av en saks.
- Lag en midtlinjen snitt langs integument fra halsen til nesen for å avsløre skallen.
- Plasser den spisse enden av et par av iris saks til foramen magnum på den ene side, forsiktig glir langs den indre overflate av skallen.
- Lag et kutt som strekker seg til den fjerne kant av bakre skalleoverflaten, og lage en identisk kutt på motsatt side. Fjerne skallen rundt lillehjernen.
- Nøye skallet tilbake skallen på den ene side for å hindre skade på hjernen. Gjenta detteprosedyren på den andre side av hjernen.
- Ved hjelp av en spatel, bryte olfactory knoller og nervøse forbindelser langs den ventrale overflaten av hjernen.
- Forsiktig skille hjernen fra hodet, trimming noen dura som fortsatt koble hjernen til skallen med saks, og fjerne hjernen.
- Plasser hjernen i en ampulle med fikseringsmiddel inneholdende 4% PFA minst 10 ganger volumet av hjernen i 24 timer ved 4 ° C.
- Dehydrere vevet gjennom en serie av graderte etanol bad for å fortrenge vann, og deretter infiltrere med parafinvoks og danner en blokk. Skjær parafin blokk med en mikrotom i skiver 4 mikrometer tykke 21.
- Deparaffinize og rehydrere lysbilder av de infiserte hjerner 22. Fortsett til in situ hybridisering for parafin innebygde deler.
6. hjernevev Prøvepreparering for frysesnitt
- Fjern hjernen å følge trinnene i 05.01 til 05.11.
- Å observere fluorescerende mikro og M32-EGFP-mCMV, plasser resected hjernen på flat bunn cryomolds. Legg innstøpningsmediet til fullstendig å dekke hjernen prøven. Snap fryse cryomolds i forkjølt n-heksan (-80 ºC), ved hjelp av pinsett til å holde kanten av cryomolds før du fester den til chucken.
- For seksjonering, feste den frosne vevsblokk på forkjølt kryostat chuck. Overfør det frosne vev med chucken til en cryostat kammer og senke temperaturen til mellom -10 og -20 ° C, og skjære skiver ca. til 8 - 10 um tykke 23.
- Fest seksjoner med cytofixative (blanding av isopropylalkohol og polyetylenglykol) ved sprøyting. Air tørke delene i 30 min ved RT umiddelbart etter sprøyting, og lagre dem på - 80 ºC inntil videre bruk.
- Ekvilibrere delene tilbake til romtemperatur og vaskes tre ganger med PBS.
- Flekk seksjoner med fluorescein (FITC) -konjugert Griffonia simplicifolia isolectin B4 ved en konsentrasjon på 1: 100 i 10 minutter i PBS ved romtemperatur (figur 5) eller med PE-konjugert CD31-antistoff ved en konsentrasjon på 1: 100 i 30 minutter i PBS ved romtemperatur (figur 6).
- Vask seksjoner med PBS tre ganger.
- Etter vasking, flekken seksjonene med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å visualisere cellekjerner. Monter delene i anti-fade reagent og bilde DAPI (eksitasjon ved 345 nm, emisjon ved 455 nm), EGFP (eksitasjon ved 489 nm, emisjon ved 508 nm), og Nilen rød (eksitasjon ved 553 nm, emisjon ved 637 nm) med et fluorescerende mikroskop (figurene 3, 5, 6).
7. Fluorescent in situ hybridisering (FISH) for Parafin Embedded Seksjoner
- Klargjør FISH probe merket direkte med fluorophore for DNA in situ hybridisering av nick oversettelse ved hjelp av en bakteriell kunstig kromosom inneholder hele mCMV DNA genome (pSM3fr) 19. Konsentrasjonen av FISH sonden er 0,1 ug / ul.
- Deparaffinize og rehydrere lysbilder av de infiserte hjerner 22.
- Behandle vevet seksjoner med RNase (100 ug / ml i PBS) for å detektere virale DNA.
- Utføre antigen gjenfinning med en 0,05% NP40, 0,01 M sitratbuffer (pH 6,0) ved 95-98 ° C i 20 min. Kjøl lysbildene ned til RT i 20 min.
- I et glass Coplin flekker krukke, vask lysbildene i rent vann tre ganger i 2 min hver gang. Utføre et ytterligere antigen henting trinn med en 0,06% pepsin, 0,01 N HCl-løsning i 5 minutter ved 37 ° C.
- Skyll glir tre ganger i rent vann i 2 min hver gang i en glass Coplin flekker krukke.
- Dehydrere vevssnittene igjen ved å overføre lysbilder fra 70% etanol til 85% etanol, og deretter til 100% etanol.
- For fremstilling av 10 ml av hybridiseringsbuffer, bland 1,25 ml in situ hybridisering alter (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCI pH 8,0, 100 mM natriumfosfat, pH 6,8, 50 mM EDTA) med 5 ml deionisert formamid, 2,5 ml 50% dekstransulfat, 250 pl 50x Denhardfs oppløsning, 125 pl 100 mg / ml tRNA, og 875 pl H2O
- Fortynn DNA-probe direkte merket med fluoroforer som gjenkjenner hele mCMV genomet tilfeldig i hybridiseringsbuffer. Sluttvolumet bør være 10 ul (7 mL hybridiseringsbuffer, 1 pl probe (0,1 ug / ul), og 2 pl destillert vann).
- Legg sonden mix (10 mL) til hvert lysbilde og dekk med et dekkglass (15 × 15 mm). Tett dekkglass med gummi sement. Denaturere sonde blandingen i 5 min ved 85 ° C, og fullfører hybridiseringstrinnet O / N ved 42 ° C.
- Vask objektglassene med 0,3% NP40, 0,4x SSC ved 73 ° C i 2 minutter; med 0,1% NP40, 0,4x SSC ved 73 ° C i 1 min; og med 2x SSC to ganger.
- Counterstain kjernene med DAPI (10 ng / ml) og dekke lysbilde med et dekkglass.
- Mountdelene i anti-fade-reagens og bilde DAPI (eksitasjon ved 345 nm, emisjon ved 455 nm) og EGFP (eksitasjon ved 489 nm, emisjon ved 508 nm) med et fluorescerende mikroskop (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I studier av patogenesen av viral encefalitt, er smittemåte viktig. Den hematogenous rute utgjør en akutt infeksjon av endotelcellene og pericytes av hjernen, mens den ICV rute utgjør en akutt infeksjon sprer seg via CSF gjennom subarachnoid plass, rekker til hjernehinnene og choroid plexus. For å analysere den første fordelingen av partiklene i akutte hjernebetennelse, in situ hybridisering detektere mCMV genomer og direkte observasjon av M32-EGFP-mCMV partikler eller fluorescerende mikrokuler ble anvendt.
Generering av Rekombinant mCMV (M32-EGFP-mCMV)
Protokollen illustrerer hvordan rekombinant M32-GFP-mCMV ble generert. EGFP ble innsatt mellom 37 089 og 41 450 bp (M32-M31 locus) i mCMV-genomet ved homolog rekombinasjon. En EGFP protein ble smeltet sammen med et viralt protein (M32) og EGFP ble uttrykt i løpet av de viruspartikler. Etter homolog rekombinasjon, ble en virus-preparat anses ren når alt brennpunkter som følge av begrensende fortynning infeksjon vist EGFP ekspresjon, noe som indikerer at ingen villtypevirus var tilbake. Det kan ta flere fortynning fremgangsmåter for å rense det rekombinante virus. Figur 1A viser EGFP signaler med renset rekombinant mCMV (M32-EGFP-mCMV) og figur 1B viser et TEM-bilde av M32-EGFP-mCMV partikler inneholdende det virusgenomet i det virale kjerne .
Intracerebroventrikulær Injeksjon og intravaskulær injeksjon
Figur 2 viser injeksjons av neonatal mus (P 0.5) der virus eller mikro ble injisert gjennom ICV ruten eller IV ruten. I ICV, er injeksjonsstedet på midtpunktet mellomøret og øyet, på et sted ca 0,7 - 1,0 mm lateralt for sagittal sutur og 0,7 - 1,0 mm hale fra nyfødt bregma (figur 2A). Nålen bør injiseres inn i den laterale ventrikkel 2 mm dype, vinkelrett på skalleoverflaten (figur 2B). Figur 2C og 2D viser at mCMV eller mikroperlene blir injisert inn i den tidsmessige ansikts vene av neonatale mus. En transilluminator og forstørrelsesglass er nyttige verktøy for å tydelig visualisere små årer.
Fordelingen av viruspartikler / genomer og Fluorescent mikro
Følgende figurer viser fordelingen av virale partikler / genomer og fluorescerende mikrokuler i den akutte fasen. Figur 3 viser mikroperlen signalene fra frosne snitt av hjernen. Figur 3A og 3B viserfordeling av 0,1 -. 0,3 um fluorescerende Nil-rødt-mikroperler i det marginale området (MA) (Figur 3A) og choroid plexus og subventricular sone (SVZ) (figur 3B) ved 2 timer etter ICV injeksjon figur 3C og 3D viser fordelingen av 0,1 - 0,3 mikrometer fluorescerende Nile røde mikroperler i MA og vaskulær område (figur 3C) og årehinnen plexus og SVZ (figur 3D) på 2 timer etter iv injeksjon. Det er sannsynlig at etter ICV og IV-injeksjon, partikler ikke umiddelbart spres jevnt over hele parenchyma. Nei, de bodde i SVZ, MA, og vaskulær område i den akutte infeksjonen fasen. Størrelsen av partiklene er den primære faktoren som påvirker deres fordeling i hjernen i den akutte fasen følgende ICV og IV-injeksjon. Figur 4 viser FISH av mCMV-genomet på parafin innleiret deler av hjernen. MCMV genomet (grønne flekker) ble påvist iSVZ på tre timer etter ICV injeksjon (figur 4B). MCMV genomer (grønne prikker) ble påvist i MA og vaskulær område på tre timer etter IV injeksjon (Figur 4C). Fordelingen av mCMV (figur 4) og mikrokuler (figur 3) var ganske like. Figur 5 viser den størrelsesavhengige fordelingsmønster av mikroperler i de frosne deler av hjernen etter IV-injeksjon. Mikroperler med diameter 1,7 - 2,2 um (figur 5B), 0,1 til 0,3 um (figur 5D), og 0,04 til 0,06 pm (figur 5E) er vist henholdsvis. Mindre mikroperler hadde en tendens til å bli ekstravasert ut av det vaskulære området i parenchyma. Figur 6 viser fordelingen av M32-EGFP-mCMV-partikler i de frosne deler av hjernen. GFP dot signaler (M32-EGFP-mCMV partikler) ble hovedsakelig observert i MA (Figur 6A) og choroid plexus og SVZ (
Figur 1:. Generering av rekombinant M32-EGFP-mCMV (A) ultrasentrifugert M32-EGFP-mCMV partikler blir sett på som grønne flekker av fluorescerende mikroskopi. Skala:. 2,4 mikrometer (B) Transmisjonselektronmikroskopi viser at M32-EGFP-mCMV partikler har en typisk virus struktur. Skala: 77 nm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: injeksjonssteder i Neonatal Mouse. (A, B) ICV injeksjon av 5 ul mCMV (ca. 5 x 10 5 PFU) eller av 5 pl mikroperler (ca. 5,75 × 10 9 partikler). (A) Injeksjonsstedet er på midtpunktet mellom øret og øyet (på et sted omtrent 0,7 - 1,0 mm lateralt for sagittal sutur og 0,7 -. 1,0 mm kaudalt fra neonatal bregma) (B) A 27 G nål med en 10-mL sprøyte brukes for injeksjon i den laterale ventrikkel 2 mm dyp, vinkelrett på skallen overflaten. (C, D) mCMV eller mikroperlene blir injisert inn i den tidsmessige ansikts vene av neonatale mus. (C) (D) A 1 ml sprøyte med en 35 G nål brukes til å utføre IV injeksjon av mCMV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 3: Visualisering av Fluorescent Nile Red mikroperler i hjernen (A, B) 0,1 - 0,3 mikrometer fluorescerende Nile røde mikrosignaler (rød) er observert i MA (A) og årehinnen plexus og SVZ (B) på 2 timer post injeksjon ICV (C, D) 0,1 -. 0,3 um fluorescerende Nil-rødt mikrokuler innføres i den neonatale mus hjernen ved intravenøs injeksjon på 2 timer etter injeksjon. Nile røde mikroperler er observert i the MA og vaskulært område (C) og choroid plexus og SVZ (D). Den hvite firkanten er forstørret i et utvidet innsatsen i øverst til høyre (D) (A, C) Skala:. 50 mikrometer (B, D) Skala:. 150 mikrometer. Pilene viser Nile røde mikroperler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mCMV Genome Distribution i Mouse Brain Etter ICV Injeksjon og IV injeksjon (A) lavere forstørrelse visning.. Den hvite firkanten viser hvor det forstørrede bildet (B) ble tatt til fange. (B) mCMV genomet (grønne flekker) er først oppdaget i SVZ på tre timer etter ICV injeksjon. DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-fenylindol) brukes for kjernesyre (atom) farging. Skala:. 30 mikrometer (C) mCMV genomet (grønne flekker) er oppdaget i den vaskulære området og hjernehinnene på 12 timer etter IV injeksjon. DAPI brukes for nukleær syre farging. Skala: 30 mikrometer. Pilene viser representative mCMV genomet (grønne flekker). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Forholdet mellom diameter mikroperler og distribusjon av mikro Fluorescent Nilen røde mikroperler (50 mL) blir innført i neonatale mus hjernen ved IV injeksjon. I frossen seksjoner utarbeidet to timer etter injeksjon, Nile røde signaler (rød, angitt med piler) er observert i og rundt vascular område av parenchyma. Vaskulær Området er farget med fluorescerende lectin (grønn) (A, B) 1,7 -.. 2,2 mikrometer mikroperler (A) lavere forstørrelse visning. Den hvite firkanten viser hvor det forstørrede bildet (B) ble tatt til fange (B) Den hvite firkanten forstørres som forstørret innsatsen i øverst til høyre (B) (C, D) 0,1 -... 0,3 mikrometer mikroperler (c) lavere forstørrelse visning. Den hvite firkanten viser hvor det forstørrede bildet (D) ble tatt til fange (D) Den hvite firkanten forstørres som forstørret innsatsen i øverst til høyre (D) (E, F) 0,04 -... 0,06 mikrometer mikroperler (E) på lavere forstørrelse visning. Den hvite firkanten viser hvor det forstørrede bildet (F) ble tatt til fange. (F) Den hvite firkanten forstørres som forstørret innsatsen i øverst til høyre på
Figur 6: Observasjon av viruspartikler i akutt infeksjon fase. (A, B) EGFP punktsignaler (M32-EGFP-mCMV partikler) er hovedsakelig observert i MA (antydet med pilene, A), choroid plexus, og SVZ (angitt med piler, B) på to timer etter injeksjon ICV. De hvite rutene er forstørret som forstørrede innstikk i øverst til høyre (A) og (B). Skala:. 20 mikrometer (C, D) På tre timer etter IV injeksjon, er mCMV partikler (grønn, som markeres med piler) funnet på innsiden og utsiden av vaskulær områdetparenchyma (C), choroid plexus, og SVZ (D) (red: CD31-positive celler). De hvite rutene er forstørret som forstørrede innstikk i øverst til høyre (C) og (D). Skala:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dyremodeller, ICV, intraperitoneal, direkte placenta og IV-infeksjoner har blitt brukt til å studere patogenesen av viral encefalitt. Vi fokuserte på ICV og IV injeksjon modeller av neonatal mus for enkelhet av prosedyrene og fordelen av direkte injeksjon av partikler i målområdet. Selv intraperitoneal infeksjon er en enkel metode, viruspartikler spres systemisk via en indirekte prosess 5,24. Direkte placenta infeksjon er en god metode for å studere embryonale systemisk infeksjon. Men denne metoden krever spesiell opplæring for å gi stabile resultater og har en lav suksessrate. Infeksjonen Fremgangsmåten er også en indirekte prosess via morkaken, og det er vanskelig å kontrollere mengden av injeksjon inn i fosteret ved hvert forsøk 6. Som den neonatale mus er meget utsatt for virus som for eksempel CMV, i denne studien kunne vi sammenligner fordelingen av virale partikler og som av infiserte celler ved de meget tidlige phase av infeksjon. Den ICV injeksjon modellen er fordelaktig å studere oppførselen infeksjon som omgår BBB 25, mens IV infeksjonsmodell er en systemisk infeksjon modell som ligner naturlig infeksjon, inkludert interaksjonen av viruset med BBB.
Med ICV injeksjon metode, vi sørget for å trenge minst 2 mm dypt inn i skallen. Nålen ble holdt inne i cerebrale ventriklene i ca 10-20 sek for å hindre tilbakestrømning fra ventriklene 26. Når gjøres forsiktig, er ICV injeksjon en rask og enkel in vivo metode. Men noen ganger unøyaktige injeksjoner inkludert uønsket tilbakestrømning eller dyp / grunt gjennomtrenging av nålen til hjernen kan skje. Nøye prosedyrer og observasjoner etter injeksjon er pålagt å utføre denne protokollen vellykket. Vurderer injeksjon feil, vi bare fokusert på distribusjon mønstre av partiklene og ikke på kvantitet, og ikke observere behandlingseffekter av narkotikas eller funksjonelle antistoffer i vår studie.
Det er flere prosedyrer for å utføre murine neonatal IV injeksjon, gjennom flere nettsteder som overfladiske time årer, ytre halsvenen, og retro-orbital sinus. Den overfladiske temporal vein av nyfødte er lett visualisert ved hjelp av en transilluminator og forstørrelse objektivet. Injeksjon kan gjennomføres av en enkelt erfaren person med en høy suksess rate.We valgte overfladiske temp blodåre som stedet for IV injeksjon. Den IV injeksjon metoden krever litt trening som for eksempel å plassere neonatal mus og injeksjonsprosedyren. Leder av neonatal mus bør plasseres med tape for den time blodåre for å være på topp og flat. Den 35 G nål skal settes inn i beholderen så langt at spissen av nålen er helt omgitt av fartøyet. En transilluminator og forstørrelsesglass er nyttige verktøy for å tydelig visualisere små årer. Injeksjon av store volum opp til 100ul skal infuseres langsomt for å bekrefte strømmen av innholdet. I tilfelle av svikt i injeksjons ved første forsøk, den andre siden av tinning vene er tilgjengelig for en annen rettssak. Etter injeksjon, unger opplever minimal nød og komme seg raskt. Det er ikke klart hvorfor et gjennomsnitt på ett av 20 unger opplever stor nød, og ikke gjenopprette. Men den lave frekvensen av forekomsten av denne hendelsen minimalt skader hele eksperimentell design.
Som IV-injeksjon fremgangsmåte har en høy suksessrate (mer enn 80%), kan vi sammenligner fordelingsmønsteret med og uten systemiske behandlinger som legemidler eller funksjonelle antistoffer. Vi har tidligere foretatt et eksperiment hvor neonatale mus ble injisert med anti-β1 integrin funksjonsblokkerende antistoffer (50 ul ved 20 ug / g) eller isotype kontroll-antistoff (50 ul ved 20 ug / g) i den overfladiske tidsmessige blodåre av neonatale mus. Én time etter antistoff injeksjon, 5 × 106 PFU (50 ul) av mCMV ble infusert inn i den andre siden av den temporale venen. Antallet av mCMV-positive celler per seksjon av hamster-anti-rotte-CD29 (β1 integrinkjeden, klone Ha2 / 5) -behandlet hjerne var signifikant lavere når man sammenligner med den av isotype antistoff-behandlede hjerne 8. Ved å bruke samme metode som i fremtidige undersøkelser, kan effekten av legemidler eller nøytraliserende antistoffer mot virus bestemmes ved å observere fordelingen av virale partikler og infiserte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
