Abstract
人的大脑是一个高耗能的器官，主要依靠葡萄糖作为燃料来源。葡萄糖通过脑线粒体经由糖酵解，三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化（OXPHOS）途径分解代谢以产生三磷酸腺苷（ATP）形式的细胞能量。线粒体ATP生产的减值导致线粒体病，这与著名的神经和肌病临床症状出现。线粒体缺陷也存在于神经发育障碍（ 例如自闭症谱系障碍）和神经变性疾病（ 如肌萎缩性侧索硬化症，阿尔茨海默氏症和帕金森氏病）。因此，存在在该领域的兴趣增加为下都健康和疾病状态进行线粒体形态，结构和分布的三维分析。大脑线粒体形态极其多样，一些线粒体尤其是突触区域在<200纳米的直径，这低于传统的光学显微镜的分辨率极限的范围内。表达在大脑中线粒体靶向的绿色荧光蛋白（GFP）显著增强了共焦显微镜的细胞器检测。然而，它不克服上检测相对小尺寸的线粒体的灵敏度的限制，而不过饱和的大尺寸的线粒体中的图像。而串行传输电子显微镜已成功地用于在神经元突触表征线粒体，这种技术是非常费时比较多个样品时，更是如此。串行块面扫描电子显微镜（SBFSEM）技术涉及切片，组织和数据采集的成像块的自动化过程。在这里，我们提供从啮齿动物的大脑进行限定区域的SBFSEM迅速重建和可视化线粒体形态的协议。这种高科技NIQUE还可以用于提供一个限定大脑区域对线粒体数目，体积，尺寸和分布的准确信息。由于所获得的图像分辨率高（一般低于10纳米）的任何毛线粒体形态的缺陷也可以被检测。
Introduction
线粒体是改变它们的形状和根据蜂窝线索和需要的位置，在与细胞骨架紧密相互作用动态的细胞器，并响应于细胞事件例如在神经元1钙电流。线粒体也相互作用与其他细胞器，例如内质网，从而调节其动力学和代谢2。线粒体形态示出了在不同的细胞类型异质性即细胞器的形状从管状变化到该组成的片材，袋和椭圆3。它已经表明，线粒体融合和分裂周期蛋白可调节的位置，大小，形状和线粒体4的分布。此外，在线粒体的形状变化与神经变性，神经元可塑性，肌肉萎缩，钙信号传导，活性氧产生以及寿命和细胞死亡牵连塔相关联T细胞特异性线粒体形态是维持正常细胞功能5-11的关键。
线粒体的主要生物能量的功能是通过执行一系列涉及通过 TCA循环的营养物质完全崩溃（ 即葡萄糖，脂肪，酸或氨基酸）和氧化磷酸化途径12代谢反应，产生三磷酸腺苷（ATP）。人脑只占2％体重但是它消耗〜生产使它极其能量苛刻器官13的总能量的20％。因此，并不奇怪，在人类线粒体功能障碍导致的大量神经系统表现14-17中。在OXPHOS部件遗传变异的损害ATP生成导致线粒体紊乱17,18，它们是疾病的临床异质组〜1的患病率：5000的个人，和m的最常见的原因之一etabolic障碍的儿童和成人。线粒体来源的ATP的赤字影响多器官系统具有高能量要求的器官，如脑，心脏和骨骼肌被在这些患者14,17,18主要影响。近年来，多研究已经在这两个神经发育和神经变性疾病15-17,19,20线粒体功能障碍提供了证据。因为线粒体是必要的，对大脑发育和功能是至关重要的，必须开发出能分析健康和患病状态下的脑线粒体形态，结构，尺寸，数量和分布的变化的协议。小鼠模型与线粒体针对性的绿色荧光蛋白（GFP）已经生产可视化线粒体运动和定位大脑中的21,22。虽然这是检查线粒体运动和一般分布一个非常有用的工具，也有一些缺点，其中大型的源码Ë有限的分辨率和荧光显微镜的灵敏度。这些属性使得它难以跟踪的相对小的尺寸的线粒体。同样地，串行传输电子显微镜已成功地用于查看突触线粒体23，但这种方法是非常耗时。线粒体形态是已知的，因为它们经受连续裂变和聚变周期是高度动态的，并且在大多数细胞线粒体维持一个高度连接的网络24-26。神经元是高度极化与多个树突和延长轴突，并形成在所述电池主体连接的网状网络线粒体细胞可能具有分开，因为它们使自己通过这些突起（ 图1）的方式。这使得脑线粒体的大小和形状极其多样。例如，使用串行块面扫描电子显微镜（SBFSEM）技术，我们先前观察到，在突触外mitochondr的体积或尺寸的差十六个褶皱27 IA存在于神经末梢线粒体可以是一样多。
有用于执行体积几种方法分析28，它包括连续切片的TEM 29，自动化磁带收集超微SEM 30，聚焦离子束扫描电镜31以及SBFSEM 32。该SBFSEM分析具有在于其具有的分辨率，以提供对形态学形状，尺寸，分布和细胞器的数量的定量数据的优点，如在区域线粒体到大脑的1毫米。该技术操作也最苛刻的，与以往缺乏经验EM许多生物实验室的能力范围之内的数据采集和分析。商业仪器用于产生串行像部分的图像的出现使得组织的三维超微结构分析常规技术，其中，还允许以快速和可重复的方式28的无偏体积分析32描述和使用在神经生物学的领域中，基于由顿于1981年33。多项研究引入从那时起已经建立这种技术，因为在神经回路34的重建分析的主要工具的想法。此外，对于许多较小规模的项目，它提供的重建分析，以确定细胞器27,35-39。一直以来，获得的图像由低电压背散射电子衍生，结合不同的已知重金属染色技术的新染色方法被开发来提高分辨率40。
在本文中，我们提供了利用三维电子显微镜成像和基于已使用过被我们和其他人38,39,41方法脑线粒体的体积分析的协议。所使用的组织的后处理方法进行了先前由Deerinck 等人描述40。
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Protocol
伦理学声明：涉及动物主题程序已经批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在弗吉尼亚理工大学。
注意：极端的预防措施必须处理和处理在本协议中使用的几个组件时服用。使用前，地方机构的指导方针，健康和安全的做法，必须建立并遵守，特别是对四氧化锇，这是易失性和剧毒，醋酸铀，这既是一种重金属和放射性源，和硝酸铅，这是重金属毒物。二氨基硫脲（TCH）能分解产生易爆，有毒气体，如果处理不当。许多机构将在这些试剂通常利用并能提供援助EM核心设施。
1.脑组织及SBFSEM成像的制备
- 麻醉年轻（〜2 - 4月龄）C57黑色的鼠标（C57BL / 6J株）使用4 - 5％isofluraNE以下的机构准则。通过监控肌张力，缺乏随意运动和厌恶刺激像一条尾巴捏响应损失确认麻醉。
- 引脚上的解剖盘鼠标，并沿腹中线皮肤切口。使在皮肤进一步切口以暴露小鼠的左肋。切开隔膜，然后小心地解剖出来的胸腔沿周边露出跳动的心脏，然后使在右心房中的切口。
- 使用蝴蝶插管，导管插入左心室。灌注transcardially用10鼠标 - 20毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH值7.2，直到放血通过在肝脏的颜色变化确认。
注意：在肝脏的颜色的变化被用作指导确定放血的程度。确认从红棕色肝脏颜色变为淡粉色。 - 灌注transcardially使用10鼠标 - 20毫升2％戊二醛的醛和4％多聚甲醛在0.10M的二甲砷酸缓冲液（pH 7.2）制成，从内部迅速修复脑组织。固定是通过观察尾加强监视。
注意：在80ml水中溶解2.14克二甲胂酸钠的制备0.10M的二甲胂缓冲液（pH 7.2），添加盐酸以调节pH，并且使体积至100毫升水。 - 以下灌注，斩首鼠标，在4℃解剖大脑，随后固定在含有0.10M的二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）2％戊二醛和4％多聚甲醛48小时
- 48小时后，使使用振动400μm的冠状切片，然后小心地解剖感兴趣的区域中的脑（例如，海马）的解剖显微镜42下。精心修剪的组织，并采取保护方向的画面。
注意：在SBFSEM组织染色的后处理方法结合了各种重金属染色方法为了提高分辨率，并且基于由Deerinck 等人 40以前开发的方法。 - 洗戊二醛固定组织3次，每次在0.1M二甲胂酸盐缓冲液（pH 7.2）5分钟。
- 通过在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）单宁酸中溶解制备0.1％的单宁酸溶液。漩涡直至溶解，如有必要，通过0.45微米的滤网过滤。
- 后缀用二甲胂酸盐组织缓冲的0.1％单宁酸通过在1ml试剂30孵育 - 在RT 60分钟。
注意：温育时间取决于组织的大小，但30分钟最适合大多数组织中。 - 洗组织3次，每次在二甲砷酸缓冲液5分钟（pH值7.2）。
- 溶解0.3克亚铁氰化钾和0.86克次硫酸钠二甲胂在蒸馏水中H 2 O 10毫升（卫生署2 O）。保持冰的亚铁氰化钾溶液。使用前，加入10 mL 4％四氧化锇（OSO 4）。
- 染色，用2％的os组织90分钟溢价 - 亚铁氰化物溶液，在冰上。洗3次，每次5分钟用蒸馏水2 O
- 通过在10毫升的dh 2 O溶解0.1克TCH制备1％氨基硫脲（TCH）溶液由漩每隔10分钟，直到完全溶解溶解在60℃。遵守安全注意事项，同时处理TCH，特别注意避免使用金属，加热至高温，或允许解决干燥。
- 对待新鲜配制的1％TCH样品在室温下20分钟。洗3次，每次5分钟用蒸馏水2 O
- 稀释4％OSO 4比2％与卫生署2 O，染色组织由1小时孵育2％水溶液四氧化锇。洗组织3次，每次5分钟用卫生署2 O.
- 孵育样品O / N在1％醋酸铀用蒸馏水2 O 4℃。
- 准备沃尔顿的领先解决方案，天门冬氨酸（如Deerinck 等 40条所描述）。
- 溶解0.998克L-天门冬氨酸250毫升卫生署2 O然后以逐滴的方式添加10 N氢氧化钾（KOH），直到pH达到5.5。 pH调节后，在10ml天冬氨酸库存和热加0.066克硝酸铅至60℃30分钟。
- 冲洗组织用蒸馏水2 O和沃尔顿的天门冬氨酸铅染色在60℃烘箱30分钟孵化。洗3次，每次5分钟用蒸馏水2 O
- 通过一个分级系列使用的20％，50％，75％，85％和95％的乙醇冷却溶液，每次5分钟，醇的脱水的样品，然后100％乙醇3次，每次10分钟。
注意：从刚刚打开的瓶用100％的乙醇，作为开乙醇吸收空气中的水，并导致嵌入失败。较长的孵育将需要较大的组织样本。 - 洗样品2次，每次在氧化丙烯15分钟。
- 使使用25毫升树脂，10.5毫升DDSA15.5毫升NMA（纳迪克甲基酸酐）和1ml塑料包埋树脂（十二碳烯基琥珀酸酐），DMP-30（2,4,6-三二甲基氨基甲基苯酚）。通过摇动混合树脂。旋转并允许树脂直立，直到泡沫的决心。
注：这是标准的中等硬度的配方。其他类型的电子显微镜（EM）的塑料树脂均可使用，但应不是所有树脂SBFSEM工作预先用非必要的对照样品进行测试。 - 孵育组织O / N在50：嵌入树脂和环氧丙烷的50混合，在使氧化丙烯蒸发在大约8的期间即最初上限，则未加帽后2小时的小瓶 - 10小时。
- 转移组织至100％的新鲜嵌入树脂在干净小瓶中2小时。
- 在新鲜嵌入树脂中嵌入的样品，在平面模具含有印刷纸的标签，并在60℃下固化它们的烘箱中48小时。经过约1小时后，再次检查的组织安排和调整，如果需要进行调整。
- 修剪样品的感兴趣的区域，并安装在使用gellin铝销克氰基丙烯酸酯强力胶或导电环氧树脂，然后涂上胶态银膏周围块的两侧，以提供到铝销的导电路径。
- 检查使用配备在室超微级和低千伏背散射电子检测器32的扫描电子显微镜系统的组织标本。
注：获取在扫描电子显微镜（SEM）使用仪器 - 和现场培训和成为授权用户。另外，与小项目的研究人员或核心设施的合作是可能的。作为中小企业产生X射线辐射的训练也可能是必需的。 - 图像样本，请使用以下设置：2.25千伏，在5 - 10纳米/像素的分辨率，拥有80间场大小 - 在×250微米，Y（其他字段大小可能），50层厚 - 100纳米，总共有250 - 在一个16 600片 - 20小时的时间段。
注意：设置不同的显微镜之间有很大差异，INDI维杜阿尔样品，和所需的分辨率。这些设置应该产生对于许多样品容易解释的图像。
2.分析成像数据集
注：图片焦耳/斐济软件用于分析数据集和依赖于TrakEM2插件。可以使用各种的软件来执行的预处理步骤，可以是广泛的或次要根据经验水平并获得栈。使用开源软件的主要转换（ImageJ的版本1.50b，斐济下载2015年10月1日）的说明。
- 通过在软件中打开和选择菜单项的图像→类型→8位从原来的专有的16位图像将图像转换为8位TIFF格式。
- 如果在这一步自动对比度/亮度转换是不理想的图像，重新打开16位图像，然后按图像→调整→亮度/对比度。选择所有图像工作的范围，并点击应用。然后执行Çonversion。注意：在一些中小型企业，这一步可能需要显微镜制造商的软件。
- 如果需要的话，由于切片之间不可接受的图像运动（ 如漂流，由于充电），注册/对齐图像堆栈（菜单项→插件→登记线性StackAlignmentWithSIFT）。在大多数的注册软件，“翻译 - 只有”模式而不是“刚性体”进行设置。
注意：许多方法和软件可能工作：SIFT注册插件作品对于许多应用，有一个虚拟堆栈版本。- 如果需要的话，放大画布大小登记前（图像→调整→CanvasSize）或将其降低到感兴趣的区域（图像→作物）。
注：可能会出现一些漂移或张开，并尝试其他插件或软件可能会产生更好的效果。手动选择也可以（ 如 ImageJ的/斐济，插件→注册→ManualLandmarkSelection）。
- 如果需要的话，放大画布大小登记前（图像→调整→CanvasSize）或将其降低到感兴趣的区域（图像→作物）。
- 如果渴望DesirED，使用ImageJ（图像→缩放）规模图像更小，更易于管理的大小（ 如 25％）。
- 启动软件，选择文件→导入→图像序列，然后选择TIFF文件。
- 通过选择文件→新建→TrakEM2（空白）启动插件。两个窗口将打开;另一个负责管理项目和area_lists和其他管理跟踪，并作为“画布”被提及。
- 通过在画布进口右键点击加载图像堆栈到插件。选择导入并单击导入堆栈。在弹出的选项，请检查堆栈的虚拟框。
注意：虽然在图像栈中的软件已经打开，它们也必须在插件打开。如果虚拟堆栈复选框被选中的计算机可能运行更平稳。 - 创建后的贴图和栈被加载后，右键单击命名插件窗口下的项目。在模板山坳右键单击“新项目”UMN，并选择“添加新的孩子该项目。右击再次选择'area_list“。
- 设置项目与在画布上右击原电子显微镜照片设置同意的Z轴的比例，然后单击显示并选择校准。此外，通过在插件窗口中选择所有图层设置Z-规模，右击选择规模Z和厚度。
- 单击并拖动“项目”和所有的孩子“到项目对象部分在画布窗口中的”Z空间“选项卡下创建”区域列表“。
- 选择“区域列表”，然后右键单击，选择并设置一个颜色。现在，使用画笔工具跟踪对象，如线粒体，在电子显微镜图像。使用“Shift +点击”填写一个封闭的圈子，“按Ctrl +滚动”来放大和缩小，以及“Alt +单击”打开画笔光标变为一个橡皮擦。
- 选择10〜两个领域 - 15微米10 - 15微米的在图像的左上角和右下角，并确定这些区域内的所有线粒体，以允许每个数据集线粒体的偏采样。
- 在“画布”，观察和跟踪线粒体整个章节。注：线粒体是很暗/致密的细胞器出现，类似规模的直径和松散的圆柱形。由内膜形成了独特的嵴此细胞器内很容易分辨。
- 当跟踪完成后，右键单击在Z空间选项卡下的area_list，选择“显示在3D”。这将启动3D查看器插件来查看跟踪图像的三维重建。
- 为了进行线粒体体积测量，在3D查看器中选择对象，单击“编辑”标签，选择“对象属性”。线粒体体积估计与其他几个测量列在一起。
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Representative Results
我们表明，脑线粒体形态和大小是不同的神经元的子隔间异类。与慢病毒表达线粒体针对性的绿色荧光蛋白转低密度神经细胞共聚焦显微镜显示，居住在神经元胞体线粒体形成网状网，而那些居住在轴突远端表现出离散细长的形态（ 图1 AB）。使用SBFSEM技术，线粒体形态，大小，数量和分布在鼠脑进行分析。线粒体的三维（3D）图像是从在小鼠大脑海马既轴突和突触重建。突触前线粒体进行鉴定和突触前终扣窝藏驻地线粒体的数量进行定量。在树突与轴突隔室中观察到的线粒体的大小异质性（ 连接古尔1 CD）。此外，在小鼠大脑海马许多小突触前室是缺乏线粒体的（ 图2的AC）。既突触前和突触外线粒体的体积测量结果表明，该卷或驻留在神经元presynapses内线粒体的大小是比那些居住在突触外区域（ 图2 DF）显著小。有趣的是，两维（2D）的大小从200非躯体线粒体的无偏取样测定线粒体的分布表明，〜线粒体级分的11％位于下面光学显微镜的分辨率极限（ 图2G）。此外，通过SBFSEM分析获取的二维图像提供增加的分辨率的可视个体线粒体（ 图3 AB）的超微结构特征。由于组织的清晰可见的地形，能进一步地向蜂窝排版分类通过确定其邻近线粒体artment容易地识别结构如核（体细胞）和突触囊泡（突触前）（ 图3 AB）。为了鉴定存在于神经元突起线粒体，重建基于突触终扣分别42的存在或不存在作为轴突或树突各个过程。基于这些结果，我们建议SBFSEM是一个极有价值的分析技术来识别脑组织中和在线粒体结构和分配的任何总缺陷也可以使用该方法测定线粒体的形状，尺寸，数量和分布。由于大脑中的不同细胞类型的超微结构特征是不同的，对于例如 。在星形胶质细胞糖原颗粒存在，也有可能来分析脑线粒体的细胞类型特异性的差异。
图 1： 异质性神经元线粒体形态和分布皮质文化从产后第1天的乳鼠，用慢病毒表达线粒体针对性的绿色荧光蛋白（线粒体-GFP）转。 （A）显示的神经元胞体表达美图-GFP，注意线粒体形态的网状网络;怒江=核;比例尺=5μm以下。 （B）显示远端神经突起伸长线粒体形态;比例尺=5μm以下。 （C）从小鼠脑组织中产生的SBFSEM数据集代表的2D图像，所述线粒体染色为绿色，树突以蓝色和轴突膨体染色棕色染色;比例尺= 1微米。 （D）在小鼠的脑组织的神经突线粒体的三维重建，需要注意的树突和轴突线粒体indicat之间的尺寸差分别由大，小箭头编;比例尺= 1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 串行块面扫描电子显微镜（SBFSEM）分析显示在突触前末梢线粒体低丰度 （A）中从P15的野生型小鼠的海马中获得的SBFSEM数据集分析代表2D ultramicrograph。比例尺= 1微米。 （B）显示的10突触前神经末梢三维重建。请注意，只有4出10突触前末梢显示明显的线粒体;比例尺= 1微米。展示的173定量（C）条形图从SB重建神经末梢突触前FSEM数据分析。 （ 四 ）从SBFSEM数据显示，在蓝绿色和突触前线粒体突触外线粒体代表2D图像;比例尺= 1微米。使用该软件的SBFSEM数据集突触前和突触外线粒体（E）3D重建;比例尺= 1微米。 （F）的棒图表示突触外和突触前线粒体的体积。数据被绘制为均值±SEM; N = 3不同的数据集（包括62突触前线粒体共80突触外线粒体）; *描绘的p值= 0.0405。 （G）在图像中的所有四个角15 15微米的面积是显着的所有非体线粒体进行鉴定，以便随机抽样。 〜200线粒体的最小尺寸进行测定。饼图显示〜非躯体线粒体的11％是在维<200纳米，低于光学显微镜的分辨率极限。这个数字具有b个EEN从沙旺等 27改编。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 从小鼠脑外侧膝状体核2D图像SBFSEM（A）从外侧膝状体核（8/8微米）二维代表SBFSEM形象展示区域的详细地形。索玛和细胞核指示;比例尺= 2微米。 （ 二 ）通过红场面板A.注意线粒体内外膜以及形成的嵴清晰可见指示的区域的放大倍率。地形，关系到其他细胞器和细胞结构也观察到。 PS指示例如突触前线粒体和NS表示举例说明非突触（NS）体细胞线粒体的;比例尺= 1微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在神经系统的复杂性造成在重建大组织体积和分析的形态和细胞器的分布的显著挑战例如用足够的分辨率线粒体。多细胞，包括神经元，少突胶质细胞和扩展在三个维度众多流程的星形胶质细胞的脑组织43的内部交互。由于线粒体无论是在细胞和遥远的过程的SOMA所在，线粒体形态是神经系统（ 图1）非常多形性。具有足够分辨率足够三维结构信息，因此无法通过常规的光学显微镜技术如共焦或双光子显微镜44,45来获得。电子显微镜是目前唯一的技术，使大量的神经组织具有足够高的分辨率的重建工作。传统上，神经组织的三维重建已实现通过超薄切片29的串行部件透射电子显微镜（SSTEM）四然而，最近的技术进步已经改善容积电子显微镜的数据采集和自动化的质量。
SBFSEM是一个自动化的块面成像技术相结合的扫描电子显微镜的腔室内部连续切片，以便重建超过几百微米的三维组织结构，具有分辨率足以跟随最薄细胞过程，并确定小细胞器。这项技术开辟了定期重建都无脊椎动物和脊椎动物的神经系统的前景。它涉及多个步骤，包括样品制备，扫描电子显微镜操作，数据采集，图像后期处理和图像分析。这些程序需要专门的操作培训和认证的扫描电子显微镜的操作。三个因素是评论家人即 。解剖正确大脑解剖区域，从而获得高分辨率的图像，并执行适当的图像分析。解剖的从固定的脑组织的vibratome切片感兴趣的解剖区域之后，关键的是要拍照用于保存正确方向。此外，可能难以确定用于成像的正确部位。获取高分辨率图像取决于充分固定和适当的固定后染色程序。大脑往往要经历迅速恶化死亡后，其超微结构。因此，关键是要解决大脑中使用适当的穿心灌注方法的戊二醛溶液。这之后，应当为至少24小时，在戊二醛溶液中的大脑的进一步固定。由于图像分辨率是完全依赖于多种重金属染色方法的结合，关键是要遵循的固定后的方法中获得quantifiabl协议详述Ë图像。如在方法中描述的，应解决方案。最后，对于准确的图像分析的细胞器/ s到待分析应明确标识（ 例如 ，通过可视化超微结构特征）跟踪之前，软件准则必须严格遵守。所获取的图像的分辨率应该是已知的用于转换从像素到纳米为体积测量。
除了在该协议用于进行图像分析所描述的软件，其它可用的软件的像重构和克诺索斯也可以使用。虽然所描述的协议的重点是在神经系统观看线粒体，可以对其进行修改，以产生在各种组织的其他不同的亚细胞结构的高分辨率3D信息（ 如内质网，溶酶体等 ）。
虽然详细的故障排除指南扫描电子显微镜Øperation超出了本文（见仪器的用户手册和培训信息）的范围，在成像实验，了解如何解决他们可以帮助新用户或者那些通过协作/商业渠道获得的图像经常出现的一些问题。一个共同的问题是充电装置，它在包含很少或没有染色的材料树脂的区域，主要发生的样本。在“正面”形象（ 即细胞质呈现白色），细胞核，血管，空树脂大片，可能会出现“熏黑”。此外，充电也促进产生明显的图像变形局部光束漂移。可能的解决方案的仪器和样品之间变化。减少千伏设置降低了“黑化”的神器，但可能会促进更多的光束漂移。使用较低的真空模式，并且包括氮（N 2）气，水蒸汽等 。在该室也减少充电，但是在分辨率和Signa的一个显着的成本1对噪声比。第二个常见的问题是刀跳跃。较慢的扫描可能会导致块表面，其不均匀或不切断在所有的某些成像/切断循环束引起的损伤（ 即 ，连续的图像显示相同）。几种解决方案存在包括增加与减少的z分辨率的切削深度/片的厚度，提高扫描速度和必然接受噪点的图像，减少像素尺寸和接受较低的X / Y分辨率，并选择具有更强烈的染色样品或区域（如不良染色的区域更容易收取更多，损坏，并且需要较长的束曝光以获得具有可接受的图像信号到-noise比）。所述块面的碎屑再沉积是在图像伪影的偶尔源，并且如果这经常发生，可能需要暂停采集，并小心地在清洁刀（吹出空气），或者重新调整样品到一个较小的尺寸。座面充电也促进再沉积，高于5月的步骤帮帮我。聚焦和stigmation的校正，也可以连续地需要作为显微镜图像样本多个小时至数周，在此期间，该室中的真空深度的增加，需要stigmation更正。各扫描电子显微镜根据年龄和特性的不同，并且经验是最好的指南。当切片材料粘附在显微镜成像部件可能出现stigmation或对焦突然戏剧性的变化。该室必须被打开，通过材料的真空或压缩氮气仔细地抛下。这绝对需要专门培训。
有SBFSEM技术与分析脑线粒体关于其效用的几个缺点。主要缺点，共同为固定组织的所有显微镜，是它提供了一个极具活力的细胞器的静态图像。线粒体进行连续核裂变和核聚变周期26，是移动和沿n个贩卖eurite处理21。线粒体贩卖缺陷和动力学哪些不是纯粹的数值或结构可以通过这种方法容易地错过，虽然，通过观察在解剖学上定义的空间线粒体如突触前可以解释的次数，如果线粒体的传输可以被改变39 。第二个缺点在于，它仅在脑中的一小部分进行，因此电路，线粒体分布可被错过特定缺陷。相关办法28,46承受的契机，共聚焦和多成像SBFSEM技术相结合，同时生成的分子和超微结构数据。线粒体分析，因此，它可以是有用的后，使用线粒体抗原特异性抗体或通过使用转基因其表达线粒体靶向荧光蛋白的脑切片的任一光显微镜检查来执行SBFSEM。这combinatio最终策略可能提供了一个强大的方法来确定神经和线粒体疾病的小鼠模型线粒体缺陷。
也有共同的电子显微镜的许多形式由于采用苛刻固定剂，重金属染色和化学物质的不均匀的渗透的技术限制。其他限制可以从组织样品的塑料包埋干。树脂和疏染色结构的空区域成像期间保持电子，导致束偏转和漂移（图像变形）以及人为的充电的信号（ 例如 ，暗细胞核和血管内腔），其中两个撞击分辨率。到树脂光束损害也促进参差不齐的切割，并且因为这个原因，成像通常需要的50片 - 将要从块面切为100nm，产生在数据集的非isotrophic体素。对于一些应用其它限制包括该部分被破坏，不能随后重新检查，这可能迫使用户收集的可能不包含有用数据区高分辨率的图像。
SBFSEM的一个主要优点是，它可以自动切片和通过将一个自定义的切片机进入低真空SEM室32,33成像组织的块的过程。由于图象被从之前的每个切割块面直接得到，节起皱，压缩和处理过程中损失的问题基本上避免，尽管碎片沉积和翘曲由于阻挡面充电确实有助于一些图像损失和失真。此外，在原始的数据集获得的图像已对准的，并且只需要微米级的登记，以适应光束漂移，以便适合于大多数分析。因为自动化的切片的过程中，一旦系统真空稳定后，组织的大量可在不显著操作者介入成像。在使用此的多重优势技术在细胞器和细胞内结构进行形态学和定量研究。一个优点是越来越在合理的时间量内线粒体的三维结构的信息。开源重建软件包像重构47，TrakEM 48和克诺索斯49-51的可用性作出这一技术的有力的分析工具，其中，从实验动物模型的神经元网络的详细3D超微结构可以直接比较。的半自动和全自动的图像分析方法52有可能在线粒体形态，功能和/或生物合成预计将受影响的动物，以产生高度机械化的数据。较早SBFSEM分析，由于被极大地阻碍了对较低的分辨率，涉及增强的染色方法40但是较新的样品制备技术已经大大改善了的分辨率的程度，即使是单突触vesicle都可以轻松解决。在这项决议中线粒体如空泡化，膜破坏，以及嵴的损失超微结构缺陷，可以很容易地观察到，和有缺陷的线粒体细胞内的分布可确定38,39。该技术的高分辨率提供对光学显微镜的主要优点，其中的分辨率被限制为在XY轴〜200纳米和〜500nm的Z轴。因此，线粒体只是在光学显微镜53的分辨率极限。虽然有下面的分辨率极限尺寸线粒体仍然可以通过光学显微镜进行可视化，其尺寸不能可靠地计量。重要的是，由比光学显微镜的分辨率极限以下的距离隔开线粒体不能由光学显微镜解决。另一个优点是，线粒体结构分析可以在组织的范围内进行，而不细胞器的隔离。这可以人低基于线粒体定位在组织内适当的比较，对于如轴突与体细胞和/或树突状细胞线粒体。一个额外的优点是，它通常能够确定线粒体是否通过以下如神经胶质纤丝和糖原为星形胶质细胞或髓鞘少突胶质细胞的方法，以一个限定的细胞器，神经元或神经胶质本地化。神经元和神经胶质细胞的过程在靠近常常是，用2D作为TEM的方法，例如，可能难以与信任哪些过程的神经元和它们是神经胶质分配。
总之，SBFSEM技术提供覆盖的组织区域20的串行图像栈 - 1000微米的尺寸为5的超微结构分辨率 - 10纳米或更高，这使得整个中枢神经系统的细胞和细胞器如线粒体要成像，测量和重建。在本文中，我们有亲vided一些切实可行的方法来利用这种技术。未来的应用包括分析在多种神经性疾病，如神经发育和神经变性疾病模型的动物模型的线粒体结构和分布以及分析各种亚细胞结构的如内质网，核和/或下健康于完整细胞或组织中溶酶体和疾病状态。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
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