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Neuroscience

नवजात मस्तिष्क में वायरल कणों और फ्लोरोसेंट microbeads की Intracerebroventricular और Intravascular इंजेक्शन

Published: July 24, 2016 doi: 10.3791/54164
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1
1Department of Regenerative & Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine, 2First Department of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 3Faculty of Health Science, Tokoha University

Abstract

वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन पर अध्ययन में, संक्रमण विधि महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क के लिए दो मुख्य मार्गों संक्रामक के पहले hematogenous मार्ग है, जो endothelial कोशिकाओं और मस्तिष्क के pericytes के संक्रमण शामिल है। दूसरी Intracerebroventricular (आईसीवी) मार्ग है। एक बार जब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर, वायरस subarachnoid अंतरिक्ष, तानिका, और मस्तिष्कमेरु द्रव के माध्यम से रंजित जाल में फैल सकता है। प्रयोगात्मक मॉडल में, सीएनएस वायरल वितरण के शुरुआती दौर में अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं, और यह स्पष्ट नहीं है कि केवल कुछ कोशिकाओं शुरू संक्रमित हैं। यहाँ, हम संक्रमण के तीव्र चरण के दौरान cytomegalovirus (सीएमवी) कणों के वितरण का विश्लेषण किया है, प्राथमिक viremia करार दिया, नवजात माउस मस्तिष्क में आईसीवी या intravascular (चतुर्थ) इंजेक्शन के बाद। आईसीवी इंजेक्शन मॉडल में, murine सीएमवी (इन क्षेत्रों में एमसीएमवी) या फ्लोरोसेंट microbeads के 5 μl midpoi में पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया गयाNT कान और आंख एक 27 जी सुई के साथ एक 10 μl सिरिंज का उपयोग कर के बीच। चतुर्थ इंजेक्शन मॉडल में, एक 35 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का इस्तेमाल किया गया था। एक transilluminator सतही लौकिक (चेहरे) नवजात माउस की नस कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम सतही लौकिक नस में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या फ्लोरोसेंट microbeads के 50 μl संचार। दिमाग अलग अलग समय बिंदुओं के बाद इंजेक्शन पर काटा गया। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम सीटू संकरण विधि में उपयोग करते हुए पाया गया। फ्लोरोसेंट microbeads या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन पुनः संयोजक इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों व्यक्त फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया। इन तकनीकों में इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन जांच करने के लिए कई अन्य रोगाणुओं के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

जब वायरल इन्सेफेलाइटिस का अध्ययन, वायरल कणों की प्रारंभिक वितरण रोग रोगजनन समझने के लिए और मस्तिष्क में वायरल लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अधिकांश वायरस, 20 से 300 एनएम से आकार में सीमा हालांकि Pandoravirus आकार 1 में अधिक से अधिक 700 एनएम है। संक्रमण की तीव्र चरण में वायरल कणों के वितरण के कणों के आकार, सेलुलर रिसेप्टर्स के वितरण, या वायरस के लिए सेलुलर रिसेप्टर्स की आत्मीयता पर निर्भर हो सकता है। पशु मॉडल, Intracerebroventricular (आईसीवी), intraperitoneal, प्रत्यक्ष अपरा, और नसों (चतुर्थ) के संक्रमण वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है में। वायरस से आईसीवी टीका अक्सर चूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के संक्रमण को स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग विशेष रूप से अध्ययन periventricular क्षेत्रों में कोशिकाओं की और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), simila के साथ सीधे संपर्क में मस्तिष्क के क्षेत्रों में व्यापक संक्रमण की रिपोर्टवायरल ventriculoencephalitis के प्रभाव के लिए आर। एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) कणों के छोटे आकार (20 ​​- व्यास में 25 एनएम) आईसीवी संक्रमण के 2-4 में मस्तिष्क भर में उनके प्रचार-प्रसार की सुविधा। इंट्रापेरिटोनियल 5, प्रत्यक्ष अपरा 6, और चतुर्थ इंजेक्शन 7 hematogenic प्रणालीगत प्रशासन प्रतिनिधित्व करते हैं। रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​के माध्यम से वायरल कणों की पैठ उन्हें नवजात मस्तिष्क के पैरेन्काइमा तक पहुंचने के लिए, फैलाना microglial पिंड 8,9 का प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देता है।

साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) एक आम वायरस है कि दाद वायरस परिवार से संबंध रखता है। संयुक्त राज्य अमेरिका में 50% - लोगों के 80% से 40 सीएमवी संक्रमण को शायद ही कभी हानिकारक हैं लेकिन immunocompromised रोगियों और भ्रूण में रोगों का कारण बन सकती उम्र से सीएमवी संक्रमण पड़ा है। सभी प्रसव के 0.2% - 2%, सीएमवी 10 के साथ पैदा होते हैं ऐसे microcephaly, periventricular कड़ा हो जाना, अनुमस्तिष्क hypoplasia, माइकर के रूप में गंभीर लक्षण है, जिसके परिणामस्वरूपआफ़्टलमीय, और ऑप्टिक तंत्रिका शोष 11,12। इसके अलावा, मानसिक मंदता, sensorineural सुनवाई हानि, दृश्य दोष, जब्ती, और मिर्गी गैर-प्राणघातक रूप से सीएमवी से संक्रमित शिशुओं 13,14 के बारे में 10% में होते हैं। सीएनएस में शिथिलता सीएमवी जन्मजात विसंगति का सबसे आम लक्षण लक्षण है। अधिक बच्चों को स्थायी रूप से डाउन सिंड्रोम, भ्रूण शराब सिंड्रोम, या द्विमेरुता 15 द्वारा की तुलना में जन्मजात सीएमवी द्वारा प्रत्येक वर्ष अक्षम हैं। वहाँ एक सुरक्षित और प्रभावी वैक्सीन की जरूरत के लिए बुला सीएमवी के खिलाफ कोई टीकाकरण वर्तमान में उपलब्ध हैं। संक्रमण का जल्द से जल्द चरण में उनकी रिसेप्टर्स के साथ सीएमवी कणों की बातचीत का अध्ययन टीकाकरण के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Ventriculoencephalitis और फैलाना microglial पिंड दो सीएमवी की मुख्य विशेषताओं रोग इन्सेफेलाइटिस 16 हैं। यह अनिश्चित हो गया है कि कैसे सीएमवी कणों (150 - 300 एनएम) संक्रमण एक की तीव्र चरण में मस्तिष्क के माध्यम से फैलएन डी कैसे सेलुलर रिसेप्टर्स के वितरण और वायरस के लिए उनके संबंध वायरल प्रसार के लिए योगदान करते हैं। कावासाकी एट अल। आईसीवी और कणों और उनके रिसेप्टर्स (β1 इंटीग्रिन) संक्रमण की जल्द से जल्द चरण में के वितरण के नजरिए से चतुर्थ में संक्रमण का मूल्यांकन किया है। हमने पाया है कि सीएमवी कणों और β1 इंटीग्रिन की अभिव्यक्ति के प्रचार-प्रसार में अच्छी तरह से दोनों आईसीवी और चतुर्थ में संक्रमण 8 में संक्रमण की जल्द से जल्द चरण में सहसंबद्ध होते हैं। आईसीवी संक्रमण ventriculoencephalitis का एक मॉडल है और चतुर्थ संक्रमण फैलाना microglial पिंड का एक मॉडल है। वायरल या फ्लोरोसेंट कणों की गतिशीलता के अध्ययन के कण आकार, सेलुलर रिसेप्टर्स के साथ वायरल बातचीत, और मस्तिष्क में बीबीबी प्रवेश के तंत्र के प्रभाव पर उपयोगी जानकारी देना होगा। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सीएनएस में किसी भी वायरल संक्रमण और वायरल वेक्टर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के स्कूल ऑफ मेडिसिन के हमामात्सू विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (स्मिथ तनाव) और संयोजक की तैयारी M32-बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) -MCMV

  1. विधि के अनुसार पुनः संयोजक M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी उत्पन्न के रूप में (1.2 - 1.9) के बाद और के रूप में पहले 8 का वर्णन किया।
  2. जंगली प्रकार इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (: U68299 परिग्रहण संख्या) के स्मिथ तनाव से निकाली गई पुनः संयोजक वायरस का प्रयोग करें। सम्मिलित EGFP (4361 आधार जोड़े, बीपी) 37,089 और 41,450 के बीच बीपी - मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम में (M32 M31 ठिकाना)।
  3. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा बढ़ाना इन क्षेत्रों में एमसीएमवी M32 (41,450 - 39,286 बीपी, flanking अनुक्रम और M31 (37089 शेष - 39,246 बीपी, सही निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग flanking अनुक्रम जीन लोकी: M32, 5'-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT -3 '(आगे प्राइमर), 5 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(प्राइमर रिवर्स), M31, 5'-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA -3' (आगे प्राइमर), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(प्राइमर रिवर्स)।
  4. EGFP व्यक्त वेक्टर NheI और BamHI प्रतिबंध साइटों का उपयोग करने में M32 ठिकाना डालें। M32-EGFP में M31 ठिकाना डालें -recombinant AflII और XbaI साइटों का उपयोग प्लाज्मिड। फोड़ना M32 - EGFP - EGFP - - NheI और M32 से AflII साथ M31 M31 अनुक्रम पुनर्संयोजन प्लाज्मिड और एच 2 ओ में भंग
  5. इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (स्मिथ तनाव) के नाभिक में cleaved निर्माण transfect मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रेरित करने के लिए एक प्रणाली का उपयोग electroporation NIH3T3 कोशिकाओं -infected 24 घंटा के बाद संक्रमण (एचपीआई)।
  6. 3 दिन के बाद संक्रमण, सह संस्कृति छह अच्छी तरह प्लेटें में 1/1000 की एक अनुपात और संक्रमित कोशिकाओं के EGFP व्यक्त foci के लिए स्क्रीन पर असंक्रमित माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) के साथ कोशिकाओं पर।
  7. Harveहरी फ्लोरोसेंट foci युक्त कुओं से सेंट वायरस युक्त supernatants और दस गुना पतला। शुद्धि के लिए, कुओं कि एकल हरी फ्लोरोसेंट foci प्रदर्शित चुनें।
  8. सभी foci सीमित कमजोर पड़ने संक्रमण प्रदर्शन EGFP अभिव्यक्ति से उत्पन्न होता है, वायरस तैयारी शुद्ध है, यह दर्शाता है कि कोई जंगली प्रकार के वायरस बनी हुई है। पट्टिका-परख विधि द्वारा वायरस यों के रूप में पहले 17 में वर्णित है।
  9. जैव सुरक्षा स्तर 2 पर प्रमाणित जैव सुरक्षा अलमारियाँ दस्ताने और मास्क पहनने में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी समझो।
  10. पैसेज इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (स्मिथ तनाव) और 12 दिन पुरानी आईसीआर माउस भ्रूण से तैयार MEFs में पुनः संयोजक इन क्षेत्रों में एमसीएमवी के रूप में पहले 17 में वर्णित है।
  11. संक्रमित MEF संस्कृतियों के supernatants से कोशिकाओं को 16 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3000 × छ centrifugation द्वारा निकालें।
  12. Ultracentrifuge 70,000 × छ पर 40 मिनट के लिए supernatants। Tris बफर खारा के 1 मिलीलीटर में virions युक्त छर्रों Resuspend और एक preformed रेखीय रों पर स्थानांतरितorbitol ढाल (25% - 70%)। 60 मिनट के लिए 18 ultracentrifuge फिर से 70,000 एक्स जी।
  13. एक सिरिंज के साथ विरिअन युक्त बैंड हार्वेस्ट। 40 मिनट के लिए कम से 70,000 × छ एक अतिरिक्त ultracentrifugation कदम से काटा virions गोली।
  14. संक्रमण प्रयोगों जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और दुकान के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend।
  15. पट्टिका-परख विधि द्वारा वायरस अनुमापांक यों के रूप में पहले 19 में वर्णित है।
  16. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) 8 (चित्रा 1 बी) द्वारा कण संरचना से (489 एनएम, 508 एनएम पर उत्सर्जन में उत्तेजना) पुनः संयोजक इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों की EGFP अभिव्यक्ति कल्पना।

2. नील लाल फ्लोरोसेंट microbeads की तैयारी

  1. क्रय carboxyl फ्लोरोसेंट नील लाल microbeads और व्यास के अनुसार ट्यूबों में microbeads के 500 μl जगह (0.04- 0.06 माइक्रोन, लगभग 3.63 × 10 12 कणों; 0.1 - 0.3 माइक्रोन, लगभग 5.75 × 10 10 कणों; और 1.7 - 2.2 माइक्रोन, लगभग 6.85 × 10 7 कण)।
  2. लगभग 1 दिन के लिए 0.1 एम NaOH के 500 μl के साथ मोती समझो किसी भी endotoxins हटाने और आरटी पर बाँझ पानी में मोती resuspend।
  3. मोती हे / एन 10% माउस आरटी पर C57BL / 6 चूहों से प्राप्त उपयोग करने से पहले सीरम के साथ सोखना।
  4. समुच्चय, भंवर मोती अलग है और उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से sonicate करने के लिए।

नवजात चूहों में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी और फ्लोरोसेंट microbeads 3. आईसीवी इंजेक्शन

  1. एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत एक तापमान नियंत्रित सुविधा में सामान्य गर्भवती आईसीआर चूहों को बनाए रखें। नवजात शिशुओं का जन्म दिन पर पी 0.5 के रूप में नामित कर रहे हैं।
  2. एक 10 μl सिरिंज और 70% शराब के साथ एक 27 जी सुई जीवाणुरहित।
  3. इंजेक्शन समाधान (5 μl) इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या फ्लोरोसेंट सूक्ष्म युक्त लोडध्यान से सिरिंज के सवार खींच कर सुई में मोती।
  4. 4 मिनट - 3 के लिए बर्फ पर माउस डाल द्वारा नवजात माउस (पी 0.5) को नियंत्रित। एक बार जानवर संज्ञाहरण के तहत है, संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करने के लिए पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करें।
  5. मार्क एक स्थान लगभग 0.7 पर एक गैर विषैले प्रयोगशाला कलम के साथ इंजेक्शन साइट - 1.0 मिमी बाण सिवनी और 0.7 के लिए पार्श्व - नवजात शीर्षस्थान (2A चित्रा) से 1.0 मिमी दुम।
  6. सुई उल्लेखनीय इंजेक्शन स्थल पर 2 मिमी गहरी, खोपड़ी की सतह के लिए सीधा डालें। संदर्भ के लिए, एक गैर विषैले निर्माता के साथ सुई की नोक से 2 मिमी निशान।
  7. धीरे-धीरे खोपड़ी (चित्रा 2 बी) को खोलने के बिना इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (लगभग 5 × 10 5 pfu) पार्श्व वेंट्रिकल में से 5 μl इंजेक्षन।
  8. द्वारा - (0.3 माइक्रोन, लगभग 5.75 × 10 8 कणों 0.1) चूहों के एक और समूह में, एक 5 μl फ्लोरोसेंट microbeads युक्त समाधान इंजेक्षनएक ही तरीका है।
  9. सवार आंदोलन को बंद backflow को रोकने के बाद 20 सेकंड - धीरे सुई 10 को हटा दें।
  10. ठीक 5 के लिए चूहों को रखने के लिए - एक गर्म कंटेनर में 10 मिनट तक आंदोलन और सामान्य जवाबदेही बहाल कर रहे हैं।
  11. समय अंक (3, 12, 24, 48, और 72 घंटा) के बाद इंजेक्शन की एक श्रृंखला में धारा 5 में वर्णित के रूप में दिमाग हार्वेस्ट।

नवजात चूहों में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या फ्लोरोसेंट microbeads 4. चतुर्थ इंजेक्शन

  1. 4 मिनट - 3 के लिए बर्फ पर माउस डाल द्वारा नवजात माउस (पी 0.5) को नियंत्रित।
  2. 0.5 नवजात शिशुओं पी में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी की नसों में इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए एक 35 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें।
  3. सतही लौकिक (चेहरे) नस कल्पना करने के लिए एक transilluminator (नस खोजक) का प्रयोग करें। इंजेक्शन से पहले, transilluminator सर्जिकल टेप (चित्रा -2) का उपयोग करने के लिए नवजात शिशु को सुरक्षित।
  4. जबकि आवर्धक चश्मा पहने हुए (1.5X), धीरे-धीरे इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (लगभग 5.45 × 50 μl दिखे; 10 9 कण) या फ्लोरोसेंट microbeads (0.04 - 0.06 माइक्रोन, लगभग 3.63 × 10 11 कणों, 0.1 - 0.3 माइक्रोन, लगभग 5.75 × 10 9 कणों, और 1.7 - 2.2 माइक्रोन, लगभग 6.85 × 10 6 कण) सतही लौकिक नस में (चित्रा 2 डी)।
  5. सुई को हटाने के बाद, 70% अल्कोहल युक्त धुंध का उपयोग करें जब तक खून बह रहता है इंजेक्शन साइट के लिए दबाव लागू करने के लिए।
  6. नवजात शिशु लगभग 5 में एक गर्म कंटेनर पिंजरे के लिए लौटने से पहले ठीक करने के लिए मिनट दीजिए।
  7. समय अंक (3, 12, 24, और 72 घंटा) के बाद इंजेक्शन की एक श्रृंखला में धारा 5 में वर्णित के रूप में दिमाग हार्वेस्ट।

आयल वर्गों के लिए 5. मस्तिष्क के ऊतकों नमूना तैयार

  1. कुचल बर्फ पर एक छोटे से प्लास्टिक डिश में इंजेक्शन नवजात शिशुओं रखें।
  2. एक बार जानवर संज्ञाहरण के तहत है, anesthes की गहराई का निर्धारण करने के लिए पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया विधि का उपयोगमैं एक।
  3. वक्ष गुहा को खोलने के लिए रिब पिंजरे के माध्यम से एक केंद्रीय या दो अंत क्षैतिज अंत कटौती करें।
  4. तेज कैंची के साथ आलिंद में कटौती करें। दिखे 4% paraformaldehyde (पीएफए) आलिंद में समाधान। छिड़काव बंद करो जब जिगर का सहज आंदोलन (पीएफए ​​नृत्य) और हल्का रंग मनाया जाता है। रक्तहीन मत करो।
  5. नवजात शिशु (के रूप में पहले से वर्णित 20) काटना पहले कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर को हटाने के द्वारा।
  6. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए नाक को गर्दन से आवरण के साथ एक midline चीरा।
  7. एक तरफ रंध्र मैग्नम में आईरिस कैंची की एक जोड़ी के तेज अंत प्लेस, ध्यान से खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ फिसलने।
  8. एक कट पीछे खोपड़ी की सतह के बाहर किनारे करने के लिए का विस्तार करें, और contralateral ओर एक समान कटौती करते हैं। दूर स्पष्ट सेरिबैलम के आसपास खोपड़ी।
  9. ध्यान से मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए एक तरफ खोपड़ी वापस छील। इस दोहराएँमस्तिष्क के दूसरे पक्ष पर प्रक्रिया।
  10. एक रंग का प्रयोग, मस्तिष्क के उदर सतह के साथ घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन तोड़।
  11. धीरे सिर से मस्तिष्क को अलग, किसी भी ड्यूरा है कि अभी भी खोपड़ी कैंची का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क कनेक्ट है, और मस्तिष्क को हटा दें trimming।
  12. 4% पीएफए ​​4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मस्तिष्क के कम से कम 10 गुना मात्रा युक्त लगानेवाला की एक शीशी में मस्तिष्क रखें।
  13. पानी विस्थापित करने के लिए वर्गीकृत इथेनॉल स्नान की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊतक निर्जलीकरण, और फिर पैराफिन मोम के साथ घुसपैठ, एक ब्लॉक के गठन। स्लाइस 4 माइक्रोन मोटी 21 में एक microtome साथ पैराफिन ब्लॉक में कटौती।
  14. Deparaffinize और संक्रमित दिमाग 22 की स्लाइड्स rehydrate। आयल एम्बेडेड वर्गों के लिए सीटू संकरण में करने के लिए आगे बढ़ें।

जमे हुए वर्गों के लिए 6. मस्तिष्क के ऊतकों नमूना तैयार

  1. 5.1 में उल्लिखित चरणों का पालन मस्तिष्क निकालें - 5.11।
  2. फ्लोरोसेंट microbeads और M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी का निरीक्षण करने के लिए, फ्लैट नीचे cryomolds पर उच्छेदन मस्तिष्क जगह है। मध्यम embedding पूरी तरह से मस्तिष्क नमूना कवर करने के लिए जोड़ें। स्नैप precooled n -hexane (-80 डिग्री सेल्सियस) में cryomolds फ्रीज, चक करने के लिए संलग्न करने के लिए संदंश का उपयोग से पहले cryomolds के किनारे धारण करने के लिए।
  3. के लिए सेक्शनिंग, precooled cryostat चक पर जमे हुए ऊतक ब्लॉक देते हैं। एक cryostat कक्ष में चक के साथ जमे हुए ऊतक स्थानांतरण और -10 और -20 के बीच डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम, और स्लाइस लगभग 8 कटौती - 10 माइक्रोन मोटी 23।
  4. छिड़काव द्वारा cytofixative (isopropyl शराब और पॉलीथीन ग्लाइकोल का मिश्रण) के साथ वर्गों को ठीक करें। एयर तुरंत छिड़काव के बाद आरटी पर 30 मिनट के लिए वर्गों सूखी, और उन पर स्टोर - आगे उपयोग करें जब तक 80 डिग्री सेल्सियस।
  5. वर्गों वापस आरटी को संतुलित और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  6. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) जी संयुग्मित के साथ वर्गों दाग1 की एकाग्रता में बी 4 isolectin riffonia simplicifolia: 100 आरटी पर पीबीएस में 10 मिनट के लिए (चित्रा 5) या पीई संयुग्मित CD31 एंटीबॉडी के साथ 1 की एकाग्रता में: 100 आरटी पर पीबीएस में 30 मिनट के लिए (चित्रा 6)।
  7. पीबीएस तीन बार के साथ वर्गों को धो लें।
  8. धोने के बाद, सेल नाभिक कल्पना करने के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ वर्गों दाग। , EGFP (489 एनएम पर उत्तेजना, 508 एनएम पर उत्सर्जन) (345 एनएम, 455 एनएम पर उत्सर्जन में उत्तेजना) विरोधी फीका अभिकर्मक और छवि DAPI में वर्गों माउंट, और नील लाल (553 एनएम पर उत्तेजना, 637 एनएम पर उत्सर्जन) एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ (आंकड़े 3, 5, 6)।

आयल एम्बेडेड वर्गों के लिए बगल में संकरण (मछली) में 7. फ्लोरोसेंट

  1. एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र डीएनए पूरे इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जनरल युक्त का उपयोग कर मछली जांच सीधे निक अनुवाद के द्वारा स्वस्थानी संकरण में डीएनए के लिए fluorophore के साथ लेबल तैयारome (pSM3fr) 19। मछली जांच की एकाग्रता 0.1 माइक्रोग्राम / μl है।
  2. Deparaffinize और संक्रमित दिमाग 22 की स्लाइड्स rehydrate।
  3. वायरल डीएनए का पता लगाने के RNase (100 माइक्रोग्राम / पीबीएस में एमएल) के साथ ऊतक वर्गों समझो।
  4. 98 डिग्री 20 मिनट के लिए सी - एक 0.05% NP40, 0.01 एम साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) में 95 में से प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करना। 20 मिनट के लिए आरटी के लिए नीचे स्लाइड कूल।
  5. एक गिलास Coplin धुंधला जार में, 2 मिनट प्रत्येक समय के लिए तीन बार शुद्ध पानी में स्लाइड्स धो लें। एक 0.06% पेप्सिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.01 एन एचसीएल समाधान के साथ एक अतिरिक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम प्रदर्शन।
  6. कुल्ला एक गिलास Coplin धुंधला जार में हर बार 2 मिनट के लिए शुद्ध पानी में तीन बार स्लाइड।
  7. 70% इथेनॉल से स्लाइड के हस्तांतरण से फिर से ऊतक वर्गों निर्जलीकरण 85% इथेनॉल के लिए, और फिर 100% इथेनॉल के लिए।
  8. संकरण बफर के 10 मिलीलीटर की तैयारी के लिए, सीटू संकरण लवण (3 एम NaCl, 100 मिमी Tris में 1.25 मिलीलीटर मिश्रण-HCl पीएच 8.0, 100 मिमी सोडियम फास्फेट पीएच 6.8, 50 मिमी EDTA) 5 मिलीलीटर विआयनीकृत formamide साथ, 2.5 मिलीलीटर 50% dextran सल्फेट, 250 μl 50x Denhardt के समाधान, 125 μl 100 मिलीग्राम / एमएल tRNA, और 875 μl एच 2 ओ
  9. सीधे fluorophores कि संकरण बफर में बेतरतीब ढंग से पूरे जीनोम इन क्षेत्रों में एमसीएमवी को पहचान के साथ लेबल डीएनए जांच पतला। अंतिम मात्रा 10 μl (7 μl संकरण बफर, 1 μl जांच (0.1 माइक्रोग्राम / μl), और 2 μl आसुत जल) होना चाहिए।
  10. जांच के मिश्रण (10 μl) प्रत्येक स्लाइड में जोड़ें और एक coverslip (15 × 15 मिमी) के साथ कवर। रबर सीमेंट के साथ coverslip सील। 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जांच मिश्रण denature, और 42 डिग्री सेल्सियस पर संकरण कदम हे / एन पूरा करें।
  11. 2 मिनट के लिए 73 डिग्री सेल्सियस पर 0.3% NP40, 0.4x एसएससी के साथ स्लाइड्स धो लें; 0.1% NP40, 1 मिनट के लिए 73 डिग्री सेल्सियस पर 0.4x एसएससी के साथ; और 2x एसएससी के साथ दो बार।
  12. DAPI (10 एनजी / एमएल) और एक coverslip के साथ स्लाइड कवर के साथ नाभिक Counterstain।
  13. पर्वतएक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) के साथ विरोधी फीका अभिकर्मक और छवि DAPI (345 एनएम पर उत्तेजना, 455 एनएम पर उत्सर्जन) और EGFP (489 एनएम पर उत्तेजना, 508 एनएम पर उत्सर्जन) में वर्गों।

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Representative Results

वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन पर अध्ययन में, संक्रमण विधि महत्वपूर्ण है। जबकि आईसीवी मार्ग एक तीव्र संक्रमण, subarachnoid अंतरिक्ष के माध्यम से सीएसएफ के माध्यम से फैल रहा तानिका और रंजित जाल तक पहुँचने का प्रतिनिधित्व करता है hematogenous मार्ग, endothelial कोशिकाओं और मस्तिष्क के pericytes की एक तीव्र संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। पहले इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम और M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों या फ्लोरोसेंट microbeads के प्रत्यक्ष अवलोकन का पता लगाने के स्वस्थानी संकरण में तीव्र इन्सेफेलाइटिस में कणों का वितरण, विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

संयोजक इन क्षेत्रों में एमसीएमवी की पीढ़ी (M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी)

प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे पुनः संयोजक M32-GFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी उत्पन्न किया गया था। EGFP मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम में 37,089 और 41,450 बीपी (M32-M31 ठिकाना) के बीच डाला गया था। एक EGFP पीrotein एक वायरल प्रोटीन (M32) के साथ जुड़े हुए किया गया था और EGFP वायरल कणों के भीतर व्यक्त की गई थी। मुताबिक़ पुनर्संयोजन के बाद, एक वायरस तैयारी शुद्ध माना जाता था जब सभी foci सीमित कमजोर पड़ने संक्रमण से उत्पन्न EGFP अभिव्यक्ति दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि कोई जंगली प्रकार के वायरस बने रहे। यह पुनः संयोजक वायरस को शुद्ध करने के लिए कई प्रक्रियाओं कमजोर पड़ने लग सकता है। चित्रा 1 ए शुद्ध रीकॉम्बीनैंट इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी) की EGFP संकेतों से पता चलता है और चित्रा 1 बी वायरल जीनोम कोर में वायरस युक्त M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों का एक मंदिर छवि से पता चलता है ।

Intracerebroventricular इंजेक्शन और Intravascular इंजेक्शन

चित्रा 2 नवजात माउस (पी 0.5) जहां वायरस या microbeads आईसीवी मार्ग या चतुर्थ मार्ग के माध्यम से इंजेक्शन थे इंजेक्शन साइटों से पता चलता है। आईसीवी में, इंजेक्शन साइट के बीच मध्य में हैकान और आंख, एक स्थान पर लगभग 0.7 - नवजात शीर्षस्थान (2A चित्रा) से 1.0 मिमी दुम - 1.0 मिमी बाण सिवनी और 0.7 के लिए पार्श्व। सुई पार्श्व वेंट्रिकल 2 मिमी गहरी, खोपड़ी की सतह। (चित्रा 2 बी) चित्रा -2 और 2 डी को सीधा चलता है कि इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या microbeads नवजात चूहों के अस्थायी चेहरे की नस में इंजेक्शन कर रहे हैं में इंजेक्ट किया जाना चाहिए। एक transilluminator और शीशा चश्मा सहायक उपकरण स्पष्ट रूप से छोटे नसों कल्पना करने के लिए कर रहे हैं।

वायरल कणों / जीनोम और फ्लोरोसेंट microbeads का वितरण

निम्नलिखित आंकड़े वायरल कणों / जीनोम और तीव्र चरण में फ्लोरोसेंट microbeads का वितरण दिखा। चित्रा 3 से पता चलता मस्तिष्क के जमे हुए वर्गों के microbead का संकेत है। चित्रा 3 ए और 3 बी दिखाने0.1 का वितरण -। 0.3 माइक्रोन फ्लोरोसेंट नील लाल सीमांत क्षेत्र में microbeads (एमए) (चित्रा 3 ए) और रंजित जाल और subventricular क्षेत्र (SVZ) (चित्रा 3 बी) 2 घंटा के बाद आईसीवी इंजेक्शन पर चित्रा -3 सी और 3 डी वितरण दिखा 0.3 माइक्रोन फ्लोरोसेंट नील लाल एमए और नाड़ी क्षेत्र (चित्रा 3 सी) और रंजित जाल और SVZ (चित्रा 3 डी) में 2 घंटा के बाद चतुर्थ इंजेक्शन पर microbeads - 0.1 की। यह संभावना है कि, आईसीवी और चतुर्थ इंजेक्शन के बाद, कण तुरंत समान रूप से पैरेन्काइमा भर में फैल नहीं किया है। बल्कि, वे SVZ, एमए, और तीव्र संक्रमण चरण में नाड़ी क्षेत्र में रुके थे। कणों के आकार प्राथमिक कारक आईसीवी और चतुर्थ इंजेक्शन के बाद तीव्र चरण में मस्तिष्क में उनके वितरण प्रभावित हो रहा है। चित्रा 4 मस्तिष्क के आयल एम्बेडेड वर्गों पर इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम की मछली से पता चलता है। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम (हरे धब्बे) में पाया गया थाSVZ 3 घंटा के बाद आईसीवी इंजेक्शन पर (चित्रा 4 बी)। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम (हरे धब्बे) 3 घंटा के बाद चतुर्थ इंजेक्शन (चित्रा 4C) में एमए और नाड़ी क्षेत्र में पाया गया। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (चित्रा 4) और microbeads (चित्रा 3) का वितरण काफी समान थे। चित्रा 5 चतुर्थ इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क की जमी वर्गों में microbeads के आकार पर निर्भर वितरण पैटर्न से पता चलता है। 2.2 माइक्रोन (चित्रा 5 ब), 0.1 - - 0.3 माइक्रोन (चित्रा 5 डी), और 0.04 - व्यास 1.7 के साथ microbeads 0.06 माइक्रोन (चित्रा 5E) क्रमश दिखाए जाते हैं। छोटे microbeads की प्रवृत्ति पैरेन्काइमा में नाड़ी क्षेत्र से बाहर extravasated किया जाना था। चित्रा 6 मस्तिष्क के जमे हुए वर्गों में M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों के वितरण से पता चलता। GFP डॉट संकेतों (M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कण) मुख्य रूप से एमए (चित्रा 6A) में मनाया गया और रंजित जाल और SVZ ( एनजी> 2 घंटा के बाद आईसीवी इंजेक्शन पर चित्रा 6B)। इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों के अंदर और पैरेन्काइमा (चित्रा 6C) और रंजित जाल और SVZ (चित्रा 6D) की नाड़ी क्षेत्र के बाहर पाए गए। M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों के लिए, extravagation की दर नाड़ी क्षेत्र से बाहर तानिका और मस्तिष्क के पैरेन्काइमा में से रंजित जाल में अधिक था, यह दर्शाता है कि एमए और रंजित जाल के जहाजों के उन लोगों की तुलना में अधिक प्रवेश के योग्य हैं पैरेन्काइमा।

आकृति 1
चित्रा 1:। संयोजक M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (ए) Ultracentrifuged M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों की पीढ़ी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा हरे रंग के धब्बे के रूप में देखा जाता है। स्केल पट्टी:। 2.4 माइक्रोन (बी) के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पता चलता है कि M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों एक विशिष्ट वायरस की संरचना के पास है। स्केल पट्टी: 77 एनएम।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: नवजात माउस का इंजेक्शन साइटों। (ए, बी) 5 μl इन क्षेत्रों में एमसीएमवी (लगभग 5 × 10 5 pfu) या 5 μl microbeads (लगभग 5.75 × 10 9 कण) की आईसीवी इंजेक्शन। (ए) इंजेक्शन साइट (कम से कान और आंख के बीच मध्य में है एक स्थान लगभग 0.7 - 1.0 मिमी बाण सिवनी और 0.7 के लिए पार्श्व -। नवजात शीर्षस्थान से 1.0 मिमी दुम) (बी) के एक 10 μl सिरिंज के साथ एक 27 जी सुई, 2 मिमी गहरी पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है खोपड़ी की सतह को सीधा। (सी, डी) इन क्षेत्रों में एमसीएमवी या microbeads नवजात चूहों के अस्थायी चेहरे की नस में इंजेक्शन कर रहे हैं। (सी) (डी) एक 1 मिलीलीटर एक 35 जी सुई के साथ सिरिंज इन क्षेत्रों में एमसीएमवी के चतुर्थ इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। चित्रा 3: मस्तिष्क में फ्लोरोसेंट नील लाल microbeads के दृश्य (ए, बी) 0.1 - 0.3 माइक्रोन फ्लोरोसेंट नील लाल microbeads संकेतों (लाल) 2 घंटा में एमए (ए) और रंजित जाल और SVZ (बी) में मनाया जाता है पोस्ट आईसीवी इंजेक्शन (सी, डी) 0.1 -। 0.3 माइक्रोन फ्लोरोसेंट नील लाल microbeads 2 घंटा के बाद इंजेक्शन पर चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा नवजात माउस मस्तिष्क में पेश किया। नील लाल microbeads वीं में मनाया जाता हैई एमए और नाड़ी क्षेत्र (सी) और रंजित जाल और SVZ (डी)। सफेद वर्ग (डी) के ऊपर सही में बढ़े डालने में बढ़ाया है (ए, सी) स्केल पट्टी:। 50 माइक्रोन (बी, डी) स्केल पट्टी:। 150 माइक्रोन। तीर से संकेत मिलता नील लाल microbeads। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: आईसीवी इंजेक्शन और चतुर्थ इंजेक्शन के बाद माउस मस्तिष्क में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम वितरण (ए) कम बढ़ाई देखें।। सफेद वर्ग इंगित करता है जहां बढ़ाया छवि (बी) पर कब्जा कर लिया गया था। (बी) इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम (हरे धब्बे) पहले 3 घंटा के बाद आईसीवी इंजेक्शन पर SVZ में पता चला है। DAPI (4 ';, 6-diamidino-2-phenylindole) परमाणु एसिड (परमाणु) धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है। स्केल पट्टी:। 30 माइक्रोन (सी) इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम (हरे धब्बे) नाड़ी क्षेत्र और 12 घंटा के बाद चतुर्थ इंजेक्शन पर तानिका में पता चला है। DAPI परमाणु एसिड धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है। स्केल पट्टी: 30 माइक्रोन। तीर प्रतिनिधि इन क्षेत्रों में एमसीएमवी जीनोम (हरे धब्बे) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Microbeads के व्यास और microbeads के वितरण के बीच रिश्ता फ्लोरोसेंट नील लाल microbeads (50 μl) चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा नवजात माउस दिमाग में पेश कर रहे हैं। जमे हुए वर्गों में 2 घंटा के बाद इंजेक्शन, नील लाल संकेतों (लाल, तीर द्वारा संकेत) तैयार में और Vascul आसपास मनाया जाता हैपैरेन्काइमा की गिरफ्तारी के क्षेत्र। । संवहनी क्षेत्र फ्लोरोसेंट लेक्टिन (हरा) (ए, बी) 1.7 के साथ दाग है -। 2.2 माइक्रोन microbeads (ए) कम बढ़ाई देखें। सफेद वर्ग इंगित करता है जहां बढ़ाया छवि (बी) पर कब्जा कर लिया गया था (बी) के सफेद वर्ग (बी) के ऊपर सही में बढ़े डालने के रूप में बढ़ाया है (सी, डी) 0.1 -।।। 0.3 माइक्रोन microbeads (सी) कम बढ़ाई देखें। सफेद वर्ग इंगित करता है जहां बढ़ाया छवि (डी) पर कब्जा कर लिया गया था (डी) सफेद वर्ग (डी) के ऊपर सही में बढ़े डालने के रूप में बढ़ाया है (ई, एफ) 0.04 -।।। 0.06 माइक्रोन microbeads (ई) कम बढ़ाई देखें। सफेद वर्ग इंगित करता है जहां बढ़ाया छवि (एफ) पर कब्जा कर लिया गया था। (एफ) सफेद वर्ग के ऊपर सही में बढ़े डालने के रूप में बढ़ाया है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: तीव्र संक्रमण चरण में वायरस कणों का अवलोकन। (ए, बी) EGFP डॉट संकेतों (M32-EGFP-इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कण) मुख्य रूप से एमए में मनाया जाता है (तीर द्वारा संकेत; ए), रंजित जाल, और SVZ (तीर द्वारा संकेत, बी) 2 घंटा पर पोस्ट आईसीवी इंजेक्शन। सफेद चौकों (ए) और (बी) के ऊपर सही में बढ़े सम्मिलित रूप में बढ़ाया जाता है। स्केल पट्टी:। 20 माइक्रोन (सी, डी) 3 घंटा के बाद चतुर्थ इंजेक्शन में इन क्षेत्रों में एमसीएमवी कणों (हरे, तीर द्वारा संकेत) की नाड़ी क्षेत्र के अंदर और बाहर पाए जाते हैंपैरेन्काइमा (सी), रंजित जाल, और SVZ (डी) (लाल: CD31 पॉजिटिव कोशिकाओं)। सफेद चौकों (सी) और (डी) के ऊपर सही में बढ़े सम्मिलित रूप में बढ़ाया जाता है। स्केल पट्टी:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पशु मॉडल, आईसीवी, intraperitoneal, प्रत्यक्ष अपरा, और चतुर्थ के संक्रमण में वायरल इन्सेफेलाइटिस के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम प्रक्रियाओं की सादगी और लक्ष्य क्षेत्र में कणों के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लाभ के लिए नवजात चूहों के आईसीवी और चतुर्थ इंजेक्शन मॉडल पर ध्यान केंद्रित किया। हालांकि intraperitoneal संक्रमण एक आसान तरीका है, वायरल कणों एक अप्रत्यक्ष प्रक्रिया के माध्यम से 5,24 प्रणालीबद्ध फैल गया। प्रत्यक्ष अपरा संक्रमण भ्रूण प्रणालीगत संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तरीका है। हालांकि, इस पद्धति विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता स्थिर परिणाम उपज के लिए और एक कम सफलता दर है। संक्रमण विधि भी अपरा के माध्यम से एक अप्रत्यक्ष प्रक्रिया है और यह प्रत्येक परीक्षण 6 पर भ्रूण में इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। जैसा कि नवजात माउस बहुत ऐसे सीएमवी के रूप में वायरस के लिए अतिसंवेदनशील है, इस अध्ययन में हम वायरल कणों के वितरण और संक्रमित कोशिकाओं की है कि बहुत जल्दी phas पर तुलना कर सकते हैंसंक्रमण के ई। जबकि चतुर्थ संक्रमण मॉडल एक प्रणालीगत संक्रमण मॉडल BBB के साथ वायरस की बातचीत सहित प्राकृतिक संक्रमण जैसी है आईसीवी इंजेक्शन मॉडल, संक्रमण व्यवहार कि BBB 25 नजरअंदाज अध्ययन करने के लिए फायदेमंद है।

आईसीवी इंजेक्शन विधि के साथ, हम खोपड़ी में गहरी कम से कम 2 मिमी घुसना करने के लिए सुनिश्चित कर दिया। सुई के बारे में 10 के लिए मस्तिष्क निलय के अंदर रखा गया था - 20 सेकंड निलय 26 से backflow को रोकने के लिए। जब ध्यान से किया, आईसीवी इंजेक्शन एक तेज और इन विवो विधि में आसान है। हालांकि, अवांछित backflow या मस्तिष्क के लिए सुई हो सकता है की गहरी / उथले पैठ सहित कभी कभी गलत इंजेक्शन। सावधान प्रक्रियाओं और टिप्पणियों के बाद इंजेक्शन इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं। इंजेक्शन त्रुटियों को ध्यान में रखते हुए, हम केवल कणों की और मात्रा पर नहीं वितरण पैटर्न पर ध्यान केंद्रित, और नशीली दवाओं के उपचार प्रभाव का पालन नहीं किया हैया हमारे अध्ययन में कार्यात्मक एंटीबॉडी।

वहाँ कई प्रक्रियाओं ऐसी सतही लौकिक नसों, बाहरी गले नस, और रेट्रो कक्षीय साइनस के रूप में murine नवजात चतुर्थ इंजेक्शन, कई साइटों के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं। नवजात शिशु की सतही लौकिक नस आसानी से एक transilluminator और बढ़ाई लेंस का उपयोग करके कल्पना की है। इंजेक्शन एक उच्च सफलता rate.We चतुर्थ इंजेक्शन के स्थल के रूप में सतही लौकिक नस चुना है के साथ एक एकल अनुभवी व्यक्ति द्वारा पूरा किया जा सकता। चतुर्थ इंजेक्शन पद्धति ऐसी स्थिति नवजात माउस और इंजेक्शन प्रक्रिया के रूप में कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता है। नवजात माउस के सिर टेप के साथ तैनात किया जाना चाहिए के लिए अस्थायी नस ऊपर और फ्लैट पर हो। 35 जी सुई पोत काफी दूर तक कि सुई की नोक पूरी तरह से पोत से घिरा हुआ है में डाला जाना चाहिए। एक transilluminator और शीशा चश्मा सहायक उपकरण स्पष्ट रूप से छोटे नसों कल्पना करने के लिए कर रहे हैं। बड़ी मात्रा में इंजेक्शन के लिए 100μl सामग्री के प्रवाह पुष्टि करने के लिए धीरे-धीरे संचार किया जाना चाहिए। पहले परीक्षण में इंजेक्शन की विफलता के मामले में, लौकिक नस के दूसरी ओर एक और परीक्षण के लिए उपलब्ध है। इंजेक्शन के बाद, पिल्ले न्यूनतम संकट का अनुभव है और जल्दी से ठीक हो। यह स्पष्ट है कि क्यों 20 से बाहर एक पिल्ले की औसत प्रमुख संकट का अनुभव है और ठीक नहीं है नहीं है। हालांकि, इस घटना न्यूनतम नुकसान के पूरे प्रयोगात्मक डिजाइन की घटना की कम दर।

चतुर्थ इंजेक्शन विधि एक उच्च सफलता दर (80% से अधिक) है के रूप में, हम साथ और ऐसी दवाओं या कार्यात्मक एंटीबॉडी के रूप में प्रणालीगत उपचार के बिना वितरण पैटर्न तुलना सकता है। हम पहले एक प्रयोग जहां नवजात चूहों विरोधी β1 कार्यात्मक अवरुद्ध एंटीबॉडी इंटीग्रिन के साथ (50 μl 20 माइक्रोग्राम / छ) या निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (50 μl 20 माइक्रोग्राम / छ) नवजात चूहों की सतही लौकिक नस में इंजेक्शन थे आयोजन किया है। एक घंटे के पद एंटीबॉडी इंजेक्शन, 5 × 10इन क्षेत्रों में एमसीएमवी के 6 PFU (50 μl) लौकिक नस के दूसरे पक्ष में संचार कर रहे थे। हैम्स्टर विरोधी चूहा CD29 की धारा के अनुसार इन क्षेत्रों में एमसीएमवी पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या (β1 इंटीग्रिन की चेन, क्लोन HA2 / 5) जब निर्धारण एंटीबॉडी का इलाज मस्तिष्क 8 के उस के साथ तुलना की -treated मस्तिष्क काफी कम थे। भविष्य जांच में एक ही विधि का उपयोग करना, वायरस के खिलाफ दवाओं या निष्क्रिय करने एंटीबॉडी के प्रभाव वायरल कणों और संक्रमित कोशिकाओं का वितरण देख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane Sigma-Aldrich T-6791
HCl Sigma-Aldrich H-1758
pEGFP-N1 vector  Clontech #6085-1
D-sorbitol Sigma-Aldrich S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 Spherotech, Inc. FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 Spherotech, Inc. FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 Spherotech, inc.  FP-2056-2
10% mouse serum DAKO  X0910
C57BL/6 mouse SLC, Inc.
ICR mouse SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series) Hamilton company
35-gauge needle Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator Phillips Healthcare 1017920
O.C.T.Compound Sakura Finetek 4583
RNase A Sigma-Aldrich R4642
Nonidet(R) P-40 Nacalai 25223-04
citrate buffer (pH 6) x 10 Sigma-Aldrich C9999-100ml
pepsin Sigma-Aldrich P6887
EDTA dojindo N001
Formamide TCI F0045
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich 42867-5G
Denhardt's Solution (50x) ThermoFishcer sceintific 750018
Yeast tRNA (10 mg/ml) ThermoFishcer sceintific AM7119
SSC 20x Sigma-Aldrich S6639
DAPI ThermoFishcer sceintific D1306
n-Hexane Sigma-Aldrich 296090
superfrost plus glass ThermoFishcer sceintific 12-55-18
Cytokeep II Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE ebioscience 12-0311
ProLong  Gold ThermoFishcer sceintific P36934
BIOREVO KEYENCE BZ-9000E

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 113 cytomegalovirus फ्लोरोसेंट microbeads मछली मस्तिष्क,
नवजात मस्तिष्क में वायरल कणों और फ्लोरोसेंट microbeads की Intracerebroventricular और Intravascular इंजेक्शन
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Kawasaki, H., Kosugi, I., Sakao-Suzuki, M., Meguro, S., Tsutsui, Y., Iwashita, T. Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain. J. Vis. Exp. (113), e54164, doi:10.3791/54164 (2016).

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