Summary

subtypning af<em> Campylobacter jejuni</em> Ssp.<em> doylei</em> Isolater Brug massespektrometri-baserede PhyloProteomics (MSPP)

Published: October 30, 2016
doi:

Summary

Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) blev anvendt til at skrive en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater på stamme i forhold til multilocus sekvens maskinskrivning (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS giver mulighed for at skelne nogle bakterier ikke kun på niveau arter og underarter, men endog under, stammen være. Allele isoformer af de påviselige biomarkør ioner medfører isolat-specifikke masseskift. Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) er en ny teknik, der kombinerer de massespektrometriske påviselige biomarkør masserne i en ordning, der giver mulighed for fradrag for phyloproteomic relationer fra isolere specifikke masseskift sammenlignet med et genom sekventeret henvisning stamme. De udledte aminosyresekvenser er derefter anvendt til at beregne MSPP-baserede dendrogrammer.

Her beskriver vi arbejdsgangen af MSPP ved at skrive en Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolere samling af syv stammer. Alle syv stammer var af human oprindelse og multilocus sekvens typning (MLST) viste deres genetiske mangfoldighed. MSPP-typning resulterede i syv forskellige MSPP sekvens typer, tilstrækkeligt afspejler deres grafilogenetic relationer.

C. jejuni ssp. doylei MSPP Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner, hovedsagelig ribosomale proteiner i massen området fra 2 til 11 kDa. MSPP kan i princippet tilpasses andre massespektrometriske platforme med en udvidet masse rækkevidde. Derfor er denne teknik har potentiale til at blive et nyttigt redskab for stamme mikrobiel skrive.

Introduction

I det sidste årti, har matrix-assisteret laser desorption ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) frem for at være en højt værdsat standardmetode for mikrobiel slægt og identifikation art i klinisk mikrobiologi 1, 2. identifikation Arter er baseret på registrering af små protein fingeraftryk intakte celler eller cellelysater. Den typiske masse interval for et massespektrometer anvendes i rutinemæssig klinisk mikrobiologi er 2-20 kDa. Derudover kan den resulterende spektre anvendes til at skelne stammer på den nedenfor arter og under-underarter niveau 3. Tidlige banebrydende studier har identificeret specifikke biomarkør ioner for en særlig undergruppe af stammer i Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, og Escherichia coli 10-12.

Kombinationen af ​​flere variable biomarkør masser, der svarer til allele isoformer giver mulighed for dybere subtypning. Tidligere vi med succes gennemført en metode til at konvertere disse variationer i masse profiler i meningsfulde og reproducerbare phyloproteomic relationer kaldes massespektrometri baseret phyloproteomics (MSPP) på en C. jejuni ssp. jejuni isolat samling 13. MSPP kan anvendes en massespektrometrisk svarende til DNA-sekvens baseret subtypning teknikker som multilocus sekvens typebestemmelse (MLST).

Campylobacter-arter er den hyppigste årsag til bakteriel gastroenteritis verdensplan 14, 15. Som følge af Campylobacteriose post-infektiøs følgesygdomme, nemlig Guillain-Barré syndrom, reaktiv arthritis og inflammatorisk tarmsygdom kan opstå 16. De vigtigste kilder til infektion erforurenet husdyr kød fra kylling, kalkun, svin, kvæg, får og ænder, mælk og overfladevand 15, 17. Derfor regelmæssige epidemiologiske overvågning studier i forbindelse med fødevaresikkerhed er nødvendige. MLST er "gold standard" i molekylær typning for Campylobacter arter 18. Fordi Sanger-sekventering baseret MLST fremgangsmåde er arbejdskrævende, tidskrævende og forholdsvis dyr, er MLST typning begrænset til relativt små isolere kohorter. Derfor er der et behov for billigere og hurtigere subtypning metoder. Dette behov kan opfyldes ved massespektrometriske metoder som MSPP.

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for MSPP-typning ved hjælp af en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater og sammenligning af dens potentiale med MLST.

Protocol

1. Forbered en sikker arbejdsplads ved at overveje Biosafety Betingelser Bliv fortrolig med laboratorie- og sikkerhedsregler, som er relevante for at arbejde med mikroorganismer. De fleste humane patogene mikroorganismer skal håndteres på biosikkerhed niveau 2 betingelser, men nogle, såsom Salmonella enterica serovar Typhi, kræver biosikkerhedsniveauet 3. Oplysninger om niveau håndtere hver patogen kan tilgås ved www.cdc.gov/biosafety. Uanset den biohazard klassificeringen af ​​de…

Representative Results

Tidligere vi med succes etableret en MSPP ordning for C. jejuni ssp. jejuni 13. Her har vi til formål at udvide metoden til søskende underart C. jejuni ssp. doylei. I dette specifikke indstilling, syv C. jejuni ssp. doylei isolater blev erhvervet fra den belgiske samling af mikroorganismer / Laboratorium for Microbiology UGent BCCM / LMG Gent, Belgien. Alle syv isolater anvendes til vores analyser var af human oprindelse….

Discussion

Den mest kritiske skridt i etableringen af ​​en MSPP ordningen er den utvetydige genetiske bestemmelse af biomarkør ion identiteter. Hvis det ikke er muligt at identificere en biomarkør utvivlsomt, så det bør være udelukket fra ordningen 13.

C. jejuni ssp. doylei Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner. Disse er 5 mindre i forhold til C. jejuni ssp. jejuni MSPP ordning 13 .Den væsentligste forskel mellem den påvi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.

Materials

acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  15. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  16. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni – The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  17. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  18. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  19. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  20. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  21. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet – distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  22. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  23. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  24. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, 695-699 (2010).
  25. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  26. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  27. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  28. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  29. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  30. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  31. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Play Video

Cite This Article
Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

View Video