इष्टतम Lentivirus उत्पादन और सेल संस्कृति शर्तों के लिए आवश्यक सफलतापूर्वक transduce प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला (HBe) कोशिकाओं हवा तरल इंटरफेस की स्थिति एक उपयोगी मॉडल का उपयोग प्रदान करता है एयरवे सेल भेदभाव और समारोह की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो संस्कृति में। पिछले कुछ वर्षों में, ट्रांस्जीन प्रसव के लिए lentiviral वैक्टर का उपयोग आम बात बन गई। जबकि वहाँ कुछ गैर एचआईवी छद्म टाइप lentiviruses के साथ पूरी तरह से विभेदित एयरवे उपकला कोशिकाओं के पारगमन की खबरें हैं, कुल मिलाकर पारगमन क्षमता आम तौर पर कम से कम 15% है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और कारगर तरीका lentiviruses का उत्पादन करने और प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं transduce को प्रदान करता है। , Undifferentiated ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, ब्रोन्कियल उपकला विकास मीडिया में पारगमन का उपयोग 4 के संक्रमण के कारक की बहुलता के साथ, जबकि कोशिकाओं देते हैं 100% के करीब क्षमता प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है, कदम-दर-कदम, तैयारी और उच्च अनुमापांक lentiviral वैक्टर और वीं की एकाग्रताई पारगमन की प्रक्रिया। यह प्रयोगों है कि इष्टतम संस्कृति की स्थिति निर्धारित की प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं की अत्यधिक कुशल transductions को प्राप्त करने की चर्चा है।
Introduction
प्रतिकृति-दोषपूर्ण, छद्म lentiviruses के विकास (एल.वी.) विट्रो 1 में ट्रांसजीन वितरित करने के लिए एक सुरक्षित और कारगर तरीका शोधकर्ताओं के साथ प्रदान की गई है। उनके दीर्घकालिक अभिव्यक्ति के कारण, इन एल.वी. भी विवो 2,3 में चिकित्सीय एजेंट के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एल.वी. का उत्पादन कई plasmids के साथ मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) कोशिकाओं के सह अभिकर्मक की आवश्यकता है: हस्तांतरण वेक्टर, पैकेजिंग झूठ / पोल, पैकेजिंग फिरना, और vesicular stomatitis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (VSV जी) plasmids लिफाफा। तीसरी पीढ़ी के पैकेजिंग सिस्टम दूसरी पीढ़ी प्रणालियों की तुलना में सुरक्षित माना जाता है क्योंकि फिरना जीन एक अलग पैकेजिंग प्लाज्मिड पर इनकोडिंग है, जिससे पुनर्संयोजन की संभावना एक प्रतिकृति सक्षम lentivirus उत्पादन करने के लिए कम करने। हालांकि दूसरी पीढ़ी पैकेजिंग सिस्टम उपज पांच गुना अधिक कुल पारगमन इकाइयों, मूल वायरल जीनोम का विभाजन पैदा करने के लिएतीसरी पीढ़ी प्रणाली केवल न्यूनतम 3,4 पारगमन के स्तर में कमी आई है।
सेल लाइनों और अधिक आसानी से और कुशलता से transduced किया जा सकता है, शोधकर्ताओं, प्राथमिक कोशिकाओं के लिए उनके ध्यान स्थानांतरित कर दिया है, क्योंकि इन विवो के अधिक प्रतिनिधि ऊतकों 5,6 हैं। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं पारगमन को आग रोक रहे हैं। जबकि पूरी तरह से भेदभाव कर एयरवे उपकला कोशिकाओं के पारगमन सूचित किया गया है, समग्र दक्षता 15% 7 को पार नहीं किया है।
यहाँ वर्णित एक प्रोटोकॉल है कि उच्च अनुमापांक LVS के उत्पादन की अनुमति देता है। एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण प्राथमिक HBE कोशिकाओं में लगभग 100% पारगमन दक्षता हासिल करने के लिए दिए गए है। अधिक विशेष रूप से, प्रोटोकॉल 3 सफल होने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई इष्टतम संस्कृति की स्थिति का वर्णन है। संक्षेप में, HEK 293T कोशिकाओं EF-1 प्रमोटर बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट की ड्राइविंग अभिव्यक्ति के साथ lentiviral अभिव्यक्ति वेक्टर pCDH का उपयोग कर रहे हैं ट्रांसफ़ेक्टप्रोटीन (EGFP) या mCherry, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और एक तीसरी पीढ़ी पैकेजिंग प्रणाली। मीडिया में जारी LVS बाद में 24 से 72 घंटा के लिए एकत्र कर रहे हैं। वायरस कणों एक पी 24 प्रतिजन एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) किट का उपयोग कर अनुमापांक अनुमान से पहले, पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), वायरल एकाग्रता के लिए एक सुविधाजनक और आसान विधि के साथ केंद्रित कर रहे हैं। बाद में, undifferentiated प्राथमिक HBE कोशिकाओं, प्रसार मीडिया (ब्रोन्कियल उपकला मध्यम विकास या BEGM) 8 में transduced रहे हैं, जबकि संक्रमण की बहुलता पर (trypsinized किए जाने के बाद) संलग्न, (MOI) 4 के कारक, hexadimethrine ब्रोमाइड जोड़ने और 16 घंटे के लिए incubating ( रातोंरात)। कोशिकाओं तो अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है। चूंकि वायरल ट्रांस्जीन लंबी अवधि व्यक्त किया जाता है (उचित प्रमोटर का उपयोग कर, चर्चा देखें), अभिव्यक्ति या एक pseudostratified एयरवे उपकला में भेदभाव भर में बनाए रखा जाएगा भेदभाव के बाद (एक inducible प्रमोटर का उपयोग) प्रेरित किया जा सकता है।
<p clगधा = "jove_content"> इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो सेल लाइनों के बजाय प्राथमिक HBE कोशिकाओं का उपयोग करना चाहते करने के लिए व्यापक हित के लिए है, और दूसरी मुश्किल के लिए अनुकूलनीय प्रकार की कोशिकाओं transduce करने के लिए हो सकता है।Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित 100% पारगमन क्षमता के करीब का आश्वासन दिया। हालांकि, वहाँ है कि इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं की प्रक्रिया के दौरान कदम उठाए हैं। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक प्रक्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फेफड़ों प्रदान करने के लिए मियामी विश्वविद्यालय के लाइफ एलायंस अंग रिकवरी एजेंसी धन्यवाद। हम यह भी डीएनए चित्रा 2 बी और 3-डी, सी के लिए आंकड़े 3 ए में प्रयोगों के लिए इस्तेमाल mCherry वायरस के लिए डॉ बेन Gerovac और लिसा नोवाक में दिखाया प्रयोगों के लिए इस्तेमाल तैयारी के लिए डॉ लिसा Künzi धन्यवाद हम भी गेब्रियल Gaidosh धन्यवाद इमेजिंग सुविधा से, मियामी विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान विभाग।
इस अध्ययन एनआईएच, सीएफ फाउंडेशन और उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान डॉ मथायस Salathe करने से अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया है।
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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