Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التصنيف الفرعي لل Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

كتلة phyloproteomics القائم على الطيف (MSPP) كانت تستخدم لكتابة مجموعة من العطيفة SSP الصائمية. doylei يعزل على مستوى السلالة بالمقارنة مع multilocus تسلسل الكتابة (MLST).

Abstract

تقدم MALDI-TOF MS إمكانية للتمييز بعض البكتيريا ليس فقط على مستوى الأنواع والسلالات ولكن حتى أدناه، على مستوى الضغط. الإسوية أليلية من أيونات العلامات البيولوجية للكشف تؤدي إلى تحولات الشامل عزل محدد. phyloproteomics القائم على الطيف الكتلي (MSPP) هو أسلوب الرواية التي تجمع بين الطيفي الشامل الجماهير العلامات البيولوجية التي يمكن اكتشافها في مخطط يسمح خصم العلاقات phyloproteomic من التحولات كتلة محددة عزل مقارنة الجينوم التسلسل سلالة المرجعية. ثم يتم استخدام تسلسل الأحماض الأمينية استنتاجها لحساب dendrograms أساس MSPP.

نحن هنا وصف سير العمل MSPP عن طريق كتابة SSP العطيفة الصائمية. doylei جمع العزلة من سبع سلالات. وكانت جميع سلالات سبعة من أصل بشري وmultilocus تسلسل الكتابة (MLST) أظهرت تنوعها الوراثي. أسفرت MSPP-الكتابة في سبعة أنواع مختلفة من تسلسل MSPP، تعكس بصورة كافية فيز بهمالعلاقات logenetic.

وC. الصائمية SSP. doylei يتضمن مخطط MSPP 14 أيونات العلامات البيولوجية المختلفة، والبروتينات في الغالب الريباسي في نطاق كتلة من 2 إلى 11 كيلو دالتون. MSPP يمكن من حيث المبدأ، أن تتكيف مع منصات الطيفي الشامل الأخرى مع مجموعة الشامل الموسعة. لذلك، هذه التقنية لديها القدرة على أن تصبح أداة مفيدة لكتابة الميكروبية مستوى التوتر.

Introduction

خلال العقد الماضي، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين مطياف زمن الطيران (MALDI-TOF MS) وقد تقدمت لتكون طريقة موحدة ذات قيمة عالية لجنس الجراثيم وتحديد الأنواع في علم الأحياء الدقيقة السريرية 1 و 2. ويستند تحديد الأنواع على تسجيل بصمات بروتين صغيرة من خلايا سليمة أو الخلية لست]. مجموعة كتلة نموذجي لمطياف الكتلة المستخدمة في علم الأحياء الدقيقة السريري الروتيني هو 2-20 كيلو دالتون. بالإضافة إلى ذلك، الأطياف الناتجة يمكن أن تستخدم لتمييز سلالات في الأنواع التالية وتحت سلالات مستوى 3. وقد حددت الدراسات الرائدة الأولى أيونات العلامات البيولوجية المحددة لمجموعة فرعية معينة من سلالات في العطيفة الصائمية 4، المطثية العسيرة 5، السالمونيلا الملهبة للSSP. الملهبة للضرب مصلي التيفية 6، المكورات العنقودية الذهبية 7-9، وEscherichia القولونية 10-12.

مزيج من عدة كتل العلامات البيولوجية متغير الموافق الإسوية أليلية يوفر خيار لتصنيف الفرعي أعمق. سابقا، نفذنا بنجاح طريقة لتحويل هذه الاختلافات في الشخصية الجماعية في علاقات phyloproteomic هادفة وقابلة للتكرار دعت كتلة phyloproteomics الطيف القائم (MSPP) على C. الصائمية SSP. جمع عزل الصائمية 13. MSPP يمكن استخدام أي ما يعادل الطيفي الشامل لتقنيات التصنيف الفرعي أساس تسلسل الحمض النووي مثل تسلسل multilocus الكتابة (MLST).

أنواع التسمم الغذائي هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء البكتيرية في جميع أنحاء العالم 14 و 15. ونتيجة لذلك الناجمة عن هذا المرض عقبول آخر المعدية، وهي غيان باريه متلازمة، التهاب المفاصل التفاعلي ومرض التهاب الأمعاء يمكن أن تنشأ 16. المصادر الرئيسية للعدوى هياللحوم الحيوانية الملوثة من الدجاج والديك الرومي والخنازير والأبقار والأغنام والبط والحليب والمياه السطحية 15 و 17. لذلك، دراسات المراقبة الوبائية العادية في سياق سلامة المواد الغذائية الضرورية. MLST هو "المعيار الذهبي" في الكتابة الجزيئية للأنواع العطيفة 18. لأن سانجر التسلسل طريقة MLST استنادا إلى عمالة كثيفة، مضيعة للوقت ومكلفة نسبيا، يقتصر MLST الكتابة إلى الأفواج عزل صغيرة نسبيا. لذلك، هناك حاجة لطرق أرخص وأسرع التصنيف الفرعي. يمكن تلبية هذه الحاجة عن طريق وسائل لقياس الطيف الكتلوي مثل MSPP.

تقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة لMSPP-الكتابة باستخدام مجموعة من العطيفة SSP الصائمية. doylei العزلات والمقارنة إمكاناته مع MLST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد بيئة عمل آمنة من خلال النظر في شروط السلامة الأحيائية

  1. تعرف على لوائح المختبرات والسلامة التي هي ذات الصلة للعمل مع الكائنات الحية الدقيقة. يجب أن يتم التعامل مع معظم الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض البشرية على مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف ولكن بعضها، مثل السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية، تتطلب مستوى السلامة الحيوية 3. معلومات على مستوى التعامل مع كل مسببات المرض يمكن الحصول عليه من www.cdc.gov/biosafety.
  2. بغض النظر عن تصنيف واقية من الكائنات الحية الدقيقة معين، تعتبر جميع المواد التي جاءت في اتصال مع وكيل المعدية مثل النفايات المعدية التي يجب تعقيمها قبل التخلص منها. احترام إرشادات السلامة الإقليمية للمواد الخطرة والمواد البيولوجية. التأكد من أن الحاويات المناسبة للتخلص منها فورا والسليم للمواد يحتمل أن تكون ملوثة (خطورتها) متاحة.
  3. تأكد من أن الأدوات المعقمة (الحلقات التلقيح) والحلول وسائل الإعلام والثقافة (تتوفر قبل البدء ثقافة البكتيرية لوحات أجار).
  4. غسل اليدين بالماء والصابون المطهر والماء الدافئ على الفور بعد التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة المعدية.

2. حدد المرجعية ومجموعة عزلات

  1. اختيار والحصول القياسية إشارة واحدة متسلسلة الجينوم عزل جنبا إلى جنب مع تسلسل للبروتيوم المشفرة، من الناحية المثالية في شكل FASTA. إذا هي أكثر سلالات تسلسل الجينوم المتاحة، وتشمل هذه في التحليل.
    ملاحظة: هذه العزلة / وفي وقت لاحق أن تستخدم هذه العزلات على التنبؤ بهوية قمم كتلة لوحظ في قياس الطيف الكتلي (انظر القسم 7).
  2. تحديد والحصول على مجموعة متنوعة من العزلات يحتمل أن تكون متنوعة في مثل هذه الطريقة التي تغطي نسالة من الأنواع أو سلالات من الفائدة.
    ملاحظة: سيتم في وقت لاحق أن تستخدم هذه العزلات لإثبات تباين المؤشرات الحيوية في عدد السكان (انظر القسم 8).
  3. تأكد من أن المجموعة بأكملها وعزل المرجعية (ق) هي المؤيدةكتبته بيرلي من قبل معيار الذهب منها لمعين هذا الكائن الحي 18-20.
    ملاحظة: هذا قد تشمل مجموعة متنوعة من (الفرعية) طرق -typing، ولكن من المرجح أن تلجأ إلى MLST، التي لا تزال هي الطريقة المعتادة لإظهار التنوع الجيني لمعظم الأنواع الميكروبية.
  4. للاستدلال على نسالة في جمع وحساب phylogram من البيانات في الكتابة، على سبيل المثال، وذلك باستخدام طريقة مجموعة الزوج غير المرجح بمتوسط حسابي (UPGMA) في برنامج MEGA6 للبيانات MLST 21. للحصول على بيانات MLST، أيضا استشارة قاعدة بيانات MLST وتعيين أنواع تسلسل والمجمعات نسيلي منها 22.
    ملاحظة: سيتم في وقت لاحق أن تستخدم هذه لتحليل التطابق من MSPP مع الذهب في وقت سابق طريقة الكتابة القياسية (انظر القسم 9).

3. إعداد لوحة MALDI الهدف

تنبيه: TFA هو حمض قوي. الاستخدام غير السليم من TFA يحمل خطر حروق جلدية خطيرة، الأضرار التي تصيب العين وشديدة تهيج سو الجهاز التنفسي العلوي في حالة استنشاقه. ولذلك، يجب أن تحترم إجراءات السلامة الصارمة وهناك حاجة إلى معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك نظارات السلامة ودروع لحماية الوجه، والقفازات المناسبة، والأحذية، أو حتى بدلة واقية كاملة، في حين أن التعامل TFA. يجب السيطرة على احتمال التعرض للTFA عن طريق التعامل مع المادة تحت التهوية الكافية مع نظام العادم التهوية فعال. في حالة عدم كفاية التهوية، وجهاز للتنفس الصناعي مع فلتر وافقت يجب أن تستخدم. بالإضافة إلى ذلك، TFA هو ضار للحياة المائية مع تأثيرات طويلة الأمد. ويجب تجنب أي تسرب للTFA في مياه الصرف الصحي على البيئة.

ملاحظة: قبل اكتشاف العينات على هدف MALDI، وتنظيف لوحة الهدف بدقة إذا تم استخدام لوحة سابقا.

  1. إعداد 100 مل 70٪ محلول الإيثانول المائي باستخدام 30 مل من الماء منزوع الأيونات و 70 مل الإيثانول النقي.
  2. إعداد 250 ميكرولتر من 80٪ حمض trifluoroacetic مائي (TFA) حل عن طريق خلط 50ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 200 ميكرولتر 100٪ TFA في أنبوب رد فعل وvortexing لأنبوب لمدة 1 دقيقة.
  3. تنظيف الهدف MALDI من خلال وضعه في طبق زجاج والغمر في الإيثانول المائي 70٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. شطف الهدف تحت الماء الساخن.
  5. باستخدام المناديل الورقية، ومسح لوحة الهدف بشكل مكثف مع 70٪ من محلول الإيثانول المائي لإزالة جميع العينات السابقة وغيرها من الحطام المحتملين.
  6. إذا كنت بحاجة إلى المزيد من التنظيف، وشطف تحت الماء الساخن في حين يمسح بمنديل ورق.
  7. إزالة الملوثات المتبقية، ويحتمل أن تكون غير مرئية، و، التي تغطي سطح الهدف مع طبقة رقيقة من 80٪ مائي TFA (~ 100 ميكرولتر في 96 نقاط) والقضاء على جميع المناصب الهدف نظيفة مع المناديل الورقية.
  8. أخيرا، شطف الهدف لإزالة حامض، والقضاء عليها تجف باستخدام المناديل الورقية، وتترك لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لتتبخر السوائل المتبقية.

4. إعداد ل45؛ -Cyano-4-هيدروكسي-السيناميك حمض مصفوفة محلول يحتوي على Calibrant الداخلية

  1. يعد حل مصفوفة مشبعة عن طريق إذابة 10 ملغ α-cyano-4-هيدروكسي-السيناميك حمض (HCCA) في 1 مل من خليط من 50٪ الأسيتونتريل والمياه 47.5٪، و 2.5٪ TFA. سيبقى المتبقية غير منحل HCCA إذا مشبعة الحل.
  2. إضافة الأنسولين البشري المؤتلف باعتبارها calibrant الداخلي. لهذا، يعد حل الأسهم إلى التركيز النهائي من 10 جزء من الغرام / ميكرولتر في 50٪ المائية الأسيتونتريل، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.

5. MALDI-TOF الطيف الكتلي

ملاحظة: الشروط ثقافة محددة للكائنات من الفائدة يجب أن تستخدم. عينات لMALDI-TOF MS يمكن إعداد إما عن طريق إعداد تشويه أو استخراج، اعتمادا على الكائن الحي (انظر القسم 8.4.1). في حين أن طريقة استخراج حمض الفورميك الإيثانول يوفر تعطيل كاف من مسببات الأمراض، وإعداد تشويه يجب أن تتم تحت الإكتفاءشروط السلامة الأحيائية icient على النحو المطلوب (انظر القسم 1). عادة، لا يوجد أي خطر من الإصابة بعد تطبيق مصفوفة، ولكن لمسببات الأمراض محددة مطلوبة بروتوكولات تعطيل محددة. وهكذا، على سبيل المثال MALDI-TOF MS الأنواع النوكارديا يتطلب تحلل السابق من البكتيريا في الماء المغلي، وبعد عن طريق الترسيب الايثانول من البروتينات 23. EI Khéchine وآخرون. وضعت إجراءات لتثبيط مايكوباكتيريا، تسخين المستعمرات البكتيرية في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أنابيب المسمار الحد الأقصى تحتوي على المياه و 0.5٪ توين 20 24.

  1. تحضير لطخة
    1. توزيع كمية بحجم رأس الدبوس من مستعمرة بكتيرية مباشرة على طبق من ذهب الموقف الهدف MALDI ( 'بقعة').
    2. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA المصفوفة العادية أو مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وتترك لcrystalize في درجة حرارة الغرفة. لتحديد كتلة بالضبط من ذروة المعايرة، تراكب س السيطرةبعد التمديد مع 1 ميكرولتر الاختبار القياسية و 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي.
      ملاحظة: هنا، كما الاختبار القياسية يتم استخدام مستخرج من الإشريكية القولونية DH5 ألفا يوضح بصمة البروتين مميزة في MALDI-TOF MS. وارتفعت انها مع اثنين من البروتينات التي تمتد الحد الأعلى للنطاق كتلة اكتشافها.
  2. طريقة استخراج
    1. حصاد ما يقرب من خمس مستعمرات من ثقافة لوحة أجار مع حلقة التلقيح وتعليق جيدا في 300 ميكرولتر الماء المقطر المزدوج في أنبوب 1.5 مل التفاعل. إضافة 900 ميكرولتر الايثانول المطلق وتخلط جيدا من قبل pipetting المتكررة حتى يتم تعليق المستعمرات البكتيرية تماما.
      ملاحظة: في هذه الخطوة فمن الممكن وراسخة لتخزين العينات في -20 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط الجراثيم يمكن اختبارها من قبل تسليط الضوء على 1-10 ميكرولتر من استخراج على لوحة أجار المناسبة التالية الحضانة في ظروف النمو المثلى. ناجح فييشار إلى تفعيل بسبب عدم وجود نمو الجراثيم.
    2. أجهزة الطرد المركزي في العينة 13000 x ج لمدة 1 دقيقة، ونبذ طاف، وتجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. resuspend الكرية بشكل دقيق من قبل pipetting صعودا ونزولا في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من الأسيتونتريل وتخلط. إزالة الأنقاض عن طريق الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل 1 ميكرولتر من طاف على وضع عينة على طبق من ذهب الهدف MALDI وتترك لتجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وتترك لcrystalize في درجة حرارة الغرفة.
  3. تسجيل قداس الأطياف
    ملاحظة: يتم الذروة قطف من أطياف الشامل باستخدام الإجراءات القياسية الموصى به (خوارزمية النقطة الوسطى، S / N نسبة: 2، يختلط عتبة كثافة: 2٪، ذروة عرض 3 م / ض، الطرح الأساسي: TopHat)
    1. معايرة الصك وفقا لprotoc الصانعينرأ.
    2. لكل بقعة، وجمع 600 الأطياف في 100 لقطات الخطوات.
      1. انتقل إلى "AutoXecute" علامة التبويب برامج التكوين من مطياف الكتلة. فتح "الطريقة" التي اليسار النقر على الزر "الطريقة" واختيار طريقة وعلى سبيل المثال، "MBT_AutoX" من القائمة المنسدلة.
      2. اليسار انقر على زر "تحرير ..." يمين القائمة "أسلوب" لفتح "AutoXecute محرر أسلوب". انتقل إلى علامة التبويب "تراكم". تعيين "تلخيص" القيمة إلى "600" و "طلقات مرضية في" قيمة _x_ "خطوات النار" إلى "100".
  4. إجراء معايرة الطيف الداخلي
    ملاحظة: أخطاء القياس دقيقة متأصلة لقياس الطيف الكتلي. اعتمادا على استخدام أداة متقطعة، ودرجة الحرارة وأداة لإعادة معايرة، قد تختلف قيم القياس التي تم الحصول عليها بين التجارب. التالية قبل قياس معايرة الأدوات و بعد قياس المعايرة الطيف إلى calibrant الداخلي هي الطريقة الأكثر دقة لضمان إمكانية المقارنة بين الطيف.
    1. تنفيذ الإجراءات التالية لكل قائمة المعايرة الذروة:
      1. بدء تشغيل مستعرض الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis والطيف المفتوح: القائمة "ملف" → "فتح ...")
      2. إنشاء قائمة التحكم الشامل مع ذروة calibrant: القائمة "الطريقة" → "فتح ...".
      3. اختيار الأسلوب: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"فتح".
      4. تحرير قداس قائمة التحكم: قم بإلغاء كل Calibrants.
      5. إضافة Calibrant الذروة في أسفل: قمة التصنيف: "Insulin_HIStag [M + H] + _ متوسط". m_z: "5808.29". التسامح [المليون]: "50". تحقق مربع Calibrant.
      6. باستثناء ما، على سبيل المثال، "قائمة calibrant MSPP".
    2. لكل الطيف، واختيار ذروة calibrant من القائمة، انقر فوق "تعيين تلقائي" ثم اضغط على "موافق".
ove_title "> 6. تحقق من إجراء المعايرة الداخلية

  1. تجريبيا تحديد كتلة بالضبط من الذروة المعايرة.
    1. إعداد مركزين مع 1 ميكرولتر الاختبار القياسية كل (الخطوة 5.1.1). تراكب الأول مع 1 ميكرولتر العادية HCCA مصفوفة، والثاني مع 1 ميكرولتر مصفوفة ارتفعت calibrant.
    2. الحصول على أطياف الشامل من (القسم 5.3) في كل بقعة، ومعايرة داخليا إلى القمم الاختبار القياسية (القسم 5.4).
    3. تراكب كل من الأطياف التي فتحها مع متصفح الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis والطيف المفتوح: القائمة "ملف" → "فتح ...") وإيجاد الذروة في كتلة المتوقع (الأنسولين م / ض = 5،808.29)، والتي يجب أن تكون موجودة في طيف ارتفعت calibrant، ولكن ليس في الطيف تم الحصول عليها مع المصفوفة العادية.
  2. تأكد من أن Calibrant بيك لا يتم حجبها بواسطة أي العلامات البيولوجية الأخرى للالكائن الاهتمام.
    1. إعداد مركزين (القسم 5.1) مع سلالة إشارة واوفه rlay الأول مع 1 ميكرولتر المصفوفة العادية، والثانية مع 1 ميكرولتر مصفوفة ارتفعت calibrant.
    2. الحصول على أطياف الشامل من كل المواقع (القسم 5.3) وتراكب أطياف الناجم عن فتحها مع متصفح الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis ومفتوحة الطيف: القائمة "ملف" → "فتح ..."). تأكد من أن ذروة calibrant واضحة للعيان في الطيف تم الحصول عليها مع مصفوفة ارتفعت ولا تحجب إشارة المتاخمة آخر. إذا لم تكن هذه هي الحالة، واختيار calibrant آخر لهذا كائن معين.
      ملاحظة: استخدام calibrant الداخلي ارتفعت يزيد بشكل كبير من الدقة لتحديد الاختلافات من الجماهير العلامات البيولوجية. باستخدام هذا الأسلوب، والفروق الجماعية وصولا الى 1 دا يمكن الكشف عنها. بدلا من ذلك، الجماهير أيضا ثابتة القادمة من الكائنات الحية يمكن أن تستخدم كما calibrants. ومع ذلك، من حيث التعريف، لا بد من النظر في جميع الجماهير المستمدة من الكائنات الحية يحتمل المتغير، ما لم يثبت خلاف ذلك.

"jove_title"> 7. تحديد العلامات البيولوجية الأيونات في سلالة المرجعي

  1. قياس الطيف الكتلي من سلالة المرجعي، وذلك باستخدام مصفوفة مسنبل مع Calibrant الداخلية.
    1. توزيع كمية بحجم رأس الدبوس من مستعمرة بكتيرية (القسم 5.1) أو 1 ميكرولتر من استخراج البروتين البكتيري (القسم 5.2) مباشرة على طبق من ذهب الموقف الهدف MALDI ( 'بقعة').
    2. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وترك لوحة الهدف crystalize في درجة حرارة الغرفة (القسم 5.1.2 / 5.2.4).
    3. أطياف قياسي الشامل من سلالة المرجعية (القسم 5.3).
  2. معايرة داخليا الطيف إشارة إلى كتلة calibrant (هنا: الأنسولين في م / ض = 5،806.29)، وبعد ذلك قبل عملية الطرح الأساسي (TopHat) وتمهيد (معلمات: SavitzkyGolay، العرض: 2 م / ض، 10 دورات).
    1. بدء تشغيل مستعرض الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis ومفتوحة الطيف: القائمة "ملف" → "فتح .... ").
    2. اختيار الأسلوب: المنسدلة القائمة "الطريقة" → "فتح ..."، انقر بزر الماوس الأيسر على طريقة الاختيار، على سبيل المثال، "MBT_Standard.FAMSMethod" → "فتح".
    3. معايرة الطيف عن طريق اختيار "الداخلية ..." من القائمة المنسدلة "معايرة". نافذة يفتح سرد ذروة calibrant (ق) (القسم 5.4). اليسار فوق ذروة calibrant (الأنسولين) → اليسار فوق "موافق". اختيار "أطياف العملية" من "عملية" القائمة المنسدلة.
    4. لالطرح الأساسي تفعيل الطيف في قائمة الطيف في الجانب الأيمن. اختيار "طرح الطيف الكتلي الأساس" من "عملية" القائمة المنسدلة.
    5. لضمان سلاسة الطيف، وتفعيل طيف في قائمة الطيف في الجانب الأيمن. اختيار "السلس الطيف الكتلي الأساس" من "عملية" القائمة المنسدلة.
  3. من البيانات تسلسل الجينوم من سلالة مرجعية، وحساب theoreticaل monoisotopic الوزن الجزيئي من كل من البروتينات المشفرة بواسطة ترجمة تسلسل الحمض النووي في تسلسل الأحماض الأمينية المقابلة باستخدام محرر تسلسل المحاذاة. نسخ لصق هذا التسلسل البروتين في مربع الإدخال في بوابة إكسباسي المعلوماتية الحيوية الموارد (http://web.expasy.org/compute_pi/). ثم اضغط على "اضغط هنا" لحساب بي / ميغاواط. في حالة C. الصائمية SSP. doylei حساب كتلة من 14 المؤشرات الحيوية للكشف.
  4. نسخ النتائج في جدول بيانات، مع عمود واحد يحتوي على معرف الجينات والقادم الوزن الجزيئي. ترتيب الصفوف من حيث الوزن الجزيئي حساب لتسهيل أسهل بحث الجماهير. ملاحظة: أعمدة أخرى اختيارية. قد يكون الشرح وظيفية مفيدة بشكل خاص في وقت لاحق للتفسير.
  5. إدراج العمود الثاني في جدول البيانات عن الوزن الجزيئي للشكل methioninated دي، طرح 135 دا من الوزن الجزيئي monoisotopic. ملاحظة: وذلك لأن بعض البروتينات تخضع آخرالتعديل متعدية عن طريق إزالة بروتين من الميثيونين -terminal N.
  6. تعيين كل الكبرى كتلة العلامات البيولوجية المقاسة للجماهير تحسب من سلالة إشارة عن طريق البحث عن كتلة تقاس من الجدول الجينوم أعد فوق (الجدول 1).
  7. إذا لا يمكن تعيين أيونات العلامات البيولوجية لمنتجات الجين توقع، والنظر في التعديلات posttranslational الأخرى (مثيلة، أستلة، prenylation، وما إلى ذلك؛ نرى http://www.abrf.org/delta-mass لمجموعة من التعديلات والتغييرات كتلة المرتبطة ). عن أي تعديل posttranslational المعروفة الأخرى التي كثيرا ما لوحظ في الكائنات الحية من الفائدة إضافة عمود آخر إلى طاولة المفاوضات وإعادة حساب الوزن الجزيئي مماثل لعملية لشكل methioninated دي.
  8. إعداد التبويب جدول آخر، وتسجيل كل العلامات البيولوجية أيون كتلة ومعرف في عمود جدول منفصل.

8. تقييم العلامات البيولوجية التغيرفي السكان

  1. معايرة أطياف الشامل التي تم الحصول عليها من جمع يعزل، كما فعلت بالنسبة للسلالة المرجعية (ق) (القسم 5.4.2).
  2. تحديد المؤشرات الحيوية متفاوتة في أطياف الشامل. يتميز كتلة البديل بسبب عدم وجود كتلة معروفة من الطيف المرجعية وظهور كتلة جديدة غير موجودة في المرجع. الفرق الجماعية يجب أن تتفق مع تبادل حمض أميني واحد (الجدول 2)، أو مزيج منهما.
  3. في عزلة واحدة لكل صف، تسجيل كتلة تقاس لكل العلامات البيولوجية والإسوي المتوقع في أعمدة الجدول منهما.
    ملاحظة: نادرا ما، قد تكون بعض التحولات كتلة يعزى إلى عدة بورصات الأحماض الأمينية المختلفة، على سبيل المثال، على حد سواء، وتبادل N التي كتبها D و Q تبادل عن طريق البريد، والعكس بالعكس، يؤدي إلى التحول الشامل من 0.985 دا (الجدول 2). لا يمكن حل هذه المشكلة الجوهرية التي كتبها الطيف الكتلي وحدها. لذلك، الإسوية المختلفة على مستوى تسلسل البروتين ذات نفس الكتلةيجب أن تعامل على أنها نوع MSPP واحد. وأكد مواز سانجر تسلسل الجينات أيون العلامات البيولوجية الخاصة التي لا تحدث هذه المشكلة في حين MSPP-كتابة C. الصائمية SSP. doylei عزل جمع المستخدمة في هذه الدراسة.
  4. تأكيد أنواع MSPP جديدة من PCR تضخيم وتسلسل الجينات العلامات البيولوجية منها. وهذا بدوره يعمل أيضا تأكيدا أنه قد تم تعيين هوية العلامات البيولوجية بشكل صحيح.
    1. ثقافة بكتيريا يعزل في ظل ظروف النمو المثلى. ثقافة C. الصائمية SSP. doylei الضغوط على كولومبيا أجار تستكمل مع 5٪ الدم الأغنام عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerophilic (5٪ O 2، 10٪ CO 2، 85٪ N 2). احتضان لكاليفورنيا. 48 ساعة. استخدام لوحة أجار منفصلة لكل عزل لتجنب انتقال التلوث.
    2. استخراج الحمض النووي الجيني من العزلات البكتيرية باستخدام المناسبة عدة استخراج الحمض النووي / الماكينات الآلية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. <لى> تضخيم الجينات العلامات البيولوجية منها باستخدام بادئات المدرجة في الجدول 3 تنفيذ جميع ردود الفعل PCR فقا للشروط التالية: تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ الصلب عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    3. تحديد تسلسل الحمض النووي من كل amplicon بواسطة سانجر تسلسل باستخدام كمية مناسبة من الحمض النووي الجيني (عادة 600-700 نانوغرام من الحمض النووي هو كاف في تركيز كاليفورنيا 100 نانوغرام / ميكرولتر) واحدة من الاشعال التضخيم (عادة ما يتم ذلك عن طريق استخدام مزود الخدمة).
  5. في جدول منفصل (انظر الجدول 4)، تسجيل تسلسل البروتين بالضد لكل الإسوي رواية باستخدام أداة الترجمة المناسبة (على سبيل المثال، Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. احسب التأريخ العرقي القائم MSPP ومقارنة لمعيار الذهب

  1. سلسلة تسلسل العلامات البيولوجية الأحماض الأمينية خاصة تابعة لرنوع كان MSPP من العزلات في تسلسل مستمر واحدة باستخدام محرر محاذاة تسلسل، مثل BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 أو جدول بيانات العلامات البيولوجية.
  2. حساب نسالة التي تجمع كما حدث للبيانات الكتابة معيار الذهب، على سبيل المثال، UPGMA تجميع 21.
  3. مقارنة نسالة على أساس MSPP إلى واحد تم الحصول عليها مع معيار الذهب 4، 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سابقا، أنشأنا بنجاح خطة MSPP لC. الصائمية SSP. الصائمية 13. هنا، نحن تهدف إلى توسيع الأسلوب إلى الأخوة سلالات C. الصائمية SSP. doylei. في هذا الإطار تحديدا، سبعة C. الصائمية SSP. doylei العزلات تم الحصول عليها من مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة البلجيكي / مختبر علم الأحياء الدقيقة UGent BCCM / LMG غنت، بلجيكا. وكانت جميع العزلات سبعة المستخدمة في تحليلاتنا الأصل الإنساني. وسلالة تسلسل الجينوم آي تي ​​سي سي 49349 (LMG 8843)، معزولة أصلا من براز الطفل الاسترالي البالغ من العمر 2-مع الإسهال بمثابة المرجع. من المجموعة، كانت ست سلالات الإضافية المتاحة: LMG 9143، LMG 9243، وLMG 9255 عزل من براز الأطفال الذين يعانون الإسهال والذين يعيشون في بروكسل، بلجيكا. LMG 7790 (آي تي ​​سي سي 49350) المعزولة من عينات خزعة المعدة للفرد من ألمانيا؛ وLMG 8870 (NCTC A613 / 87)، وكذلك LMG 8871 (NCTC A603 / 87)، وكلاهما معزولة من عينات الدم المختلفة المستمدة من أطفال جنوب أفريقيا.

كل C. الصائمية SSP. doylei العزلات تم تخزينها في -80 درجة مئوية كما أسهم بنك بردي، إذابة حديثا لكل تحليل ومثقف باستخدام قاعدة أجار كولومبيا تستكمل مع 5٪ الدم الأغنام والحضانة لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية في ظل ظروف microaerophilic (5٪ O 2، CO 2، 85٪ N 2 10٪).

وعلى النقيض من إنشاء هذه التقنية MSPP لC. الصائمية SSP. الصائمية 13 لم يكن من الممكن أن تستند هذه الطريقة على قاعدة بيانات الإسوي مستمدة من أكبر مجموعة التسلسل. فقط جيم واحد الصائمية SSP. doylei كان دخول موجود في قاعدة بيانات rMLST، وهذا يتفق مع سلالة إشارة C. الصائمية SSP. doylei آي تي سي سي 49349 (27). لذلك، كل الحيويالتحول علامة كتلة الكشف بالمقارنة مع سلالة C. كان الصائمية SSP. doylei آي تي سي سي 49349 إدخال جديد في قاعدة البيانات الإسوي وتحتاج إلى تأكيد من قبل سانجر التسلسل.

لتحليل تنوع جيم حصلت الصائمية SSP. doylei العزلات، تم تنفيذ MLST وUPGMA-dendrogram أساس MLST-بما في ذلك سبعة فحص C. الصائمية SSP. doylei العزلات وC. الصائمية SSP. السلالة الصائمية 81-176 باسم outgroup حساب (الشكل 1). كل C. الصائمية SSP. doylei عزل ينتمون إلى مختلف نوع MLST تسلسل، والوقوع في اثنين من المجموعات الفرعية. كان سلالة LMG7790 أطول مسافة النشوء والتطور بالمقارنة مع ما تبقى من C. الصائمية SSP. doylei العزلات.

وللتسجيل MALDI-TOF الطيف الكتلي إشارة من C. الصائمية SSP. doylei (الشكل 2).

ضمن المجموعة، تم الكشف عن الإسوية متفاوتة لL32-M، L33، البروتين افتراضية المشفرة بواسطة غي | 152939117، S20-M، وS15-M (الشكل 3). وكانت الجماهير المتبقية المخصصة لأيونات العلامات البيولوجية لا تتغير في C. اختبار الصائمية SSP. doylei العزلات. وقد تم تحديد استبدال الأحماض الأمينية المطابقة للتحولات الجماعية التي كتبها PCR التضخيم وسانجر تسلسل جينات معينة باستخدام بادئات المدرجة في الجدول 3. الجدول 4 قوائم تسلسل الأحماض الأمينية من كل أيونات العلامات البيولوجية المتضمنة في مخطط MSPP وكذلك والإسوية أليلية الكشف.

وUPGMA- phyloproteomic أساس MSPP-تم احتساب شجرة (الشكل 4) لنفس سبعة C. الصائمية SSP. doylei العزلات وC. الصائمية SSP. السلالة الصائمية 81-176 باسم outgroup باستخدام تسلسل الأحماض الأمينية متسلسلة من جميع أيونات العلامات البيولوجية 14 في ترتيب الوزن الجزيئي في سلالة المرجعية. كل عزلة ويمثل الأفراد نوع MSPP تسلسل. على الرغم من أن العلاقات phyloproteomic التي تم الحصول عليها لم تكن متطابقة تماما لتلك التي حصلت عليها MLST، وC. الصائمية SSP. doylei العزلات رتبت مرة أخرى في غضون المجموعات الفرعية. تم تشكيل subcluster الأولى LMG 8843، LMG 8870، وLMG 9243، والثاني LMG 9255، LMG 9143، LMG 8871 وLMG 7790. كما رأينا مع MLST تحليل، وأظهرت عزل LMG7790 أطول مسافة phyloproteomic في MSPP- تحليل.

شكل 1
الشكل 1: MLST-باسد النشوء والتطور UPGMA شجرة. المتوازن UPGMA-dendrogram أساس MLST-شيدت من سبعة C. الصائمية SSP. doylei العزلات وC. الصائمية SSP. السلالة الصائمية 81-176. سلالة رمز اللون: LMG 8843 (أسود)، LMG 8870 (الرمادي)، LMG 9243 (الأزرق)، LMG 9255 (الفيروز)، LMG 9143 (الأخضر)، وLMG 8871 (وردي)، LMG 7790 (الصفراء)، و81- 176 (أبيض). ونظرا لنوع MLST تسلسل وراء اسم كل عزلة. كل C. الصائمية SSP. doylei عزل ينتمي إلى مختلف نوع MLST تسلسل. المحور السيني يشير إلى مسافات الربط. سلالة LMG 7790 يبين أطول مسافة النشوء والتطور مقارنة مع العزلات الستة المتبقية. سلالات LMG 8843، LMG 8870، وLMG 9243 وكذلك LMG 9255، LMG 9143، وLMG 8871 شكل اثنين من المجموعات الفرعية المختلفة داخل C. الصائمية SSP. العنقودية doylei. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التنازل المؤقت من يرتبط الجينومية من C. الصائمية SSP. doylei آي تي سي سي 49349 (LMG 8843) إلى الجماهير العلامات البيولوجية المرصودة. واستنادا إلى الجماهير المحسوبة (متوسط تركيبة النظائر) من ORFS التنبؤ به من تتابع الجينوم بأكمله من C. الصائمية SSP. doylei سلالة ATCC 49349، خصصت الجماهير العلامات البيولوجية للبروتين المقابل الترميز متواليات. ومع ذلك، ضمن نطاق القياس، والجماهير العلامات البيولوجية للL31 مفارز الريباسي (MW = 7315 دا)، S17 (MW = 9549 دا)، وS18 (MW = 10،285 دا)، وكذلك الأشكال الإسوية-methioninated رفع أسمائهم (أقحم م / ض = 7،000-7،200 دا) لا يمكن أن تسند بشكل لا لبس فيه. لذلك، L31، S1لم تكن مدرجة 7، وS18 في C. الصائمية SSP. doylei مخطط MSPP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): محددة قمم العلامات البيولوجية كتلة C. الصائمية SSP. doylei مخطط MSPP. في كل لوحة أطياف الشامل من كل سبعة اختبار C. تم مضافين الصائمية SSP doylei العزلات (رمز اللون كما في الشكل 1) المقابلة لأنواع MSPP معينة للإشارة إلى التحولات العلامات البيولوجية الكتلة بسبب الإسوية أليلية: (أ) L36 + H +. (ب) L34 + H +. (C) L32-M + H +. (D +. (E) S14-M + H +. (F) L29 + H +، L28-M + H +، وL35-M + H +. (G) L24-M + H +. (H) غي | 152939117 + H +. (I) L27-M + H +. (J) S20-M + H +. (K) S15-M + H +. (L) S19-M + H +. (M) كتلة مكثفة التعتيم متغير ذروة العلامات البيولوجية المحتملة من البروتين الريباسي S18. (N) S20-M + 2H +. (O) L15-M + 2H +. X-محاور: كتلة [دا] · تهمة 1 النسبة، على نطاق 200 دا. Y-محاور: كثافة [وحدات التعسفي]، تم تعديل أطياف بشكل فردي إلى مستوى الضجيج مقارنة لرؤية أفضل من القمم المنخفضة الحدة. "-M" بعد اسم الوحيدات الريباسي يدل على الإسوي-methioninated دي. يرجى النقر لهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: استنادا MSPP-phyloproteomic UPGMA شجرة تتضمن phyloproteomic UPGMA شجرة يصور نفسه سبعة C. الصائمية SSP. doylei العزلات وC. الصائمية SSP. السلالة الصائمية 81-176 كما في الشكل 1. واللون (رمز اللون كما في الشكل 1) بقعة يشير كل سلالة. لتحسين المقارنة يتم ترتيب العزلات في ترتيب المدخلات، الذي كان أمر الحصول عليها من الشجرة على أساس MLST. محور تحت dendrogram يشير إلى مسافات الربط. على الرغم من أن العلاقات phyloproteomic التي تم الحصول عليها ليست متطابقة تماما إلى شجرة النشوء والتطور على أساس MLST، الصورة العالمية غير قابلة للمقارنة. يقسم المجتمع إلى مجموعتين: ثلاثة يعزل LMG 8843، LMG 8870، وLMG 9243 شكل clust واحدإيه، في حين LMG 9255، LMG 9143، LMG 8871 وLMG 7790 شكل مجموعة الثانية. وفي هذا LMG عنقودية 7790 يبين أطول مسافة phyloproteomic مقارنة subcluster التي شكلتها LMG 9255، LMG 9143، وLMG 8871. وفي هذا LMG subcluster 9143 مفاتيح موقف فيما يتعلق LMG 9255. ومع ذلك، حتى باستخدام MSPP-طريقة كل عزل يمثل فرد نوع MSSP تسلسل. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: محسوبة الجماهير من جميع ORFS المشروح للC. الصائمية SSP. doylei آي تي سي سي 49349 سلالة قائمة من جميع الأوزان الجزيئية monoisotopic تحسب كل البروتين المشفرة في C. الصائمية SSP. doylei آي تي سي سي 49349 الجينوم. تم استخدام الموارد البوابة إكسباسي المعلوماتية الحيوية لحساب الجماهير الجزيئية معينة. يسرد العمود B الأشكال الإسوية methioninated في حين عمود تسرد C الأشكال الإسوية-methioninated دي. الجماهير العلامات البيولوجية المدرجة في C. ويسلط الضوء على الصائمية SSP. doylei مخطط MSPP باللون الأحمر. ملاحظة: لم يتم المشروح وL36 البروتين العلامات البيولوجية في تسلسل جينوم C. الصائمية SSP. doylei ATCC49349. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 2: التغيرات الجماعية الناجمة عن التغيرات الأحماض الأمينية نظرا لتعدد الأشكال واحدة تم فحص جميع الأشكال النووية المنفردة المحتملة لتبادل الأحماض الأمينية الناتجة باستخدام الشفرة الجينية القياسية. تم تجاهل كل الطفرات الصامتة، والطفرات nonsynonymous جمعت جنبا إلى جنب مع دورة الفتشوبlting التغيير الشامل. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 3: الاشعال النوكليوتيد تستخدم لتسلسل C. الصائمية SSP. doylei الجينات المدرجة في MSPP-مخطط الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 4: نظرة عامة على كل الأشكال الإسوية المدرجة في C. الصائمية SSP. doylei MSPP-مخطط. يسرد الجدول كل هذا أيونات العلامات البيولوجية المدرجة في C. الصائمية SSP. doylei MSPP الشوريالهيم. وبالنظر إلى تسلسل الأحماض الأمينية من سلالة إشارة آي تي ​​سي سي 49349 تماما. لمزيد من الإسوية اكتشافها، يتم سرد بدائل معينة فقط من الأحماض الأمينية. ويشمل ترقيم الأحماض الأمينية دائما بداية ميثيونين. إذا يشير قياس الطيف الكتلي غيابها، أنه مكتوب بين قوسين (M). لكل الكتلة الجزيئية الإسوي، يشار الفرق الشامل لمرجع سلالة ATCC 49349 الإسوية وتردد ضمن مجموعة البيانات الإسوي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في إنشاء مخطط MSPP هي تحديد الجيني لا لبس فيه الهويات العلامات البيولوجية أيون. إذا لم يكن من الممكن تحديد العلامات البيولوجية مما لا شك فيه، ومن ثم ينبغي أن تستبعد من مخطط 13.

وC. ويشمل الصائمية SSP. doylei مخطط 14 أيونات العلامات البيولوجية المختلفة. هذه هي 5 أقل مقارنة C. الصائمية SSP. مخطط الصائمية MSPP 13. وأهم الفرق بين جيم كشفها الصائمية SSP. الصائمية و C. وكانت الصائمية SSP. doylei المؤشرات الحيوية لإزالة posttranslational من ميثيونين الأمينية المحطة في حالة L31 (-M) وL35 (-M) 13.

كما هو مبين في C. اختبار الصائمية SSP. doylei عزل جمع، وكان قادرا على التمييز عن سبعة مختلفة MLST أنواع تسلسل MSPP. وهذا يعني أن كل عزلة واختبار ينتمي إلى sequ MSPP محددنوع جزأين. بالإضافة إلى ذلك، MSPP يسمح السلالة التمايز بين C. الصائمية SSP. الصائمية و C. الصائمية SSP. doylei.

بشكل عام، القدرة على التمييز العزلات على مستوى أقل من سلالة من MSPP هو أقل بالمقارنة مع الطرق الحمض النووي القائم على التسلسل مثل MLST. على افتراض قاعدة بيانات الإسوي راسخة، والتصنيف الفرعي العزلات البكتيرية هو أرخص أسرع بكثير وبكثير بالمقارنة مع الطرق تسلسل الحمض النووي 4 و 13.

وأكبر ميزة لMSPP بالمقارنة مع طرق التجميع الهرمي من ICMS-أطياف مثل استخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) 4، 10، 28 أو تحليل UPGMA مصفوفة رياضية نتائج المقارنة ذروة مطابقة ثنائي محات 29، 30 هو استنساخ الذاتية العالية. وفي حين أن ظروف ثقافية مختلفة مثل الثقافيه مختلفةوسائل الإعلام الإلكترونية، ورسوم أجار مختلفة، مختلفة درجة حرارة الحضانة، وفترات حضانة مختلفة تؤثر تأثيرا كبيرا على العلاقات phyloproteomic تحسب PCA، فإنها لا تؤثر على العلاقات MSPP استنتاجها 6 و 13. والسبب الرئيسي لذلك هو استنساخ عالية استقلال ذروة كثافة ونوعية الطيف الشامل في العام 13. إذا لا يمكن تحديد الذروة MSPP ذات الصلة في الطيف الكتلي لعزل بلا شك، فمن الضروري لتسجيل الطيف الكتلي للعزلة الفرد مرة أخرى.

ويمكن تكييف طريقة MSPP، من حيث المبدأ، على كل الأنواع الميكروبية. خاصة، والتصنيف الفرعي من الأنواع الميكروبية السريرية ذات الصلة مثل المطثية العسيرة، الإشريكية القولونية، المكورات العنقودية الذهبية، والسالمونيلا الملهبة للSSP. الملهبة والتطبيقات المستقبلية المحتملة. إذا كان التعبير من عوامل الفوعة أو الجينات المقاومة يرتبط مع phylالعلاقة oproteomic، MSPP يمكن أن تصبح وسيلة مبتكرة في التشخيص السريري الروتيني. يحتمل أن يزداد عدد القمم التي يمكن اكتشافها، وبالتالي عدد أيونات العلامات البيولوجية المدرجة في مخطط MSPP باستخراج محددة و / أو بروتوكولات تحلل، وخاصة في حالة الفطريات 31.

يمكن للتقنيات MALDI-TOF المستخدمة مؤخرا كشف أساسا فقط البروتينات الريباسي وفيرة للغاية. هذه البروتينات وفيرة للغاية تتداخل مع ما يقرب من جميع البروتينات الأخرى الأصغر حجما مثل عوامل الفوعة في الطيف الكتلي. يمكن أن يتم الكشف عن البروتينات الصغيرة من خلال ربط ESI-TOF-MS (Electrospray الوقت التأين مطياف الكتلة رحلة) وHPLC (عالية الأداء اللوني السائل) 32. ومع ذلك، في هذا الأسلوب هو أيضا العمالة وتكلفة مكثفة لتميز الأفواج عزل أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Tags

علم الوراثة، العدد 116، MALDI-TOF، أقل من الأنواع التمايز، phyloproteomics، ICMS،
التصنيف الفرعي لل<em&gt; العطيفة الصائمية</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt; يعزل عن طريق PhyloProteomics أساس الطيف-قداس (MSPP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, … More

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter