Optimal lentivirus Produktion og Cell Culture nødvendige betingelser for at Succesfuld transducere Primary humane bronchieepithelceller
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
In vitro kultur af primære humane bronkial epitelial (HBE) celler ved hjælp af luft-væske grænseflader giver en nyttig model til at studere de processer af luftvejene celledifferentiering og funktion. I de seneste år er anvendelsen af lentivirale vektorer til transgen levering blev almindelig praksis. Mens der er rapporter om transduktion af fuldstændigt differentierede luftvejsepitelceller med visse ikke-HIV pseudo-maskinskrevne lentivira, den samlede transduktion effektivitet er normalt mindre end 15%. Protokollen præsenteres her tilvejebringer en pålidelig og effektiv metode til at producere lentivira og at transducere primære humane bronkiale epitelceller. Brug af udifferentierede bronkiale epitelceller, transduktion i bronchieepithelceller vækstmedium, mens cellerne vedhæfte, med en infektionsmultiplicitet faktor 4 tilvejebringer effektivitet tæt på 100%. Denne protokol beskriver, trin-for-trin, forberedelse og koncentration af høj titer lentivirusvektorer og the transduktion proces. Det diskuterer de eksperimenter, der bestemmes de optimale dyrkningsbetingelser for at opnå højeffektive transduktion af primære humane bronkiale epitelceller.
Introduction
Udviklingen af replikationsdefekte, pseudotype lentivira (LV) har givet forskere med en sikker og effektiv metode til at levere transgener in vitro en. På grund af deres langsigtede ekspression, kan disse LV også anvendes til afgivelse af terapeutiske midler in vivo 2,3. Produktionen af LV kræver co-transfektion af humane embryoniske nyre (HEK) celler med flere plasmider: transfervektor, emballage gag / pol, emballage rev, og kuvert vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G) plasmider. Tredje generation emballeringssystemer anses sikrere end andengenerations systemer, fordi den rev-genet kodet på en separat emballage plasmid, hvorved muligheden for rekombination til frembringelse af et replikationskompetent lentivirus. Selvom andengenerations emballagesystemer giver fem gange højere samlede transduktion enheder, til opdelingen af den oprindelige virale genom skabeden tredje generation systemet er faldet niveauet for transduktion kun minimalt 3,4.
Mens cellelinjer kan transduceres nemmere og mere effektivt, har forskere flyttet deres fokus til primære celler, fordi disse er mere repræsentative for in vivo væv 5,6. Men primære celler er refraktære over for transduktion. Mens transduktion af fuldt differentierede luftvejs epitelial celler er blevet rapporteret, har den samlede effektivitet ikke oversteget 15% 7.
Beskrevet her er en protokol, der tillader produktion af høj titer LVs. En trin-for-trin tilgang er skitseret til at opnå næsten 100% transduktion effektivitet i primære HBE-celler. Mere specifikt protokollen beskriver de optimale dyrkningsbetingelser instrumentale at lykkes 3. Kort fortalt HEK 293T-celler transficeret under anvendelse af lentiviral ekspressionsvektor pCDH med EF-1a-promotoren driver ekspression af et forstærket grønt fluorescerendeprotein (eGFP) eller mCherry, et rødt fluorescerende protein, og en tredje generation pakkesystem. LVs frigives til medierne indsamles 24 til 72 timer senere. Viruspartiklerne er koncentreret med polyethylenglycol (PEG), en praktisk og nem metode til viral fusion, før titer estimation under anvendelse af et p24-antigen enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) kit. Efterfølgende udifferentierede primære HBE-celler transduceres i proliferationsmedier (bronchieepithelceller vækstmedium eller BEGM) 8, medens fastgørelse (efter at være trypsiniseret) ved en infektionsmultiplicitet (MOI) faktor 4, tilføjer hexadimethrinbromid og inkubering i 16 timer ( natten over). Cellerne får derefter lov til at differentiere. Da den virale transgen udtrykkes langsigtet (ved hjælp af passende promotor, se diskussionen), vil ekspression opretholdes under hele differentiering til en pseudostratified luftvejsepitel eller kan induceres (under anvendelse af en inducerbar promotor) efter differentiering.
<p class = "jove_content"> Denne protokol er af bred interesse for forskere, der ønsker at bruge primære HBE-celler i stedet for cellelinjer, og måske kunne tilpasses andre vanskeligt at transducere celletyper.Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her sikrer tæt på 100% transduktionseffektiviteter. Men der er skridt i løbet af processen, der er vigtige for at nå dette mål. For eksempel under transfektionsproces, tilstedeværelsen af præcipitater i transduktionen mix (drop) eller i skålen dagen efter transduktion (figur 1b og d) begge relevante for en god transfektion. Fraværet af et bundfald eller tilstedeværelsen af agglomerater kan skyldes en udeladelse af en af transfektionsreagenser,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Life Alliance Organ Recovery Agency fra University of Miami for at levere lungerne. Vi takker også Dr. Lisa Künzi for DNA præparat, der anvendes til forsøgene er vist i figur 2B og 3-D, Dr. Ben Gerovac og Lisa Novak for mCherry virus anvendt til forsøgene i figur 3A til C. Vi takker også Gabriel Gaidosh fra imaging facilitet, Institut for Oftalmologi ved University of Miami.
Denne undersøgelse er blevet sponsoreret af tilskud fra NIH, CF Foundation og stewardesse Medical Research Institute til Dr. Matthias Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
