Abstract
바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. 뇌의 두 가지 경로 감염성의 첫 번째는 내피 세포 및 뇌 혈관 주위 세포의 감염을 포함 혈행 경로이다. 두 번째는 뇌 실내 (ICV) 경로이다. 일단 중추 신경계 (CNS) 내의 바이러스는 뇌척수액을 통해 거미 막밑 공간 수막 및 맥락총에 퍼져있다. 실험 모델에서, CNS 바이러스 분포의 초기 단계에있어서 잘되지 않으며, 이는 특정 셀은 초기 감염 불분명하다. 여기서, 우리는 감염의 급성 단계에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 입자의 분포를 분석 한 신생아 마우스의 뇌에 ICV 또는 혈관 내 (IV) 주입에 이어 바이러스 혈증 차 불린다. ICV 주사 모델에서, 쥐 CMV (MCMV) 또는 형광 마이크로 비드 5 μL은 midpoi의 뇌실 주입했다NT를 27 G 바늘 10 μL 주사기를 사용하여 귀와 눈 사이. IV를 주입 모델에서 35 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용 하였다. transilluminator가이 신생 마우스의 표면 시간적 (얼굴) 혈관을 시각화 하였다. 우리는 표면 시간적 정맥에 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈의 50 μl를 주입. 뇌는 서로 다른 시간 지점 포스트 분사에 수확 하였다. MCMV 게놈은 현장 하이브리드 방식의를 사용하여 검출되었다. 재조합 MCMV 입자를 발현하는 형광 마이크로 비드 또는 녹색 형광 단백질의 형광 현미경으로 관찰 하였다. 이러한 기술 뇌염의 발병 기전을 조사하기 위해 많은 다른 병원균에 적용될 수있다.
Introduction
바이러스 성 뇌염을 연구 할 때, 바이러스 입자의 초기 분포 질환 발병 기전을 이해하고 뇌에서 바이러스 타겟을 식별하는 것이 매우 중요하다. Pandoravirus 크기가 1에서 700 개 이상의 나노가 있지만 대부분의 바이러스는 20 ~ 300 nm의에서 크기가 다양합니다. 감염의 급성 단계에서 바이러스 입자의 분포는 입자의 크기, 세포 수용체의 분포, 또는 바이러스에 대한 세포 수용체의 친화력에 의존 할 수있다. 동물 모델, 뇌실 (ICV), 복강 내, 직접 태반, 정맥은 (IV) 감염은 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다합니다. ICV 바이러스 접종은 종종 마우스에서 중추 신경계 (CNS) 감염을 확립하기 위해 사용된다. 이 기술을 사용하여 연구는 특히 뇌실 주위 영역의 셀 및 뇌척수액 (CSF), simila 직접 접촉 뇌의 영역에서 광범위하게 감염 신고바이러스 ventriculoencephalitis의 효과에 대한 연구. 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 입자의 작은 크기 (20 - 25 nm의 직경)을 ICV 감염 2-4 뇌 전반에 걸쳐 그 보급을 용이하게한다. 복강 5, 직접 태반 6, IV 주사 7 hematogenic 전신 투여를 나타냅니다. 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)을 통해 바이러스 입자의 침투들이 확산 소교 노쥴 8,9 나타내는 신생아의 뇌 실질에 도달 할 수있다.
거대 세포 바이러스 (CMV)는 헤르페스 바이러스 제품군에 속하는 흔한 바이러스입니다. 미국에서는 50 % - 국민의 80 %가 40 CMV 감염이 거의 유해하지만 면역 환자와 태아의 질병을 일으킬 수 있습니다 나이 CMV 감염이 있었다. 모든 배달 중 0.2 % - 2 %는 같은 소두증, 뇌실 주위 석회화, 소뇌 형성 부전, MICR 등의 심각한 증상을 초래, CMV (10)에 태어난안염, 및 시신경 위축 (11, 12). 또한, 정신 지체, 감각 신경성 난청, 시각 결함, 발작, 간질 비 치명적 CMV에 감염된 유아 13, 14의 약 10 %에서 발생한다. CNS 장애는 CMV 선천성 기형의 가장 흔한 특징적인 증상입니다. 더 많은 아이들이 영구적으로 다운 증후군, 태아 알코올 증후군, 또는 척추 피열 (15)보다는 선천성 CMV 매년 비활성화됩니다. 안전하고 효과적인 백신의 필요성을 요구, 본에서 CMV에 대한 어떤 예방 접종을 사용할 수 있습니다. 감염의 초기 단계에서 그 수용체와 CMV 입자의 상호 작용을 공부 백신의 효과를 이해하는 것이 중요하다.
Ventriculoencephalitis 및 확산 소교 결절은 CMV의 두 가지 주요 병리학 적 특성이 16 뇌염 있습니다. (- 300 내지 150 nm) 감염 (a)의 급성기에 뇌를 통해 확산 CMV 입자가 어떻게 불확실하고있다차 방법 세포 수용체의 분포 및 바이러스에 대한 자신의 친 화성이 바이러스 확산에 기여한다. 가와사키 외. ICV는 입자 및 감염의 초기 단계에서의 수용체 (β1 인테그린)의 분포의 관점에서 IV 감염을 평가했다. 우리는 CMV 입자와 β1의 인테그린의 발현의 보급이 잘 ICV 및 IV 감염 (8) 모두에서 감염의 초기 단계에 상관 관계가 있음을 발견했다. ICV 감염 ventriculoencephalitis의 모델 및 IV 감염 확산 소교 노쥴의 모델이다. 바이러스 또는 형광 입자의 역학을 공부하는 것은 입자 크기, 세포 수용체와 바이러스의 상호 작용, 뇌에 BBB 침투의 메커니즘의 효과에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다. 다음 프로토콜은 CNS 어떤 바이러스 감염 및 바이러스 벡터를 조사하는데 사용될 수있다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜은 의과 대학의 하마 마츠 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
MCMV (스미스 주) 및 재조합 1. 준비 M32이 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) -MCMV
- 등 이전에 8 설명 - (1.9 1.2) 다음과 같은 방법에 따라 재조합 M32-EGFP-MCMV 생성합니다.
- 야생형 MCMV (: U68299 가입 번호)의 스미스 균주에서 유래 재조합 바이러스를 사용합니다. 삽입 EGFP (4361 염기쌍; BP) 37,089과 41,450 BP 사이 - 상동 재조합에 의해 MCMV의 게놈 (M32 M31의 궤적).
- M32, 5'- CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(정방향 프라이머), 5 : 중합 효소 연쇄 반응에 의해 MCMV M32 증폭 (41,450 - 오른쪽 아래의 프라이머를 사용하여 서열 유전자 좌위의 측면에, 39246 BP - 39286 BP 시퀀스 및 M31 (37,089의 측면에 남아 '-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 '(역방향 프라이머); M31, 5'- CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3'(정방향 프라이머), 5'-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 '(역방향 프라이머).
- 된 NheI과의 BamHI 제한 부위를 사용하여 EGFP 발현 벡터로 M32의 궤적을 삽입합니다. 를 AflII과를 XbaI 사이트를 사용하여 플라스미드 -recombinant M32-EGFP에 M31의 궤적을 삽입합니다. EGFP - - M32에서 된 NheI과를 AflII와 M31 시퀀스 - EGFP - M32 절단 M31 재조합 플라스미드와 H 2 O에 용해
- MCMV (스미스 균주)의 핵으로 절단 한 구조를 형질 감염은 상동 재조합을 유도하는 전기 시스템을 사용하는 NIH3T3 세포를 24 시간 후 감염 (HPI)를 -infected.
- 삼일 후 감염, 감염된 세포의 EGFP 발현 초점을위한 여섯 웰 플레이트에 1 / 1,000의 비율과 화면에 감염되지 않은 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)와 공동 배양 세포에서.
- Harve녹색 형광 초점을 포함하는 우물에서 성 바이러스 함유 상층 액과는 배로 희석. 정제를 들어, 하나의 녹색 형광 초점을 표시 우물을 선택합니다.
- 모든 초점이 제한 희석 감염 디스플레이 EGFP 발현에 기인하는 경우, 바이러스 제제에는 야생형 바이러스가 남아 있는지 나타내는 순이다. 이전 17 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스를 정량화.
- 장갑과 마스크를 착용 바이오 안전성 레벨 2에서 인증 바이오 안전성 캐비닛에 MCMV을 취급합니다.
- 12 일 된 ICR 마우스 배아에서 준비 MEFs에의 통로 MCMV (스미스 주) 및 재조합 MCMV는 이전 17 설명했다.
- 16 ° C에서 20 분 동안 3,000 × g에서 원심 분리하여 감염 MEF 문화의 상층 액에서 세포를 제거합니다.
- 초 원심 분리기 70,000 × g에서 40 분 동안 상층 액. TBS 버퍼 1 ml의 비리 온을 함유하는 펠렛을 재현 탁하고, 미리 형성된 선형들에 전송할orbitol 구배 (25 % - 70 %). 60 분 18 초 원심 분리기 다시에서 70,000 × g으로.
- 주사기와 비리 함유 밴드를 수확. 40 분 동안 70,000 × g에서 추가 초 원심 분리 단계에서 수확 비리 펠렛.
- 감염 실험 전까지 -80 ° C에 인산 완충 용액 (PBS) 및 저장 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
- 이전 19 바와 같이 플라크 분석 방법에 의해 바이러스 역가를 정량화.
- 형광 현미경 (도 1a) 및 투과 전자 현미경 (TEM) (8) (도 1B)에 의해, 입자 구조에 의해 (489 내지 508 nm에서의 방출에 여진) 재조합 MCMV 입자의 EGFP 발현 시각화.
나일 레드 형광 마이크로 비즈 2. 준비
- 구매 카르 복실 형광 나일 레드 마이크로 비드 및 직경에 따라 튜브에 마이크로 비즈 500 μl를 배치 (0.04- 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 (12) 입자; 0.1 - 약 5.75 × 10 (10) 입자 0.3 μm의; 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 7 입자).
- 모든 독소를 제거하고 실온에서 멸균 물에 비드를 재현 탁 약 1 일 동안 0.1 M NaOH를 500 μl의 구슬을 취급합니다.
- 사용하기 전에 실온에서 C57BL / 6 마우스에서 얻은 10 % 마우스 혈청 비드 O / N을 흡착.
- 집계, 소용돌이 구슬을 분리하고 사용하기 전에 철저하게 초음파 처리합니다.
신생아 마우스로 MCMV 및 형광 마이크로 비즈의 3 ICV 주입
- 12 시간 조명 / 어두운주기에 따라 온도 제어 설비의 정상적인 임신 한 ICR 마우스를 유지한다. 신생아는 출생의 날에 P 0.5로 지정되어 있습니다.
- 10 μL 주사기와 70 % 알코올로 27 G 바늘을 소독.
- MCMV 형광 마이크로 함유하는 주사액 (5 μL)을로드조심스럽게 주사기의 플런저를 당겨 바늘에 구슬.
- 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제. 동물이 마취되면 마취 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용한다.
- 표 0.7 위치에서 비 독성 실험 펜 주사 부위 - 1.0 mm의 시상 봉합 0.7 측 방향 - 신생아 브레 그마 (도 2a)에서 1.0 mm의 꼬리.
- 바늘에게 표시된 주사 부위의 두개골 표면에 수직 깊이 2mm를 삽입합니다. 참고로, 무독성 메이커 바늘의 선단으로부터 2mm를 표시한다.
- 천천히 두피 (그림 2B)를 열지 않고 측면 뇌실에 MCMV (약 5 × 10 5 PFU)의 5 μl를 주입.
- (- 약 5.75이 0.3㎛, 입자 × 108 0.1)에 의한 마우스의 다른 군에서는 형광 마이크로 비드를 함유하는 5 μL 용액을 주입동일한 방법.
- 역류를 방지하기 위해 플런저 운동을 중단 한 후 20 초 - 천천히 바늘 (10)를 제거합니다.
- 복구 5 쥐를 유지하기 위해 - 이동 및 일반 응답이 복원 될 때까지 따뜻한 용기에 10 분.
- 시점 (3, 12, 24, 48, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확.
신생아 마우스로 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈 4. IV 주입
- 4 분 - 3 얼음에 마우스를 넣어 신생아 마우스 (P 0.5)을 억제.
- P에서 0.5 신생아를 MCMV의 정맥 주사를 수행하기 위해 35 G 바늘 1 ml의 주사기를 사용합니다.
- 피상적 시간 (얼굴) 정맥을 시각화하기 위해 transilluminator가 (맥 파인더)를 사용합니다. 주입하기 전에 수술 테이프 (그림 2C)를 사용하여 transilluminator가에 신생아를 고정합니다.
- (1.5 배)를 돋보기 안경을 착용하는 동안, 천천히 MCMV (약 5.45 × 50 μl를 주입; 10 9 입자) 또는 형광 마이크로 비드 (0.04 - 약 0.06 μm의, 3.63 × 10 (11) 입자 0.1 - 약 0.3 μm의, 5.75 × 10 9 입자 및 1.7-2.2 μm의 약 6.85 × 10 6 입자)가 표면 시간적 정맥에 (그림 2D).
- 바늘을 제거한 후 출혈이 중단 될 때까지 주입 부위에 압력을 70 % 에탄올을 함유하는 거즈를 사용한다.
- 신생아에게 따뜻한 용기를 케이지에 반환하기 전에 복구하는 약 5 분을 제공합니다.
- 시점 (3, 12, 24, 72 시간) 후 분사의 범위에서 (5)에 기재된 바와 같이 뇌 수확.
파라핀 섹션 5. 뇌 조직 샘플 준비
- 짓 눌린 된 얼음에 작은 플라스틱 접시에 주입 된 신생아를 놓습니다.
- 동물이 마취되면 anesthes의 깊이를 결정하기 위해 TOE 핀치 응답 방법을 사용아이오와.
- 흉강을 열어 흉곽을 통해 하나의 중앙 또는 두 개의 끝 수평 최종 컷을 확인합니다.
- 날카로운 가위로 중앙 홀에 상처를 확인합니다. 아트리움에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 솔루션을 달이다. 간 자발적인 움직임 (PFA 춤)과 경량화 색이 관찰 될 때 관류를 중지합니다. 에게서 피를 뽑다하지 마십시오.
- 제 가위를 이용하여 헤드를 제거하여 (20 같이 이전에 설명) 신생아 해부.
- 두개골을 노출하는 코, 목의 외피를 따라 중간 선 절개를합니다.
- 신중 두개골의 내면을 따라 슬라이딩 한쪽 난원 매그넘로 홍채 가위의 날카로운 단부를 배치했다.
- 후방 두개골 표면의 선단까지 연장 상처를 확인하고 반대쪽 측면에 동일한 상처를합니다. 소뇌 주위의 두개골을 멀리 취소합니다.
- 조심 뇌 손상을 방지하기 위해 한쪽 두개골을 벗겨. 이 과정을 반복뇌의 반대편에 절차.
- 주걱을 사용하여, 뇌의 복부 표면을 따라 후각 신경 전구 연결을 단절.
- 부드럽게 아직 가위를 사용하여 두개골에 뇌를 연결하고 뇌를 제거하는 경질 트리밍, 머리에서 뇌를 분리합니다.
- 4 % PFA 4 ° C에서 24 시간 동안 뇌의 10 배 이상 볼륨을 포함 정착의 유리 병에서 뇌를 놓습니다.
- 물 변위 등급 에탄올 욕의 일련의 조직을 탈수하고 블록을 형성하는 파라핀 왁스 침투. 21 4 μm의 두께 조각으로 마이크로톰으로 파라핀 블록을 잘라.
- Deparaffinize는 감염된 뇌 (22)의 슬라이드를 재수합니다. 파라핀 포함 된 섹션에 대한 현장 하이브리드에서 진행합니다.
냉동 섹션 6. 뇌 조직 샘플 준비
- 5.1에 설명 된 단계에 따라 뇌를 제거 - 5.11.
- 형광 마이크로 비드 및 M32-EGFP-MCMV을 관찰하기 위해 평평한 바닥 cryomolds에 절제 뇌를 놓습니다. 완전히 뇌 샘플을 커버하는 매체를 포함 추가합니다. 스냅 척에 부착하기 전에 cryomolds의 가장자리를 유지하는 집게를 사용하여, 예냉 N 헥산 (-80 ° C)에서 cryomolds 동결.
- 절편의 경우, 미리 냉각 된 저온 유지 척에 고정 된 조직 블록을 연결합니다. 그라 이오 스탯 챔버로 척에 고정 된 조직을 전송하고 -10 내지 -20 ° C까지 온도를 낮추고, 약 8 조각 컷 - 23 10 μm의 두께를.
- 분무 cytofixative (이소 프로필 알코올, 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물)와 섹션을 수정합니다. 공기는 즉시 살포 후 실온에서 30 분 동안 섹션을 건조하고, 그들을 저장 - 더 사용할 때까지 80 ºC.
- 다시 RT에 대한 섹션을 평형과 PBS로 3 회 세척한다.
- G를 π 공역 계 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)와 섹션을 얼룩1의 농도로 100 RT에서 PBS에 10 분 동안 (도 5) 또는 PE 공역 CD31 항체 : riffonia의 1의 농도로 B4 동종 렉틴 Simplicifolia의 100 RT에서 PBS에 30 분 동안 (도 6).
- PBS로 3 회 섹션을 씻으십시오.
- 세척 후, 세포 핵을 시각화 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 부분을 염색. , EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출) (345 nm의, 455 nm에서 방출에 여기) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI의 섹션을 탑재하고, 나일 레드 (553 nm에서 여기, 637 nm에서 방출) 형광 현미경 (도 3, 5, 6).
파라핀 임베디드 섹션에 대한 현장 하이브리드 (FISH) 7. 형광
- 전체 MCMV DNA 세대를 포함하는 박테리아 인공 염색체를 사용하여 닉 번역에 의해 현장 하이브리드의 DNA에 대한 형광 직접 표시된 FISH 프로브를 준비오메 (pSM3fr) 19. 물고기 프로브의 농도는 0.1 μg의 / μL이다.
- Deparaffinize는 감염된 뇌 (22)의 슬라이드를 재수합니다.
- 바이러스의 DNA를 검출 된 RNase (100 μg의 PBS / ㎖)로 조직 절편을 치료.
- 20 분 동안 98 ° C - 0.05 %의 NP40, 95에서 0.01 M 구연산 완충액 (pH 6.0)으로 항원 검색을 수행합니다. 20 분 동안 RT까지 슬라이드 쿨.
- 유리 코 플린 염색 항아리에서 2 분마다 순수한 물에 세 번 슬라이드를 씻는다. 0.06 %의 펩신, 37 ° C에서 5 분 동안 0.01 N HCl 용액과 추가 항원 검색 단계를 수행합니다.
- 린스는 2 분 동안 유리 코 플린 염색 항아리마다 순수한 물에 세 번 슬라이드.
- 85 % 에탄올로 한 후 100 % 에탄올, 70 % 에탄올로부터 슬라이드를 전송하여 다시 조직 절편을 탈수.
- 혼성화 완충액 10 ㎖를 제조 원위치 혼성화 염 (3 M의 NaCl, 100 mM 트리스 1.25 ml에 섞어-HCl pH가 8.0, 5 ㎖ 탈 포름 아미드 100 mM의 인산 나트륨 pH가 6.8, 50 mM의 EDTA), 2.5 ml의 50 % 덱스 트란 설페이트, 250 ㎕의 50X 덴 하르트 용액, 125 μL의 100 ㎎ / ㎖의 tRNA 및 875 μL의 H 2 O.
- 직접 혼성화 버퍼에 임의로 전체 MCMV 게놈 인식 형광 표지 한 DNA 프로브를 희석. 최종 부피는 10 μL (7 ㎕의 하이브리드 버퍼, 1 μL 프로브 (0.1 μg의 / μL), 2 ㎕의 증류수)해야한다.
- 각 슬라이드에 프로브 믹스 (10 μl를) 추가 및 커버 슬립 (15 × 15mm)을 다룹니다. 고무 시멘트와 커버 슬립을 밀봉합니다. 85 ° C에서 5 분 동안 프로브 믹스 변성, 42 ℃에서 하이브리드 화 단계 O / N을 완료.
- 2 분 동안 73 ° C에서 0.3 % NP40, 0.4 배의 SSC와 슬라이드를 씻으; 0.1 % NP40, 1 분 동안 73 ° C에서 0.4 배의 SSC와; 및 2 배 SSC와 두 번.
- DAPI (10 NG / ㎖)로 커버 슬립을 슬라이드 커버 핵 Counterstain과.
- 산형광 현미경 (그림 4) 안티 - 페이드 시약 및 이미지 DAPI (345 nm에서 여기, 455 nm에서 방출) 및 EGFP (489 nm에서 여기, 508 nm에서 방출)의 섹션.
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Representative Results
바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. ICV 경로는 급성 감염, 지주막 하 공간을 통해 CSF를 통해 확산 수막 및 맥락막 얼기에 도달 나타내는 반면, 혈행 경로, 내피 세포와 뇌의 혈관 주위 세포의 급성 감염을 나타냅니다. MCMV 게놈 및 M32-EGFP-MCMV 입자 또는 형광 마이크로 비드의 직접 관찰을 검출 계내 혼성화 급성 뇌염 입자의 1 분포를 분석하는 데 사용 하였다.
재조합 MCMV의 생성 (M32-EGFP-MCMV)
이 프로토콜은 M32-GFP-MCMV가 생성 된 방법 재조합을 보여줍니다. EGFP는 상동 재조합에 의해 MCMV 게놈에서 37,089과 41,450 BP (M32-M31의 궤적) 사이에 삽입되었다. EGFP 피rotein는 바이러스 성 단백질 (M32)와 융합하고, EGFP는 바이러스 입자 내에서 발현되었다. 제한 희석 감염으로 인한 모든 병소가 더 야생형 바이러스가 남아 없다는 것을 표시 EGFP 발현 표시시 상동 재조합 후, 바이러스 제제 순수한 여겨졌다. 이는 재조합 바이러스를 정제하는 여러 희석 절차를 취할 수있다.도 1a는 정제 된 재조합 MCMV (M32-EGFP-MCMV)의 EGFP 신호를 나타내고,도 1b는 바이러스 코어로 바이러스 게놈을 함유하는 M32-EGFP-MCMV 입자의 TEM 이미지를 나타낸다 .
뇌실 주입 및 혈관 내 주입
그림 2는 바이러스 나 마이크로 비드가 ICV 경로 또는 IV의 경로를 통해 주입 된 신생아 마우스 (P 0.5)의 주사 부위를 보여줍니다. ICV에서는 주사 부위의 사이 중간에있을위치에서 귀 눈은 약 0.7 - 신생아 브레 그마 (도 2a)에서 1.0 mm의 꼬리 - 1.0 mm의 시상 봉합 0.7 측 방향. 바늘은 두개골 표면 (그림 2B). 그림 2C 및 2D에 수직 깊이 2mm가 MCMV 또는 마이크로 비드가 신생아 쥐의 시간적 얼굴 정맥에 주입하는 것을 보여 측면 뇌실에 주입한다. transilluminator가와 돋보기 안경은 분명히 작은 혈관을 시각화하는 유용한 도구입니다.
바이러스 성 입자 / 게놈 및 형광 마이크로 비즈의 분포
다음 그림은 바이러스 입자 / 게놈 및 급성 단계에서 형광 마이크로 비즈의 분포를 보여줍니다. (3) 뇌의 동결 절편의 마이크로 비드 신호를 보여줍니다. 그림 3a 및도 3b는 표시0.1의 배포 -. 한계 지역에서 0.3 μm의 형광 나일 레드 마이크로 비드 (MA) (그림 3A) 및 맥락막 얼기 및 뇌실 영역 2 시간 후 ICV 주입에 (SVZ) (그림 3B) 그림 3C 및 3D는 분포를 보여 2 시간 후 IV 주입에서 MA 및 혈관 영역 (그림 3C) 및 맥락막 얼기와 SVZ (그림 3D) 0.3 μm의 형광 나일 레드 마이크로 비드 - 0.1의. 는 ICV 및 IV 주입에 따라 입자를 즉시 실질 전체에 균일하게 확산되지 않은 것으로 보인다. 오히려, 그들은 급성 감염 단계에서 SVZ, MA, 혈관 영역에 머물렀다. 입자의 크기는 ICV 및 IV 주입 다음 급성기에 뇌에서의 분포에 영향을 미치는 주요 요소이다. (4) 뇌의 파라핀 포함 된 섹션에 MCMV 게놈의 물고기를 보여줍니다. MCMV 게놈 (녹색 반점)이 검출되었다3 시간 후 ICV 주입에 SVZ (그림 4B). MCMV 게놈 (녹색 점)는 3 시간 후 IV 주입 (그림 4C)에서 MA 및 혈관 영역에서 검출되었다. MCMV (도 4), 마이크로 비드 (도 3)의 분포는 매우 유사 하였다. 5 IV 주입 다음 뇌의 동결 절편에 마이크로 비드의 크기에 의존 분포 패턴을 보여주고있다. 2.2 μm의 (그림 5B), 0.1 - - 0.3 μm의 (그림 5D), 0.04 - 직경 1.7 마이크로 비드 0.06 μm의 (그림 5E)는 각각 표시됩니다. 작은 마이크로 비드는 실질 조직의 혈관 영역 밖으로 extravasated되는 경향이 있었다.도 6은 뇌의 동결 절편에 M32-EGFP-MCMV 입자의 분포를 나타낸다. GFP 도트 신호 (M32-EGFP-MCMV 입자) 주로 MA (도 6a)에서 관찰되었고 맥락총 및 SVZ (
그림 1 :. 재조합 M32-EGFP-MCMV (A) Ultracentrifuged M32-EGFP-MCMV 입자의 생성은 형광 현미경에 의한 녹색 관광 명소로 볼 수 있습니다. 스케일 바 :. 2.4 μm의 (B) 투과 전자 현미경은 M32-EGFP-MCMV 입자 전형적인 바이러스 구조를 가지고 있음을 보여준다. 스케일 바 : 77 nm의.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 신생아 마우스 사출 사이트. 5 ㎕를 MCMV (약 5 × 10 5 PFU) 또는 (약 5.75 × 10 9 입자) 5 ㎕를 마이크로 비드의 (A, B) ICV 주입입니다. (A) 주입 사이트에서 (귀와 눈 사이의 중간 점에있다 1.0 mm 시상 봉합 0.7 측 방향 - - 약 0.7 위치. 신생아 브레 그마에서 1.0 mm의 꼬리) (B) 10 μL 주사기와 27 G 바늘은 측면 뇌실에 주입 2mm 깊이 사용 두개골 표면에 수직. (C, D) MCMV 또는 마이크로 비드는 신생 마우스의 시간적 안면 정맥에 주입된다. (C) (D) 1 ml를 주사기가 MCMV의 IV 주입을 수행하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 3 : 뇌에 형광 나일 레드 마이크로 비드의 시각화 (A, B) 0.1 - (빨간색)이 2 시간에서 MA (A) 및 맥락막 얼기와 SVZ (B)에서 관찰되는 0.3 μm의 형광 나일 레드 마이크로 비드 신호 포스트 ICV 분사 (C, D) 0.1 -. 2 시간 포스트 분사에 IV 주입에 의한 신생아 마우스의 뇌에 도입 0.3 μm의 형광 나일 레드 마이크로 비드. 나일 레드 마이크로 비드는 일에 관찰된다전자 MA 및 혈관 영역 (C) 및 맥락막 얼기와 SVZ (D). 흰색 사각형이 (D)의 오른쪽 상단에 확대 삽입에 확대되어 (A, C) 스케일 바 :. 50 μm의 (B, D) 스케일 바 :. 150 μm의. 화살표 나 빨간색 마이크로 비드를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : ICV 주입 및 IV 주입 후 마우스 뇌에서 MCMV 게놈 분포 (A) 낮은 배율보기.. 확대 된 이미지 (B)가 캡처 된 곳 흰색 사각형을 나타냅니다. (나) MCMV 게놈 (녹색 반점이) 처음 3 시간 후 ICV 주입에 SVZ에서 검출된다. DAPI (4 '] 나프티 diamidino -2- 페닐 인돌)는 핵 산 (핵) 염색에 사용된다. 스케일 바 :. 30 μm의 (다) MCMV 게놈 (녹색 점)을 12 시간 후 IV 주입의 혈관 영역과 수막에서 검출된다. DAPI는 핵 산의 염색에 사용됩니다. 스케일 바 : 30 μm의. 화살표 대표 MCMV 게놈 (녹색 점)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 마이크로 비드의 직경과 마이크로 비드의 분포 사이의 관계 형광 나일 레드 마이크로 비드 (50 μL)을 IV 주입에 의한 신생아 마우스의 뇌에 도입된다. 동결 절편에서에서 그리고 vascul 주위에 관찰되는 2 시간의 포스트 분사, (화살표로 표시된 빨간색) 나일 빨간 신호를 준비실질의 아칸소 지역입니다. . 혈관 영역은 형광 렉틴 (녹색) (A, B) 1.7로 염색한다 -. 2.2 μm의 마이크로 비드 (A) 낮은 배율보기를. 흰색 사각형은 확대 된 이미지 (B)가 촬영 한 위치를 나타내는 (B) 흰색 사각형이 (B)의 오른쪽 상단에 확대 된 인서트로 확대됩니다 (C, D) 0.1 -... 0.3 μm의 마이크로 비드 (다) 낮은 배율보기. 흰색 사각형은 확대 된 이미지 (D)이 촬영 된 위치를 나타냅니다 (D) 흰색 사각형이 (D)의 오른쪽 상단에 확대 된 삽입으로 확대된다 (E, F) 0.04 -... 0.06 μm의 마이크로 비드 (마) 낮은 배율보기. 흰색 사각형은 확대 된 이미지 (F)가 촬영 된 곳을 나타냅니다. (F)을 흰색 사각형이 오른쪽 상단에 확대 된 인서트로 확대됩니다
그림 6 : 급성 감염 단계에서 바이러스 입자의 관측. (A는 B) EGFP 도트 신호 (M32-EGFP-MCMV 입자는) 주로 MA에서 관찰된다 (화살표로 표시; A), 맥락막 신경총 및 SVZ는 (화살표로 표시; B) 2 시간에서 포스트 ICV 주입입니다. 백색 사각형은 (A)와 (B)의 오른쪽에 확대 인서트로 확대된다. 스케일 바 :. 20 μm의 (C, D) 3 시간 후 IV 주입시는, (화살표로 표시된 녹색)을 MCMV 입자의 혈관 영역의 내부와 외부에 발견실질 (C), 맥락총 및 SVZ (D) (적색 : CD31 양성 세포). 백색 사각형은 (C)와 (D)의 맨 오른쪽에 확대 인서트로 확대된다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 모델, ICV, 복강 내, 직접 태반 및 IV 감염에 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다. 우리는 절차의 간략화와 목표 영역에 입자를 직접 주입의 이익을 위해 신생 마우스의 ICV 및 IV 주입 모델에 초점을 맞추었다. 복강 내 감염 쉬운 방법이지만, 바이러스 입자는 간접 공정 5, 24을 통해 체계적으로 확산. 직접 태반 감염은 배아 전신 감염을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 그러나,이 방법은 안정된 결과를 얻을 특별한 훈련이 필요하며 낮은 성공 확률을 가지고있다. 감염 방법은 태반을 통해 간접 방법이며, 각 시험 6에서 태아에 주입 양을 제어하기 어렵다. 신생아 마우스는 CMV 등 바이러스에 매우 민감하기 때문에,이 연구에서 우리는 초기의 PHA의 바이러스 입자의 분포와 감염된 세포의 그것과 비교할 수감염의 전자. IV를 감염 모델이 BBB과 바이러스의 상호 작용을 포함하여 천연 감염을 닮은 전신 감염 모델 반면 ICV 주사 모델은 BBB (25)를 우회 악성 동작을 연구하기 위해 유용하다.
ICV 주입 방법으로, 우리는 깊은 두개골에 최소한 2mm을 통과해야했다. 심실 (26)로부터 역류를 방지하기 위해 20 초 - 니들은 약 10 대뇌 심실 내부에 유지 하였다. 주의 깊게 완료되면, ICV 주입 빠르고 생체 방법 쉽게이다. 그러나 원치 않는 역류 또는 발생할 수 있습니다 뇌에 바늘의 깊이 / 얕은 침투를 포함 때로는 부정확 주사. 주의 절차와 관찰 후 분사가 성공적으로이 프로토콜을 수행하는 데 필요한. 사출 에러를 고려하면, 우리는 입자가 아닌 양의 분포 패턴에 초점을 맞추고, 약물의 치료 효과가 관찰되지 않았다s 또는 우리의 연구에서 기능적 항체.
이러한 표면 시간적 정맥, 외부 경정맥, 복고풍 궤도 공동으로 여러 사이트를 통해 쥐의 신생아 IV 주입을 수행하는 몇 가지 방법이 있습니다. 신생아의 표면 시간적 정맥 용이 transilluminator가 배율 렌즈를 사용하여 가시화된다. 주입은 rate.We는 IV 주입의 사이트로 표면 시간적 정맥을 선택 높은 성공을 한 경험이 개인에 의해 완성 될 수있다. IV 주입 방법은 신생아 마우스 및 주입 절차를 위치 일부 훈련을 요구한다. 시간적 정맥은 상단과 평면에 있어야하는 신생아 마우스의 머리는 테이프로 위치해야합니다. 35 G 바늘은 바늘의 끝이 완전히 용기에 둘러싸여 있음을 충분히 용기에 삽입해야합니다. transilluminator가와 돋보기 안경은 분명히 작은 혈관을 시각화하는 유용한 도구입니다. 최대 100 많은 양의 주입μL은 콘텐츠의 흐름을 확인하기 위해 천천히 주입한다. 첫 번째 재판에서 주입 실패의 경우, 시간적 정맥의 다른 측면은 다른 재판에 사용할 수 있습니다. 주입 후, 새끼는 최소한의 고통을 경험하고 신속하게 복구 할 수 있습니다. 한 20 점 만점 새끼의 평균이 큰 고통을 경험하고 복구하지 않는 이유는 명확하지 않다. 그러나,이 경우 최소 손상 전체 실험 디자인의 발생 저속.
IV가 주입법 높은 성공률 (80 % 이상)를 가지고, 우리는와 같은 의약품 또는 기능성 항체 전신 치료하지 않고 분포 패턴을 비교할 수있다. 우리는 이전에 신생아 마우스가 신생아 마우스의 표면 시간적 정맥에 (20 μg의 / g에서 50 μl를) 또는 이소 제어 항체 (20 μg의 / g에서 50 μl를) 항 β1이 기능을 차단하는 항체를 인테그린 주사 하였다 실험을 실시했다. 한 시간 후 항체 주사, 5 × 10MCMV 6 PFU (50 μL)을 시간적 정맥의 타측에 주입 하였다. 햄스터 반대로 쥐 CD29의 섹션 당 MCMV 양성 세포의 수는 이소 항체 처리 된 뇌 (8)의 그것과 비교했을 때 처리 된 뇌 유의하게 낮았다 (β1 인테그린 체인, HA2 / 5 복제). 향후 연구에서 동일한 방법을 사용하여 바이러스에 대한 중화 항체 또는 약제의 효과는 바이러스 입자 및 감염 세포의 분포를 관찰함으로써 결정될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH 6) x 10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50x) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/ml) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC 20x | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E |
References
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