正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
初代ヒト気管支上皮（HBE）細胞のインビトロ培養で気液界面条件を用いて気道細胞の分化と機能の過程を研究するための有用なモデルを提供します。過去数年間で、導入遺伝子の送達のためのレンチウイルスベクターの使用は、一般的な慣行となりました。特定の非HIV擬似型付けされたレンチウイルスと完全に分化した気道上皮細胞の形質導入の報告がありますが、全体的な形質導入効率は、通常15％未満です。ここで紹介するプロトコルは、レンチウイルスを生成すると、一次ヒト気管支上皮細胞を形質導入するために信頼性の高い効率的な方法を提供します。細胞が付着しながら4の感染因子の多重度で、未分化の気管支上皮細胞、気管支上皮増殖培地で形質導入を使用すると、100％に近い効率を提供します。このプロトコルは、高力価のレンチウイルスベクターの、ステップ・バイ・ステップ、準備と集中を説明し、第電子伝達プロセス。これは、初代ヒト気管支上皮細胞の高効率形質導入を達成するために最適な培養条件を決定した実験について説明します。
Introduction
複製欠損、偽レンチウイルス（LV）の開発は、 インビトロ 1 で導入遺伝子を提供するために、安全かつ効率的な方法で研究者に提供してきました。それらの長期発現のために、これらのLVはまた、 インビボ 2,3 における治療剤の送達のために使用することができます。トランスファーベクター、パッケージングのgag / POL、パッケージ回転 、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）プラスミドエンベロープ：LVの製造は、いくつかのプラスミドを有するヒト胚腎臓（HEK）細胞の同時トランスフェクションを必要とします。 rev遺伝子は、別々のパッケージングプラスミド上にコードされているため、第三世代のパッケージングシステムは、それによって複製コンピテントレンチウイルスを生成するための組換えの可能性を低減する、第二世代のシステムよりも安全と考えられています。第二世代のパッケージングシステムが5倍高い総伝達ユニットを得ているが、元のウイルスゲノムの分割が作成します第三世代のシステムは、最小限3,4形質導入のレベルを減少しました。
細胞株は、より容易かつ効率的に形質導入することができるが、これらは、 インビボの組織5,6のより代表的なものであるため、研究者らは、一次細胞へのフォーカスをシフトしています。しかし、初代細胞は、形質導入に不応性です。完全に分化した気道上皮細胞の形質導入が報告されているが、全体の効率は15％7を超えていません。
ここで説明した高力価のLVの製造を可能にするプロトコルです。ステップバイステップのアプローチは、一次HBE細胞中にほぼ100％の形質導入効率を達成するために概説されています。具体的には、プロトコルは、3を成功するために尽力し、最適な培養条件を説明します。簡単に言えば、HEK 293T細胞を、強化緑色蛍光のEF-1プロモーター駆動発現を有するレンチウイルス発現ベクターpCDHを用いてトランスフェクションされていますタンパク質（EGFP）またはmCherryを、赤色蛍光タンパク質、および第三世代のパッケージングシステム。培地中に放出されたLVは24〜72時間後に回収されています。ウイルス粒子は、p24抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キットを用いて力価を推定する前に、ポリエチレングリコール（PEG）、ウイルス濃度の便利で簡単な方法で濃縮されています。 、4の（トリプシン処理された後）、感染の多重度（MOI）因子を取り付けるヘキサジメトリンブロミドを添加し、16時間インキュベートしながら、その後、未分化の一次HBE細胞（増殖培地（気管支上皮成長培地またはBEGM）8で形質導入され一晩）。次いで、細胞を分化させます。ウイルス導入遺伝子は（説明を参照してください、適切なプロモーターを用いて）、長期発現されるので、式は多列気道上皮への分化を通して維持されますまたは分化後（誘導性プロモーターを使用して）誘導することができます。
<p clお尻= "jove_contentは">このプロトコルは、細胞株の代わりに、一次HBE細胞を使用する研究者への幅広い関心のある、および細胞型を形質導入する他の困難に適応できる可能性があります。Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、100％の形質導入効率に近い保証します。しかし、この目標を達成するために重要な工程中のステップがあります。例えば、トランスフェクションプロセスの間に、日形質導入（ 図1b及びd）の後、形質導入ミックス（ドロップ）または皿の中の析出物の存在は、両方の良いトランスフェクションのために関連しています。沈殿物または?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は肺を提供するためのマイアミ大学のライフアライアンスオルガン回復庁に感謝します。我々はまた、我々はまた、ガブリエルGaidoshに感謝図2Bおよび3-D、Cに図3（a）に実験に使用しmCherryをウイルス博士ベンGerovacとリサ・ノヴァクに示す実験に使用したDNA調製のために博士リサキュンチに感謝しますイメージング施設から、マイアミ大学眼科学科。
この研究は、NIH、CF財団博士マティアスSalatheへのフライトアテンダント医学研究所からの助成金が主催されています。
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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