Summary

Optimal lentivirus Produktion og Cell Culture nødvendige betingelser for at Succesfuld transducere Primary humane bronchieepithelceller

Published: July 22, 2016
doi:

Summary

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Abstract

In vitro kultur af primære humane bronkial epitelial (HBE) celler ved hjælp af luft-væske grænseflader giver en nyttig model til at studere de processer af luftvejene celledifferentiering og funktion. I de seneste år er anvendelsen af ​​lentivirale vektorer til transgen levering blev almindelig praksis. Mens der er rapporter om transduktion af fuldstændigt differentierede luftvejsepitelceller med visse ikke-HIV pseudo-maskinskrevne lentivira, den samlede transduktion effektivitet er normalt mindre end 15%. Protokollen præsenteres her tilvejebringer en pålidelig og effektiv metode til at producere lentivira og at transducere primære humane bronkiale epitelceller. Brug af udifferentierede bronkiale epitelceller, transduktion i bronchieepithelceller vækstmedium, mens cellerne vedhæfte, med en infektionsmultiplicitet faktor 4 tilvejebringer effektivitet tæt på 100%. Denne protokol beskriver, trin-for-trin, forberedelse og koncentration af høj titer lentivirusvektorer og the transduktion proces. Det diskuterer de eksperimenter, der bestemmes de optimale dyrkningsbetingelser for at opnå højeffektive transduktion af primære humane bronkiale epitelceller.

Introduction

Udviklingen af replikationsdefekte, pseudotype lentivira (LV) har givet forskere med en sikker og effektiv metode til at levere transgener in vitro en. På grund af deres langsigtede ekspression, kan disse LV også anvendes til afgivelse af terapeutiske midler in vivo 2,3. Produktionen af LV kræver co-transfektion af humane embryoniske nyre (HEK) celler med flere plasmider: transfervektor, emballage gag / pol, emballage rev, og kuvert vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje generation emballeringssystemer anses sikrere end andengenerations systemer, fordi den rev-genet kodet på en separat emballage plasmid, hvorved muligheden for rekombination til frembringelse af et replikationskompetent lentivirus. Selvom andengenerations emballagesystemer giver fem gange højere samlede transduktion enheder, til opdelingen af ​​den oprindelige virale genom skabeden tredje generation systemet er faldet niveauet for transduktion kun minimalt 3,4.

Mens cellelinjer kan transduceres nemmere og mere effektivt, har forskere flyttet deres fokus til primære celler, fordi disse er mere repræsentative for in vivo væv 5,6. Men primære celler er refraktære over for transduktion. Mens transduktion af fuldt differentierede luftvejs epitelial celler er blevet rapporteret, har den samlede effektivitet ikke oversteget 15% 7.

Beskrevet her er en protokol, der tillader produktion af høj titer LVs. En trin-for-trin tilgang er skitseret til at opnå næsten 100% transduktion effektivitet i primære HBE-celler. Mere specifikt protokollen beskriver de optimale dyrkningsbetingelser instrumentale at lykkes 3. Kort fortalt HEK 293T-celler transficeret under anvendelse af lentiviral ekspressionsvektor pCDH med EF-1a-promotoren driver ekspression af et forstærket grønt fluorescerendeprotein (eGFP) eller mCherry, et rødt fluorescerende protein, og en tredje generation pakkesystem. LVs frigives til medierne indsamles 24 til 72 timer senere. Viruspartiklerne er koncentreret med polyethylenglycol (PEG), en praktisk og nem metode til viral fusion, før titer estimation under anvendelse af et p24-antigen enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) kit. Efterfølgende udifferentierede primære HBE-celler transduceres i proliferationsmedier (bronchieepithelceller vækstmedium eller BEGM) 8, medens fastgørelse (efter at være trypsiniseret) ved en infektionsmultiplicitet (MOI) faktor 4, tilføjer hexadimethrinbromid og inkubering i 16 timer ( natten over). Cellerne får derefter lov til at differentiere. Da den virale transgen udtrykkes langsigtet (ved hjælp af passende promotor, se diskussionen), vil ekspression opretholdes under hele differentiering til en pseudostratified luftvejsepitel eller kan induceres (under anvendelse af en inducerbar promotor) efter differentiering.

<p class = "jove_content"> Denne protokol er af bred interesse for forskere, der ønsker at bruge primære HBE-celler i stedet for cellelinjer, og måske kunne tilpasses andre vanskeligt at transducere celletyper.

Protocol

1. Trin 1: Culture of HEK 293T Forbered HEK-celler medier (benævnt HEK medier) ved tilsætning af 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin til høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM). Coat en 10 cm vævskulturskål med kollagen I. Mix 30 pi kollagen I i 2 ml destilleret vand. Spred blandingen på skålen og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Fjern blandingen og lad skålen tørre i en laminar strømning i 15 min. </…

Representative Results

Figur 1 viser forskellige vigtige trin til vurdering celler og løsninger under transfektionsproces. Figur 1A viser den optimale konfluens på HEK293T celler før transfektion til virusproduktion. Det er vigtigt, at cellerne er jævnt fordelt i hele skålen. Figur 1b viser bundfaldet i en dråbe af transfektionsblandingen ved hjælp af lyse felt optik og en 10X objektiv. Jo mere præcipitaterne ligne sandkorn snarere end agglomerater, vi…

Discussion

Protokollen beskrevet her sikrer tæt på 100% transduktionseffektiviteter. Men der er skridt i løbet af processen, der er vigtige for at nå dette mål. For eksempel under transfektionsproces, tilstedeværelsen af præcipitater i transduktionen mix (drop) eller i skålen dagen efter transduktion (figur 1b og d) begge relevante for en god transfektion. Fraværet af et bundfald eller tilstedeværelsen af ​​agglomerater kan skyldes en udeladelse af en af ​​transfektionsreagenser,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Life Alliance Organ Recovery Agency fra University of Miami for at levere lungerne. Vi takker også Dr. Lisa Künzi for DNA præparat, der anvendes til forsøgene er vist i figur 2B og 3-D, Dr. Ben Gerovac og Lisa Novak for mCherry virus anvendt til forsøgene i figur 3A til C. Vi takker også Gabriel Gaidosh fra imaging facilitet, Institut for Oftalmologi ved University of Miami.

Denne undersøgelse er blevet sponsoreret af tilskud fra NIH, CF Foundation og stewardesse Medical Research Institute til Dr. Matthias Salathe.

Materials

HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

References

  1. Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
  2. Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
  3. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
  4. Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
  5. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
  6. Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
  7. Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
  8. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
  9. Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
  10. Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
  11. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
  12. Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
  13. Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
  14. Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
  15. Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
  16. Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
  17. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
  18. Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
  19. Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
  20. Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
  21. Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
  22. Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
  23. Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).

Play Video

Cite This Article
Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

View Video