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Genetics

sottotipizzazione di Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

Massa phyloproteomics spettrometria-based (MSPP) è stato utilizzato per digitare una collezione di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati a livello di sforzo rispetto a tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS offre la possibilità di differenziare alcuni batteri non solo a livello di specie e sottospecie ma anche al di sotto, a livello di ceppo. isoforme alleliche del ioni biomarcatori rilevabili provocano spostamenti di massa specifico per isolare. phyloproteomics spettrometria di massa a base di (MSPP) è una tecnica innovativa che combina le spettrometria di massa masse biomarcatori rilevabili in uno schema che consente la deduzione delle relazioni phyloproteomic da isolare specifici turni di massa rispetto a un genoma sequenziato ceppo di riferimento. Le sequenze di amminoacidi dedotta vengono poi utilizzati per calcolare dendrogrammi MSPP-based.

Qui si descrive il flusso di lavoro di MSPP digitando un ssp Campylobacter jejuni. Doylei raccolta isolato di sette ceppi. Tutti e sette i ceppi erano di origine umana e multilocus sequenza di battitura (MLST) dimostrato la loro diversità genetica. MSPP-tipizzazione portato a sette diversi tipi di sequenze MSPP, sufficientemente che riflette la loro PHYrelazioni logenetic.

Il C. jejuni ssp. doylei schema MSPP comprende 14 diversi ioni biomarker, proteine soprattutto ribosomiali nel range di massa di 2 a 11 kDa. MSPP può in linea di principio, essere adattato ad altre piattaforme di spettrometria di massa con una gamma di massa estesa. Pertanto, questa tecnica ha il potenziale per diventare uno strumento utile per la tipizzazione microbica livello di deformazione.

Introduction

Durante l'ultimo decennio, matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) ha avanzato ad essere un metodo standard di grande valore per il genere microbica e l'identificazione delle specie in microbiologia clinica 1, 2. identificazione di specie si basa sulla registrazione di piccole impronte proteici di cellule intatte o lisati cellulari. La gamma di massa tipico di uno spettrometro di massa usata nella routine microbiologia clinica è 2-20 kDa. Inoltre, gli spettri risultante può essere utilizzato per discriminare ceppi ai sotto-specie e sotto-sottospecie livello 3. I primi studi pionieristici hanno identificato specifici ioni biomarker per un particolare sottogruppo di ceppi di Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica sierotipo Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, ed Escherichia coli 10 - 12.

La combinazione di diverse masse biomarker variabili corrispondenti alle isoforme alleliche offre la possibilità per il sottotipo più profondo. In precedenza, abbiamo implementato con successo un metodo per convertire queste variazioni nei profili di massa nelle relazioni phyloproteomic significative e riproducibili chiamate di massa phyloproteomics basate spettrometria (MSPP) su un C. jejuni ssp. collezione jejuni isolare 13. MSPP può essere utilizzato una spettrometria di massa equivalente alle tecniche basate sottotipizzazione sequenza del DNA, come la tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

Specie Campylobacter sono la principale causa di gastroenterite batterica in tutto il mondo 14, 15. Come conseguenza di Campilobatteriosi sequela post-infettive, cioè, sindrome di Guillain Barre, artrite reattiva e la malattia infiammatoria intestinale può sorgere 16. Le principali fonti di infezione sonodi carni animali contaminati da pollo, tacchino, suino, bovino, ovino e le anatre, il latte e di superficie 15, 17. Pertanto, sono necessari studi di sorveglianza epidemiologica regolari nel contesto della sicurezza alimentare. MLST è il "gold standard" nella tipizzazione molecolare per le specie Campylobacter 18. Poiché il Sanger-sequenziamento metodo MLST base è alta intensità di lavoro, che richiede tempo e relativamente costosa, MLST digitazione è limitata a relativamente piccole coorti isolare. Pertanto, vi è la necessità di metodi sottotipizzazione più economico e rapido. Questa esigenza potrebbe essere soddisfatta con metodi di spettrometria di massa come MSPP.

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per MSPP-tipizzazione mediante una raccolta di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati e il confronto delle sue potenzialità con MLST.

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Protocol

1. Preparare un ambiente di lavoro sicuro, considerando biosicurezza Condizioni

  1. Acquisire familiarità con le norme di laboratorio e di sicurezza che sono di rilevanza per l'utilizzo di microrganismi. La maggior parte dei microrganismi patogeni umani devono essere gestite a livello di biosicurezza 2 condizioni, ma alcuni, come la Salmonella enterica sierotipo Typhi, richiedono livello di biosicurezza 3. Informazioni sul livello di gestione di ogni agente patogeno si può accedere a www.cdc.gov/biosafety.
  2. Indipendentemente dalla classificazione di rischio biologico del microrganismo specifico, considerare tutti i materiali che al contatto con l'agente infettivo come rifiuti infettivi che devono essere autoclave prima dello smaltimento. Rispettare le linee guida di sicurezza regionali per materiali pericolosi e sostanze biologiche. Garantire che i contenitori adatti per lo smaltimento immediato e corretto di materiali potenzialmente contaminati (rischi biologici) sono disponibili.
  3. Garantire che gli strumenti sterili (loop inoculazione), soluzioni e terreni di coltura (piastre di agar) sono disponibili prima di iniziare la coltura batterica.
  4. Lavare le mani con sapone antisettico e acqua calda subito dopo aver maneggiato microrganismi infettivi.

2. Selezionare di riferimento e la raccolta Isolati

  1. Selezionare e ottenere uno standard di riferimento del genoma sequenziato-isolare insieme con le sequenze del proteoma codificato, idealmente in formato FASTA. Se più ceppi genoma sequenziato sono disponibili, includerli nell'analisi.
    Nota: Questo isolato / questi isolati saranno successivamente essere utilizzato per prevedere l'identità dei picchi di massa osservati in spettrometria di massa (vedi sezione 7).
  2. Selezionare e ottenere una serie di potenziali diversi isolati in modo tale da coprire l'filogenesi della specie o sottospecie di interesse.
    Nota: Questi isolati saranno in seguito utilizzati per dimostrare la variabilità dei biomarcatori nella popolazione (vedi sezione 8).
  3. Assicurarsi che l'intera collezione e isolato di riferimento (s) sono proPerly digitato dal rispettivo gold standard per questo particolare organismo 18 - 20.
    Nota: Questo può includere una varietà di (sotto) i metodi -typing, ma è probabile che ricorrere a MLST, che è ancora il metodo standard per dimostrare la diversità genetica della maggior parte delle specie microbiche.
  4. Per inferire la filogenesi all'interno della collezione, calcolare un phylogram dai dati di battitura, ad esempio, utilizzando il metodo non ponderata gruppo coppia con media aritmetica (UPGMA) nel software per i dati MEGA6 MLST 21. Per i dati MLST, consultare anche un database MLST e assegnare tipi di sequenze e rispettivi complessi clonali 22.
    Nota: Questo sarà successivamente essere utilizzato per analizzare la congruenza del MSPP con il metodo di tipizzazione gold standard in precedenza (vedi paragrafo 9).

3. Preparare una piastra MALDI target

ATTENZIONE: TFA è un acido forte. L'uso improprio di TFA si assume il rischio di ustioni della pelle, danni agli occhi e grave irritazione of tratto respiratorio superiore se inalato. Pertanto, le misure di sicurezza rigorose devono essere rispettati e è necessario un equipaggiamento di protezione individuale (DPI) tra cui occhiali di sicurezza, visiere, guanti, stivali adeguati, o addirittura una tuta protettiva completa, durante la manipolazione TFA. Possibile esposizione a TFA deve essere controllato da manipolazione della sostanza sotto una ventilazione adeguata con un sistema di ventilazione di scarico efficace. In caso di ventilazione insufficiente, deve essere utilizzato un respiratore con filtro approvato. Inoltre, TFA è nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. Qualsiasi rilascio di TFA nelle acque reflue per l'ambiente deve essere evitata.

Nota: Prima di individuare i campioni su un bersaglio MALDI, pulire la piastra segnale a fondo se la piastra è stata utilizzata in precedenza.

  1. Preparare la soluzione acquosa di etanolo al 100 ml di 70% con 30 ml di acqua deionizzata e 70 ml di etanolo puro.
  2. Preparare 250 ml di acido trifluoroacetico acquosa all'80% di soluzione (TFA) mescolando 50ml di acqua deionizzata e 200 microlitri 100% TFA in un tubo di reazione e vortex la provetta per 1 min.
  3. Pulire la porta MALDI mettendolo in un piatto di vetro e submersing in etanolo acquoso al 70% per circa 5 min a temperatura ambiente.
  4. Risciacquare il bersaglio sotto l'acqua calda.
  5. Usando un fazzoletto di carta, pulire la piastra segnale intensamente con il 70% in soluzione acquosa di etanolo per rimuovere tutti i campioni precedenti e altri detriti potenziale.
  6. Se è necessaria una pulizia più approfondita, sciacquare con acqua calda mentre asciugandosi con un fazzoletto di carta.
  7. Rimuovere i contaminanti residui, e potenzialmente invisibili,, coprendo la superficie di destinazione con un sottile strato di 80% acquosa TFA (~ 100 ml per 96 punti) e pulire tutte le posizioni di destinazione pulite con un fazzoletto di carta.
  8. Infine, sciacquare l'obiettivo di eliminare l'acido, asciugarlo con un fazzoletto di carta, e lasciarlo per almeno 15 minuti a temperatura ambiente per far evaporare il liquido residuo.

4. Preparazione di45; ciano-4-idrossi-cinnamico Matrix soluzione acida contenente un Calibrant interno

  1. Preparare una soluzione di matrice satura sciogliendo 10 mg α-ciano-4-idrossi-cinnamico acido (HCCA) in 1 ml di una miscela di 50% acetonitrile, acqua 47,5% e 2,5% TFA. Residuo indisciolto HCCA rimarrà se la soluzione è satura.
  2. Aggiungere insulina umana ricombinante come un calibrante interna. Per questo, preparare una soluzione madre ad una concentrazione finale di 10 pg / ml nel 50% acquosa acetonitrile, aliquotare e conservare a -20 ° C per un ulteriore uso.

5. MALDI-TOF spettrometria di massa

Nota: è necessario utilizzare specifiche condizioni di coltura per i microrganismi di interesse. I campioni per MALDI-TOF MS possono essere preparati mediante preparazione striscio o di estrazione, a seconda del microrganismo (vedere la sezione 8.4.1). Mentre il metodo di estrazione di acido formico etanolo-fornisce sufficienti inattivazione degli agenti patogeni, la preparazione striscio deve essere eseguita sotto suffcondizioni di biosicurezza icient come richiesto (vedi capitolo 1). Di solito, non vi è alcun rischio di infezione dopo l'applicazione della matrice, ma per patogeni specifici sono richiesti protocolli specifici inattivazione. Così, per esempio MALDI-TOF MS di specie Nocardia richiede precedente lisi dei batteri in acqua bollente, seguito da precipitazione in etanolo di proteine 23. EI Khéchine et al. sviluppato un procedimento per l'inattivazione di micobatteri, riscaldando le colonie batteriche a 95 ° C per 1 ora in provette con tappo a vite contenenti acqua e 0,5% Tween 20 24.

  1. Smear Preparazione
    1. Stendere una quantità capocchia di spillo dimensioni di una colonia batterica direttamente su una posizione piastra segnale MALDI ( 'spot').
    2. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di HCCA matrice regolare o matrice contenente il calibrante interna e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente. Per la determinazione della massa esatta del picco di calibrazione, sovrapporre un sp di controlloOT con 1 ml di prova standard e 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna.
      Nota: Qui, come prova standard un estratto di Escherichia coli DH5 alfa viene utilizzato che dimostra un'impronta digitale proteina caratteristica MALDI-TOF MS. Si è drogata con due proteine ​​che estendono il limite superiore del range di massa rilevabile.
  2. Metodo di estrazione
    1. Harvest circa cinque colonie da una cultura piastra di agar con un ciclo di inoculo e accuratamente sospendere in 300 ml di acqua bidistillata in una provetta da 1,5 ml di reazione. Aggiungere 900 ml di etanolo assoluto e mescolare bene pipettando ripetutamente fino a quando le colonie batteriche sono completamente sospese.
      Nota: A questo punto è possibile e ben stabilito conservare i campioni a -20 ° C. Inoltre, l'inattivazione degli agenti patogeni può essere testato strisciando 1-10 ml di estratto su una piastra di agar adatto a seguito di incubazione a condizioni di crescita ottimali. successo inattivazione è indicato dall'assenza di crescita microbica.
    2. Centrifugare il campione a 13.000 xg per 1 minuto, scartare il surnatante, e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti. Risospendere il pellet accuratamente pipettando su e giù in 50 ml di acido formico al 70%.
    3. Aggiungere 50 ml di acetonitrile e mescolare. Rimuovere i detriti per centrifugazione a 13.000 xg per 2 min. Trasferimento 1 ml di surnatante SU UN posizione del campione su una piastra segnale MALDI e lasciare asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna e lasciare cristallizzare a temperatura ambiente.
  3. La registrazione della Messa Spectra
    Nota: Picco-picking da spettri di massa viene fatto usando le procedure standard consigliate (algoritmo Centroide; Rapporto S / N:. 2; rel soglia Intensità: 2%; larghezza del picco di 3 m / z, sottrazione della linea di base: TopHat)
    1. Calibrare lo strumento secondo ProtoC dei costruttoriolo.
    2. Per ogni punto, raccogliere 600 spettri in 100 colpi passi.
      1. Vai alla scheda "AutoXecute" del software di configurazione dello spettrometro di massa. Aprire il "Metodo" di sinistra-clic sul pulsante "Metodo" e la scelta del metodo ad esempio, "MBT_AutoX" dal menu a tendina.
      2. Sinistro del mouse con il tasto destro "Modifica ..." del menu "Metodo" per aprire la "AutoXecute Method Editor". Vai alla scheda "accumulazione". Impostare la "somma up" valore "600" ed i "colpi soddisfacenti" _X_ "passi Shot" valore "100".
  4. Spectrum interno Procedura di calibrazione
    Nota: gli errori di misurazione Minute sono inerenti alla spettrometria di massa. A seconda dell'uso strumento intermittente, temperatura dello strumento e ri-calibrazione, i valori di misurazione ottenuti possono variare tra esperimenti. Dopo la calibrazione dello strumento di pre-misurazione e post-misurazione di calibrazione spettro di un calibrante interna è il modo più preciso per garantire inter-spettro comparabilità.
    1. Eseguire le seguenti procedure per ogni lista di picco di taratura:
      1. Inizia spettro browser (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto:. Menu "File" → "Apri ...")
      2. Crea elenco di controllo di massa con calibrante picco: menu "Method" → "Apri ...".
      3. Scegli il metodo di: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Apri".
      4. Modifica Mass Control List: deselezionare tutte le calibranti.
      5. Aggiungere Calibrant picco a fondo: Etichetta di punta: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5.808,29"; Tolleranza [ppm]: "50"; Controllare casella Calibrant.
      6. Salva come, ad esempio, "lista calibrante MSPP".
    2. Per ogni spettro, scegli il picco calibrante dalla lista, fare clic su "Assegna automatica" e premere "OK".
ove_title "> 6. Verificare la procedura di calibrazione interno

  1. Sperimentalmente determinare la massa esatta del picco di calibrazione.
    1. Preparare due punti con 1 ml di prova standard ciascuna (fase 5.1.1). Sovrapporre il primo con 1 ml di matrice regolare HCCA, la seconda a matrice calibrante-spillo 1 ml.
    2. Ottenere spettri di massa da ogni punto (paragrafo 5.3), e calibrare internamente per i picchi di test standard (sezione 5.4).
    3. Sovrapporre entrambi gli spettri aprendole con il browser dello spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ...") e trovando il picco a La massa prevista (insulina m / z = 5,808.29), che dovrebbe essere presente in lo spettro calibrante-spillo, ma non nello spettro ottenuto con la matrice regolare.
  2. Verificare che il Calibrant Peak non è oscurate da altre Biomarker del Organismo di interesse.
    1. Preparare due punti (paragrafo 5.1) con il ceppo di riferimento e overlay il primo con 1 ml di matrice regolare, la seconda a matrice calibrante-spillo 1 ml.
    2. Acquisire spettri di massa da entrambi i punti (paragrafo 5.3) e sovrapporre gli spettri risultante aprendole con il browser dello spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ..."). Assicurarsi che il picco calibrante è chiaramente visibile nello spettro ottenuto con la matrice spillo e non oscurata da un altro segnale adiacenti. Se questo non è il caso, scegliere un'altra calibrante per questo particolare organismo.
      Nota: Utilizzando un calibrante interna spillo aumenta notevolmente la precisione per determinare le variazioni delle masse biomarker. Utilizzando questo metodo, le differenze di massa fino a 1 Da possono essere rilevati. In alternativa, anche masse invarianti provenienti dagli organismi possono essere utilizzati come calibratori. Tuttavia, per definizione, tutte le masse organismo di derivazione devono essere considerati potenzialmente variabile, fino a prova contraria.

  1. Misurare la massa spettro del ceppo di riferimento, Usare Matrix spillo con il Calibrant interno.
    1. Stendere una quantità capocchia di spillo dimensioni di una colonia batterica (paragrafo 5.1) o di 1 ml di estratto di proteine ​​batteriche (paragrafo 5.2) direttamente su una posizione piastra segnale MALDI ( 'spot').
    2. Sovrapposizione ogni punto con 1 ml di matrice HCCA che contiene il calibrante interna e lasciare la piastra segnale a cristallizzare a temperatura ambiente (sezione 5.1.2 / 5.2.4).
    3. spettri Record massa del ceppo di riferimento (paragrafo 5.3).
  2. Internamente calibrare lo spettro di riferimento alla massa calibrante (qui: insulina a m / z = 5,806.29), e successivamente pre-processo per sottrazione della linea di base (TopHat) e levigante (parametri: SavitzkyGolay; larghezza: 2 m / z, 10 cicli).
    1. Avviare il browser spettro (ad esempio, flexAnalysis e lo spettro aperto: menu "File" → "Apri ...; ").
    2. Scegli il metodo di: menu a tendina "Metodo" → "Apri ...", sinistro del mouse il metodo di scelta, ad esempio, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Apri".
    3. Calibrare spettro scegliendo "interno ..." dal menu a tendina "Calibra". Si apre una finestra che elenca il picco calibrante (s) (sezione 5.4). Sinistro del mouse il picco calibrante (insulina) → Sinistra-clic su "OK". Scegliere "spettri di processo" dal menu a tendina "Processo".
    4. Per sottrazione basale installa lo spettro nell'elenco spettro sul lato destro. Scegliere "Sottrarre Spettro di massa di base" dal menu a tendina "Processo".
    5. Per smussare lo spettro, attivare la spettro nell'elenco spettro sul lato destro. Scegliere "Smooth Spettro di massa di base" dal menu a tendina "Processo".
  3. Dai dati sequenziamento del genoma del ceppo di riferimento, il calcolo del Theoretical monoisotopico peso molecolare di ciascuna delle proteine ​​codificate da tradurre la sequenza di DNA nella sequenza amminoacidica corrispondente utilizzando un editor di allineamento di sequenze. Copia-incolla questo sequenza della proteina nella casella di input al portale ExPASy Bioinformatica Resource (http://web.expasy.org/compute_pi/). e premere il tasto "Clicca qui" per calcolare pi / Mw. Nel caso di C. jejuni ssp. doylei calcolare la massa di 14 biomarcatori rilevabili.
  4. Copiare i risultati in un foglio, con una colonna contenente l'identificatore gene e la successiva il peso molecolare. Ordina le righe in peso molecolare calcolata per facilitare la semplice ricerca delle masse. Nota: altre colonne sono opzionali; annotazione funzionale può essere particolarmente utile in seguito per l'interpretazione.
  5. Inserire una seconda colonna nel foglio di calcolo del peso molecolare della forma de-methioninated, sottraendo 135 Da dal peso molecolare monoisotopico. Nota: Questo è perché alcune proteine ​​subiscono postaletraduzionali mediante rimozione proteolitica della metionina -Terminal N.
  6. Assegnare ogni grande massa biomarker misurato alle masse calcolati dal ceppo di riferimento, cercando la massa misurata dalla tabella genoma preparata sopra (Tabella 1).
  7. Se gli ioni biomarker non possono essere assegnati ai prodotti genici previsti, in considerazione altre modificazioni post-(metilazione, acetilazione, prenilazione, ecc; vedere http://www.abrf.org/delta-mass per una raccolta di modifiche e cambiamenti di massa associati ). Per qualsiasi altro noto modificazione post-traslazionale che è frequente negli organismi di interesse aggiungere un'altra colonna alla tabella e ricalcolare il peso molecolare analogo al processo per la forma de-methioninated.
  8. Impostare un'altra scheda foglio di calcolo, e registrare per ogni biomarker ioni la massa e l'identificatore in una colonna tabella separata.

8. Valutare Biomarker Variabilitànella popolazione

  1. Calibrare spettri di massa ottenuti dalla raccolta isolati, come fatto per il ceppo di riferimento (s) (sezione 5.4.2).
  2. Identificare biomarcatori variante negli spettri di massa. Una massa variante è caratterizzata dall'assenza di una massa nota dallo spettro di riferimento e l'aspetto di una massa romanzo non presenti nel riferimento. La differenza di massa deve essere conforme ad un singolo scambio amminoacido (Tabella 2), o una loro combinazione.
  3. A un isolato per riga, registrare la massa misurata per ogni biomarker e l'isoforma previsto nelle rispettive colonne della tabella.
    Nota: Raramente, alcuni spostamenti di massa possono essere attribuibili a diversi scambi aminoacidi differenti, ad esempio, sia, N scambiato da D e Q scambiato da E, e viceversa, comporta uno spostamento massa di 0.985 Da (Tabella 2). Questo problema intrinseco non può essere risolto mediante spettrometria di massa da solo. Pertanto, diverse isoforme a livello di sequenza proteina avente la stessa massadevono essere trattati come un unico tipo MSPP. Parallel Sanger sequenziamento dei geni particolari ioni biomarker confermato che questo problema non si è verificato mentre MSPP-digitando il C. jejuni ssp. doylei isolare raccolta utilizzato in questo studio.
  4. Confermare nuovi tipi MSPP di PCR-amplificazione e sequenziamento dei rispettivi geni biomarker. A sua volta, questo serve anche come la conferma che l'identità biomarker è stato assegnato correttamente.
    1. Coltura batterica isola in condizioni di crescita ottimali. Cultura C. jejuni ssp. doylei ceppi su Columbia agar integrato con sangue di pecora 5% a 37 ° C in condizioni microaerofili (5% O 2, il 10% di CO 2, 85% N 2). Incubare per ca. 48 hr. Utilizzare una piastra di agar separato per ogni isolato per evitare la contaminazione incrociata.
    2. Estrarre il DNA genomico degli isolati batterici utilizzando un macchinario adeguato kit di estrazione del DNA / automatico in base alle istruzioni del produttore.
      3. <li> amplificano i rispettivi geni biomarker utilizzando i primer elencati nella tabella 3 Eseguire tutte le reazioni PCR nelle seguenti condizioni:. denaturazione a 94 ° C per 30 sec; annealing a 55 ° C per 30 sec; allungamento a 72 ° C per 30 sec.
    3. Determinare la sequenza di DNA di ciascun amplicone da Sanger sequenziamento utilizzando una quantità appropriata di DNA genomico (di solito 600-700 ng di DNA è sufficiente ad una concentrazione di circa 100 ng / ml) e uno dei primer di amplificazione (solitamente ciò avviene uso di un fornitore di servizi).
  5. In una tabella separata (vedi tabella 4), registrare la sequenza della proteina dedotta per ogni romanzo isoforma utilizzando uno strumento di traduzione appropriata (ad esempio, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Calcolare una filogenesi MSPP-based e confronta con il Gold Standard

  1. Concatenare i particolari sequenze di amminoacidi biomarker che appartiene a tegli MSPP tipo degli isolati in una sequenza continua utilizzando un editor di allineamento di sequenze, come BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 o il foglio di calcolo biomarker.
  2. Calcolare filogenesi per il clustering, come fatto per i dati di tipizzazione gold standard, ad esempio, il clustering UPGMA 21.
  3. Confrontare la filogenesi MSPP-based a quella ottenuta con il gold standard 4, 13.

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Representative Results

In precedenza, abbiamo stabilito con successo un sistema di MSPP per C. jejuni ssp. jejuni 13. Qui, abbiamo voluto estendere il metodo per il fratello sottospecie C. jejuni ssp. doylei. In questo contesto specifico, sette C. jejuni ssp. doylei isolati sono stati acquisiti dalla collezione belga di microrganismi / Laboratorio di Microbiologia UGent BCCM / LMG Gand, in Belgio. Tutti i sette isolati utilizzati per le nostre analisi erano di origine umana. Il ceppo del genoma sequenziato-ATCC 49349 (LMG 8843), originariamente isolato dalle feci di un 2-year-old bambino australiano con diarrea servito come riferimento. Dalla collezione, sei ceppi supplementari erano disponibili: LMG 9143, LMG 9243, e LMG 9255 isolati da feci di bambini che soffrono di diarrea e vivono a Bruxelles, Belgio; LMG 7790 (ATCC 49350) isolato da un campione bioptico gastrica di un individuo dalla Germania; e LMG 8870 (NCTC A613 / 87), così come LMG 8871 (NCTC A603 / 87), sia isolato da diversi campioni di sangue prelevato da bambini sudafricani.

Tutto C. jejuni ssp. doylei isolati sono stati conservati a -80 ° C come scorte Cryobank, appena scongelati per ogni analisi e coltivate utilizzando Columbia agar base supplementato con 5% di sangue di pecora e incubazione per 48 ore a 37 ° C in condizioni microaerofili (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2).

In contrasto con la costituzione della tecnica MSPP per C. jejuni ssp. jejuni 13 non è stato possibile basare il metodo su un database isoforma derivato da una raccolta sequenza più ampia. Solo un unico C. jejuni ssp. doylei entrata era presente nel database rMLST, e ciò corrisponde alla ceppo di riferimento C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 27. Pertanto, ogni biospostamento di massa marcatore rilevato rispetto al ceppo C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 è stato una nuova voce nel database isoforma e aveva bisogno di essere riconfermati dal sequenziamento Sanger.

Per analizzare la diversità della ottenuto C. jejuni ssp. doylei isolati, MLST è stata eseguita ed un UPGMA-dendrogramma MLST-based tra cui le sette esaminato C. jejuni ssp. doylei isolati e C. jejuni ssp. ceppo jejuni 81-176 come outgroup calcolato (Figura 1). Ogni C. jejuni ssp. doylei isolato apparteneva ad un diverso tipo MLST-sequenza, cadendo in due sottocluster. Strain LMG7790 aveva la distanza filogenetica più lunga rispetto alla restante C. jejuni ssp. doylei isolati.

Lo spettro di massa di riferimento registrabile MALDI-TOF di C. jejuni ssp. doylei (Figura 2).

All'interno della collezione, sono stati rilevati isoforme diverse per L32-M, L33, l'ipotetico proteina codificata da gi | 152.939.117, S20-M, e S15-M (figura 3). I restanti masse assegnate a ioni biomarker erano invariabile nella testata C. jejuni ssp. doylei isolati. La sostituzione amminoacidica corrispondente alle variazioni di massa sono stati identificati mediante PCR-amplificazione e Sanger sequenziamento del gene particolare utilizzando i primers riportati in Tabella 3. Tabella 4 elenca le sequenze aminoacidiche di tutti gli ioni biomarker inclusi nel sistema MSPP nonché le isoforme alleliche rilevati.

Un UPGMA- phyloproteomic MSPP-basedalbero (Figura 4) è stato calcolato per lo stesso sette C. jejuni ssp. doylei isolati e C. jejuni ssp. ceppo jejuni 81-176 come outgroup utilizzando le sequenze di amminoacidi concatenati di tutti i 14 ioni biomarker in funzione del loro peso molecolare nel ceppo di riferimento. Ogni isolato rappresentava un tipo MSPP-sequenza individuale. Sebbene i rapporti phyloproteomic ottenuti non erano completamente identici a quelli ottenuti con MLST, il C. jejuni ssp. doylei isolati di nuovo organizzato in due sottocluster. Il primo subcluster era formata da LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243, la seconda dal LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 e LMG 7790. Come si è visto con il MLST-analisi, isolare LMG7790 hanno mostrato la distanza più lunga del phyloproteomic MSPP- analisi.

Figura 1
Figura 1: MLST-based filogenetico UPGMA-albero. Balanced MLST a base UPGMA-dendrogramma costruito da sette C. jejuni ssp. doylei isolati e C. jejuni ssp. ceppo jejuni 81-176. codice di colore Strain: LMG 8843 (nero), LMG 8870 (grigio), LMG 9243 (blu), LMG 9255 (turchese), LMG 9143 (verde), e LMG 8871 (rosa), LMG 7790 (giallo), e 81- 176 (bianco). Il tipo MLST sequenza viene dato dietro il nome di ogni isolato. Ogni C. jejuni ssp. doylei isolare appartiene a un diverso tipo MLST-sequenza. Asse X indica le distanze di collegamento. Strain LMG 7790 mostra la distanza filogenetica più lunga rispetto alle rimanenti sei isolati. I ceppi LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243 così come LMG 9255, LMG 9143, e LMG 8871 formano due sottocluster differenti all'interno del C. jejuni ssp. doylei cluster. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: assegnazione Provvisorio di correlati genomica di C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) alle masse biomarker osservati. Sulla base delle masse calcolati (composizione isotopica media) di ORF previsti dalla intera sequenza del genoma di C. jejuni ssp. doylei ceppo ATCC 49349, masse biomarker sono stati assegnati alla corrispondente proteina sequenze codificanti. Tuttavia, all'interno del campo di misura, le masse biomarker per le subunità ribosomiale L31 (MW = 7.315 Da), S17 (MW = 9.549 Da) e S18 (Mw = 10.285 Da), così come i loro isoforme de-methioninated (inserto m / z = 7,000-7,200 da) non poteva essere senza ambiguità assegnato. Pertanto, L31, S17, e la S18 non sono stati inclusi nella C. jejuni ssp. doylei schema MSPP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: specifici picchi di massa biomarker del C. jejuni ssp. doylei schema MSPP. In ogni pannello gli spettri di massa di tutti e sette testati C. . jejuni ssp doylei isolati (codice di colore come in figura 1) corrispondente alle particolari tipi MSPP sono stati sovrapposti per indicare cambiamenti massa biomarker causa isoforme alleliche: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; (E) S14-M + H +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, e L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) gi | 152.939.117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H +; (L) S19-M + H +; (M) una massa intensa oscurando variabile potenziale di picco biomarker di proteina ribosomiale S18; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X-Assi: massa [Da] · carica-1 ratio, in scala 200 Da. Y-Assi: intensità [unità arbitrarie], gli spettri sono stati adeguati individualmente a un livello di rumore paragonabile per una migliore visualizzazione dei picchi a bassa intensità. "-M" Dopo il nome di una subunità ribosomiale indica l'isoforma de-methioninated. Cliccate suoe per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. MSPP-based phyloproteomic UPGMA-albero Il phyloproteomic UPGMA-albero raffigurato include lo stesso sette C. jejuni ssp. doylei isolati e C. jejuni ssp. ceppo jejuni 81-176 come in Figura 1. A (codice di colore come in Figura 1) di colore della macchia indica ogni ceppo. Per una migliore confronto degli isolati sono disposte in ordine di ingresso, che era l'ordine ottenuto dalla pianta MLST-based. L'asse di sotto del dendrogramma indica le distanze di collegamento. Anche se i rapporti phyloproteomic ottenuti non sono del tutto identico a quello albero filogenetico MLST-based, il quadro globale è paragonabile. La popolazione si divide in due gruppi: i tre isolati LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243 forma una clustER, mentre LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 e LMG 7790 forma un secondo cluster. All'interno di questo gruppo LMG 7790 indica la distanza più lunga phyloproteomic rispetto al subcluster formata da LMG 9255, LMG 9143, e LMG 8871. All'interno di questo subcluster LMG 9143 interruttori di posizione in relazione alla LMG 9255. Tuttavia, anche utilizzando il MSPP-metodo di ogni isolato rappresenta un individuo di tipo MSSP-sequenza. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Calcolato masse di tutti ORF annotata del C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 ceppo. Elenco di tutti i pesi molecolari monoisotopico calcolati di ogni proteina codificata in C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 genoma. Il Resource Portal ExPASy bioinformatica è stato utilizzato per il calcolo delle particolari masse molecolari. Colonna B elenca le isoforme methioninated mentre la colonna C elenca le isoforme de-methioninated. Masse biomarker inclusi nel C. jejuni ssp. doylei schema MSPP sono evidenziati in rosso. Nota: la L36 proteina biomarker non è annotata nella sequenza del genoma di C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella 2:. Cambiamenti di massa indotte da cambiamenti di aminoacidi a causa di singoli SNPs Tutti i potenziali polimorfismi a singolo nucleotide sono stati controllati per il conseguente scambio di aminoacidi utilizzando il codice genetico standard. Tutte le mutazioni silenti sono stati scartati, e le mutazioni non sinonime compilati insieme al resulting variazione di massa. Cliccate qui per scaricare questo file.

Tabella 3: primer oligonucleotidi utilizzati per il sequenziamento del C. jejuni ssp. doylei geni inclusi nella MSPP-schema Cliccate qui per scaricare questo file.

Tabella 4: Panoramica su tutti isoforme incluso nel C. jejuni ssp. doylei MSPP-schema. Questa tabella elenca tutti gli ioni biomarker inclusi nella C. jejuni ssp. doylei MSPP sceme. La sequenza aminoacidica del ceppo di riferimento ATCC 49349 è dato completamente. Per ulteriori isoforme rilevabili, sono elencati sostituzioni aminoacidiche solo specifici. La numerazione aminoacido comprende sempre lo start-metionina; se la spettrometria di massa indica la sua assenza, è scritto tra parentesi (M). Per ogni massa molecolare isoforma, differenza di massa del ceppo di riferimento ATCC 49349 isoforme e frequenza all'interno del set di dati isoforma è indicato. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

La fase più critica nella creazione di un sistema MSPP è la determinazione genetica inequivocabile di identità biomarker di ioni. Se non è possibile identificare un biomarker senza dubbio, allora dovrebbe essere escluso dal regime 13.

Il C. ssp. doylei schema jejuni comprende 14 diversi ioni biomarker. Questi sono 5 meno rispetto al C. jejuni ssp. schema jejuni MSPP 13 .La differenza più significativa tra il rilevabile C. jejuni ssp. jejuni e C. jejuni ssp. doylei biomarcatori è stata la rimozione post-traslazionale della metionina amino-terminale in caso di L31 (-M) e L35 (-M) 13.

Come mostrato nella testata C. jejuni ssp. doylei isolare raccolta, MSPP è stato in grado di discriminare tutti i sette diversi tipi di sequenze MLST. Ciò significa che ogni isolare testato apparteneva ad una determinata Sequ MSPPTipo za. Inoltre, MSPP permette sottospecie differenziazione tra C. jejuni ssp. jejuni e C. jejuni ssp. doylei.

In generale, il potenziale di discriminare isola a livello di sotto-deformazione da MSPP è inferiore rispetto ai metodi basati sequenza di DNA come MLST. Assumendo un database isoforma consolidata, il sottotipo di isolati batterici è molto più veloce e molto più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento del DNA 4, 13.

Il più grande vantaggio di MSPP rispetto ai metodi di clustering gerarchici di ICMS-spettri come l'utilizzo delle componenti principali (PCA) 4, 10, 28 o analisi UPGMA della matrice matematica che i risultati del confronto di corrispondenza picco binario profili 29, 30 è l'elevata riproducibilità intrinseca. Mentre diverse condizioni culturali, come diverso culture mezzi di comunicazione, diversi oneri agar, temperatura di incubazione diversi, e diversi periodi di incubazione influenzano significativamente i rapporti phyloproteomic calcolati dal PCA, non incidono i rapporti MSPP dedotte 6, 13. La ragione principale di ciò alta riproducibilità è l'indipendenza della massima intensità e qualità spettro di massa in generale 13. Se un picco MSPP rilevante nello spettro di massa di un isolato non può essere identificata indubbiamente, è necessario registrare nuovamente lo spettro di massa dell'individuo isolato.

Il metodo MSPP può essere adattato, in linea di principio, per ogni specie microbiche. In particolare, il sottotipo di cliniche specie microbiche rilevanti come Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Salmonella enterica ssp. Enterica sono potenziali applicazioni future. Se l'espressione di fattori di virulenza o geni di resistenza è correlata con la Phylrapporto oproteomic, MSPP può diventare uno strumento innovativo nella diagnostica clinica di routine. Il numero di picchi rilevabili e così il numero di ioni biomarker inclusi nel sistema MSPP potrebbe potenzialmente essere aumentata utilizzando estrazione e / oi protocolli di lisi specifica, soprattutto nel caso di funghi 31.

Le tecniche MALDI-TOF utilizzate di recente in grado di rilevare principalmente solo i molto abbondanti proteine ​​ribosomali. Questi altamente abbondanti proteine ​​interferiscono con quasi tutte le altre proteine ​​più piccole come i fattori di virulenza nello spettro di massa. Proteine più piccole potrebbero essere rilevate collegando ESI-TOF-MS (elettrospray tempo di ionizzazione della spettrometria di massa di volo) e HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) 32. Tuttavia, attualmente questo metodo è troppo lavoro e dispendiosa per caratterizzare coorti isolare più grandi.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

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References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

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Genetica MALDI-TOF sotto-specie di differenziazione phyloproteomics ICMS, MSPP microbiologia
sottotipizzazione di<em&gt; Jejuni Campylobacter</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolati Utilizzando PhyloProteomics Spettrometria di Massa-based (MSPP)
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