Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) blev anvendt til at skrive en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater på stamme i forhold til multilocus sekvens maskinskrivning (MLST).
MALDI-TOF MS giver mulighed for at skelne nogle bakterier ikke kun på niveau arter og underarter, men endog under, stammen være. Allele isoformer af de påviselige biomarkør ioner medfører isolat-specifikke masseskift. Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) er en ny teknik, der kombinerer de massespektrometriske påviselige biomarkør masserne i en ordning, der giver mulighed for fradrag for phyloproteomic relationer fra isolere specifikke masseskift sammenlignet med et genom sekventeret henvisning stamme. De udledte aminosyresekvenser er derefter anvendt til at beregne MSPP-baserede dendrogrammer.
Her beskriver vi arbejdsgangen af MSPP ved at skrive en Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolere samling af syv stammer. Alle syv stammer var af human oprindelse og multilocus sekvens typning (MLST) viste deres genetiske mangfoldighed. MSPP-typning resulterede i syv forskellige MSPP sekvens typer, tilstrækkeligt afspejler deres grafilogenetic relationer.
C. jejuni ssp. doylei MSPP Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner, hovedsagelig ribosomale proteiner i massen området fra 2 til 11 kDa. MSPP kan i princippet tilpasses andre massespektrometriske platforme med en udvidet masse rækkevidde. Derfor er denne teknik har potentiale til at blive et nyttigt redskab for stamme mikrobiel skrive.
I det sidste årti, har matrix-assisteret laser desorption ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) frem for at være en højt værdsat standardmetode for mikrobiel slægt og identifikation art i klinisk mikrobiologi 1, 2. identifikation Arter er baseret på registrering af små protein fingeraftryk intakte celler eller cellelysater. Den typiske masse interval for et massespektrometer anvendes i rutinemæssig klinisk mikrobiologi er 2-20 kDa. Derudover kan den resulterende spektre anvendes til at skelne stammer på den nedenfor arter og under-underarter niveau 3. Tidlige banebrydende studier har identificeret specifikke biomarkør ioner for en særlig undergruppe af stammer i Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, og Escherichia coli 10-12.
Kombinationen af flere variable biomarkør masser, der svarer til allele isoformer giver mulighed for dybere subtypning. Tidligere vi med succes gennemført en metode til at konvertere disse variationer i masse profiler i meningsfulde og reproducerbare phyloproteomic relationer kaldes massespektrometri baseret phyloproteomics (MSPP) på en C. jejuni ssp. jejuni isolat samling 13. MSPP kan anvendes en massespektrometrisk svarende til DNA-sekvens baseret subtypning teknikker som multilocus sekvens typebestemmelse (MLST).
Campylobacter-arter er den hyppigste årsag til bakteriel gastroenteritis verdensplan 14, 15. Som følge af Campylobacteriose post-infektiøs følgesygdomme, nemlig Guillain-Barré syndrom, reaktiv arthritis og inflammatorisk tarmsygdom kan opstå 16. De vigtigste kilder til infektion erforurenet husdyr kød fra kylling, kalkun, svin, kvæg, får og ænder, mælk og overfladevand 15, 17. Derfor regelmæssige epidemiologiske overvågning studier i forbindelse med fødevaresikkerhed er nødvendige. MLST er "gold standard" i molekylær typning for Campylobacter arter 18. Fordi Sanger-sekventering baseret MLST fremgangsmåde er arbejdskrævende, tidskrævende og forholdsvis dyr, er MLST typning begrænset til relativt små isolere kohorter. Derfor er der et behov for billigere og hurtigere subtypning metoder. Dette behov kan opfyldes ved massespektrometriske metoder som MSPP.
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for MSPP-typning ved hjælp af en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater og sammenligning af dens potentiale med MLST.
Den mest kritiske skridt i etableringen af en MSPP ordningen er den utvetydige genetiske bestemmelse af biomarkør ion identiteter. Hvis det ikke er muligt at identificere en biomarkør utvivlsomt, så det bør være udelukket fra ordningen 13.
C. jejuni ssp. doylei Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner. Disse er 5 mindre i forhold til C. jejuni ssp. jejuni MSPP ordning 13 .Den væsentligste forskel mellem den påvi…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.
acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |