Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse av Brain Mitokondrier Bruke Serial Block-Face Scanning elektronmikroskopi

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

Hjernen er et kraftkrevende organ som i hovedsak baserer seg på glukose som en brennstoffkilde. Glukose blir katabolisert av hjerne mitokondriene via glykolyse, tri-karboksyl-syre (TCA) syklus og oksidativ fosforylering (OXPHOS) veier å produsere energi i cellene i form av adenosintrifosfat (ATP). Nedskrivning av mitokondriell ATP produksjon fører mitokondrie lidelser, som presenterer klinisk med fremtredende nevrologiske og myopatiske symptomer. Mitokondrie defekter er også til stede i nevrologiske lidelser (f.eks autisme spektrum lidelse) og nevrodegenerative lidelser (f.eks amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers og Parkinsons sykdom). Dermed er det en økt interesse for feltet for å utføre 3D analyser av mitokondriell morfologi, struktur og distribusjon under begge friske og sykdomstilstander. Hjernen mitokondrielle morfologi er meget mangfoldig, med noen mitokondrier særlig de iden synaptiske region er i området på <200 nm diameter, som er under oppløsningsgrensen av tradisjonell lysmikroskopi. Uttrykker en mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) i hjernen øker betydelig organellar påvisning av konfokal mikroskopi. Men det betyr ikke overvinne begrensninger på sensitiviteten for påvisning av relativt liten størrelse mitokondrier uten oversaturating bilder av store store mitokondriene. Mens seriell transmisjonselektronmikroskopi har blitt brukt for å karakter mitokondriene ved synapsen Denne teknikk er svært tidkrevende, spesielt når man sammenligner flere prøver. Serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikken innebærer en automatisert prosess med seksjonering, bildeblokker vev og datainnsamling. Her gir vi en protokoll for å utføre SBFSEM av et definert område fra gnager hjernen til raskt rekonstruere og visualisere mitokondrie morfologi. dette technique kan også brukes til å gi nøyaktig informasjon om mitokondrie antall, volum, størrelse og fordeling i et definert område hjerne. Siden den oppnådde oppløsning er høy (vanligvis under 10 nm) eventuelle grove mitokondrielle morfologiske defekter kan også bli detektert.

Introduction

Mitokondriene er dynamiske organeller som endrer sin form og plassering, avhengig av cellulære signaler og behov, i tett interaksjon med celle cytoskjelett, og i respons til cellulære hendelser, for eksempel kalsiumstrømmer i nerveceller 1. Mitokondrier også samhandle med andre cellulære organeller f.eks endoplasmatiske retikulum, som igjen regulerer deres dynamikk og metabolisme 2. Mitokondrie morfologi viser heterogenitet i ulike celletyper ie. formen på organeller varierer fra røret til den består av plater, sekker og ovaler 3. Det har vist seg at mitokondrielle fusjons og fisjonssyklusproteiner kan regulere plassering, størrelse, form og fordeling av mitokondrier 4. Videre er endringene i form mitokondrienes assosiert med neurodegenerering, neuronal plastisitet, muskelatrofi, kalsiumsignalisering, reaktive oksygenarter generasjon, så vel som levetiden og celledød impliserer thaT-celle-spesifikke mitokondrielle morfologi er kritisk for å opprettholde normal cellefunksjon 5-11.

En stor bioenergetisk funksjon av mitokondriene er å generere adenosin trifosfat (ATP) ved å utføre en serie av metabolske reaksjoner som involverer fullstendig sammenbrudd av næringsstoffer (for eksempel glukose, fettsyrer eller aminosyrer) via TCA syklus og OXPHOS Pathways 12. Den menneskelige hjerne utgjør bare 2% av kroppsvekten, men den forbruker ~ 20% av den totale energi som produseres slik at det er en svært energikrevende organ 13. Det er derfor ikke overraskende at mitokondriell dysfunksjon hos mennesker fører til et stort antall av nevrologiske manifestasjoner 14-17. Genetiske mutasjoner i OXPHOS komponenter som svekker ATP generasjon fører til mitokondrie lidelser 17,18, som er klinisk heterogen gruppe lidelser med en forekomst på ~ 1: 5000 individer, og en av de vanligste årsaken til metabolic lidelser hos barn og voksne. Underskudd av mitokondrier-avledet ATP påvirker flere organsystemer med høy energikrevende organer som hjerne, hjerte og skjelettmuskulatur blir hovedsakelig påvirket hos disse pasientene 14,17,18. I de senere årene har flere studier gitt bevis for mitokondriell dysfunksjon i både nevrologiske og nevrodegenerative lidelser 15-17,19,20. Siden mitokondrier er viktig og avgjørende for hjernens utvikling og funksjon, er det viktig å utvikle protokoller som kan analysere endringer i hjernens mitokondrie morfologi, struktur, størrelse, antall og fordeling i henhold til både friske og syke tilstander. Musemodeller med mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) har blitt produsert for å visualisere mitokondrielle bevegelser og lokalisering i hjernen 21,22. Selv om dette er et svært nyttig verktøy for å undersøke mitokondriebevegelighet og generell distribusjon, er det noen ulemper som inkluderer treninge begrenset oppløsning og følsomhet av fluorescens mikroskopi. Disse egenskapene gjør det vanskelig å spore de forholdsvis små størrelser mitokondriene. På samme måte har seriell transmisjonselektronmikroskopi blitt brukt til å vise synaptic mitokondriene 23, men denne fremgangsmåte er meget tidkrevende. Mitokondriell morfologi er kjent for å være svært dynamisk som de gjennomgår kontinuerlige fisjon og fusjon sykluser, og i de fleste cellene mitokondriene opprettholde et høyt tilkoblede nettverket 24-26. Nerveceller er sterkt polarisert celler med flere dendritter og utvidede axoner, og mitokondrier som danner en tilkoblet retikulære nettverk i cellen kroppen kan ha å skille som de gjør sin vei gjennom disse neurites (figur 1). Dette gjør hjerne mitokondrier ekstremt variert i størrelse og form. For eksempel, ved hjelp av serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikk, har vi tidligere observert at forskjellen i volumet eller størrelsen av extrasynaptic mitochondria til mitokondriene er tilstede i nerveterminaler kan være så mye som seksten fold 27.

Det finnes flere tilnærminger for å utføre volum analyser 28, som omfatter serie delen TEM 29, automatisert tape samle ultramicrotome SEM 30, fokusert ion stråle SEM 31, og SBFSEM 32. Den SBFSEM Analysen har fordeler ved at den har den oppløsning til å gi kvantitative data om den morfologiske form, størrelse, fordeling og antall av organeller som mitokondrier i områder inntil 1 mm av hjernen. Den teknisk drift er også den minst krevende, med datainnsamling og analyse innenfor mulighetene mange biologiske laboratorier som mangler forrige EM opplevelse. Ankomsten av kommersielle instrumenter for generering av serieseksjons-lignende bilder har gjort 3D ultrastructural analyse av vev en rutine teknikk, som ytterligere muliggjør en objektiv volumetrisk analyse i en hurtig og repeterbar måte 28 32, basert på en idé introdusert av Leighton i 1981 33. Flere studier siden da har etablert denne teknikken som et viktig verktøy i rekonstruksjon analyse av nevronale kretser 34. Videre, for mange mindre prosjekter, gir det ombygging analyse for å identifisere cellulære organeller 27,35-39. Siden er de oppkjøpte bildene stammer fra lav spenning tilbake scatter elektroner ble nye flekker protokoller som kombinerer forskjellige kjente heavy metal fargeteknikker utviklet for å øke oppløsningen 40.

I denne artikkelen gir vi en protokoll for å utnytte 3D elektronmikroskopi bildebehandling og volumetrisk analyse av hjerne mitokondrier basert på metoder som tidligere har blitt brukt av oss og andre 38,39,41. De vev etterbehandlingsfremgangsmåter som ble brukt var som beskrevet tidligere av Deerinck m.fl.40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Virginia Tech.

Forsiktig: Extreme forholdsregler må tas når det gjelder fjerning av flere komponenter som brukes i denne protokollen. Før bruk må den lokale institusjons retningslinjer og helse- og sikkerhets praksis etableres og følges, spesielt for osmiumtetroksyd, som er flyktig og meget giftig, uranylacetat, som er både et tungt metall og kilde for radioaktivitet, og blynitrat, som er et tungmetall gift. Thiocarbohydrazide (TCH) kan brytes ned til å produsere eksplosive og giftige gasser, ved feilaktig håndtering. Mange institusjoner vil ha en EM kjernefasilitet der disse reagenser er rutinemessig utnyttet og kan gi hjelp.

1. Utarbeidelse av hjernevev og SBFSEM Imaging

  1. Anesthetize en ung (~ 2 - 4 måneder gammel) C57 svart mus (C57BL / 6J belastning) med 4-5% isoflurane følge institusjonelle retningslinjer. Bekreft anesthetization ved å overvåke tap av muskelmasse, mangel på frivillige bevegelser og reaksjoner på aversive stimuli som en hale klemme.
  2. Pin musen på en disseksjon brett og gjør et snitt på huden langs ventrale midtlinjen. Foreta ytterligere snitt i huden for å avsløre brystkassen på musen. Incise mellomgulvet, og nøye dissekere ut brysthulen langs periferien å avsløre bankende hjerte, og deretter gjøre et snitt på høyre atrium.
  3. Ved hjelp av en sommerfugl kanyle, cannulate venstre ventrikkel. Perfuse mus tran anvendelse av 10 - 20 ml fosfatbuffer saltvann (PBS), pH 7,2, før blodtapping er bekreftet ved en endring i fargen av leveren.
    Merk: En endring i fargen på leveren brukes som en guide for å fastslå omfanget av blodtapping. Kontroller at leveren fargeendringer fra rødbrun til blek rosa.
  4. Perfuse mus tran anvendelse av 10 - 20 ml 2% glutaraldehyd og 4% paraformaldehyd tatt opp i 0,10 M kakodylatbuffer (pH 7,2), for å feste hjernevevet hurtig innenfra. Fiksering blir overvåket ved å observere den halen avstivning.
    NB: Bland 0,10 M kakodylatbuffer (pH 7,2) ved å oppløse 2,14 g natrium kakodylat i 80 ml vann, tilsett saltsyre for å regulere pH, og gjøre volumet til 100 ml med vann.
  5. Etter perfusjon, fremrykning mus, dissekere hjernen, fulgt av fiksering i 0,10 M natrium-kakodylat-buffer (pH 7,2) inneholdende 2% glutaraldehyd og 4% paraformaldehyd i 48 timer ved 4 o C.
  6. Etter 48 timer gjør 400 mikrometer koronale seksjoner ved hjelp av en vibratome og deretter nøye dissekere regionen av interesse i hjernen (for eksempel hippocampus) under disseksjon mikroskop 42. trimme vevet nøye og ta et bilde for å bevare orientering.
    Merk: Legg bearbeidingsmetoder vev flekker i SBFSEM kombinerer en rekke heavy metal fargemetoder iFor å forbedre oppløsning og er basert på den metode som er utviklet tidligere av Deerinck et al 40.
  7. Vask glutaraldehyd-fiksert vev 3 ganger, 5 minutter hver i 0,1 M kakodylatbuffer (pH 7,2).
  8. Fremstille 0,1% garvesyre oppløsning ved oppløsning garvesyre i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer (pH 7,2). Virvle til det er oppløst og filtreres gjennom 0,45 um filter, hvis det er nødvendig.
  9. Postfix vev med cacodylat bufret 0,1% garvesyre ved inkubering i 1 ml reagens i 30 - 60 min ved RT.
    Merk: Inkubasjonstiden er avhengig av vev størrelse, men 30 min fungerer best for de fleste vev.
  10. Vask vev 3 ganger, 5 minutter hver i kakodylat-buffer (pH 7,2).
  11. Løs opp 0,3 g kaliumferrocyanid og 0,86 g natriumkakodylat i 10 ml destillert H 2 O (dH 2 O). Hold kaliumferrocyanid løsning på is. Like før bruk, tilsett 10 ml 4% osmiumtetroksid (OSO 4).
  12. Flekk vev med 2% osmium-ferrocyanid løsning i 90 minutter, på is. Vask 3 ganger, 5 min hver i dH 2 O.
  13. Forbered 1% thiocarbohydrazide (TCH) løsning ved å løse 0,1 g TCH i 10 ml dH 2 O. Løs opp ved 60 ° C ved å svinge hvert 10 min til den er helt oppløst. Følg sikkerhetsregler ved håndtering TCH, spesielt passe på å unngå bruk av metaller, oppvarming til høy temperatur, eller at løsningen til å tørke ut.
  14. Unn prøvene med nylaget 1% TCH i 20 min ved RT. Vask 3 ganger, 5 min hver i dH 2 O.
  15. Fortynnet 4% OsO 4-2% med dH 2 O, beis vev med 2% vandig osmiumtetroksid av inkubasjon i 1 time. Vask vev 3 ganger, 5 min hver med dH 2 O.
  16. Prøvene inkuberes i O / N i 1% uranylacetat i dH 2 O ved 4 ° C.
  17. Forbered Walton økte aspartat løsning (som beskrevet av Deerinck et al 40).
    1. Løs opp 0,998 g L-aspartat i 250 ml dH 2 Oog deretter legge til 10 N kaliumhydroksid (KOH) på en dråpevis måte inntil pH når 5,5. Etter pH-justering, tilsett 0,066 g blynitrat i 10 ml asparaginsyre lager og oppvarm til 60 ° C i 30 min.
  18. Skyll vev i dH 2 O og inkuberes med Walton økte aspartat flekken i 30 minutter i en 60 ° C ovn. Vask 3 ganger, 5 min hver i dH 2 O.
  19. Dehydrere prøvene gjennom en gradert serie av alkohol ved hjelp av avkjølte oppløsninger av 20%, 50%, 75%, 85% og 95% etanol i 5 minutter hver, fulgt av 100% etanol, 3 ganger, 10 minutter hver.
    Merk: Bruk 100% etanol fra nyåpnet flaske, som åpnet etanol absorberer vann fra luften og forårsake innebygging mislykkes. Lengre inkubasjoner vil det være nødvendig med større vevsprøver.
  20. Vaskeprøver 2 ganger, 15 minutter hver i propylenoksyd.
  21. Lage plast innstøping harpiks ved anvendelse av 25 ml harpiks, 10,5 ml DDSA (dodecenyl ravsyre-anhydrid), 15,5 ml NMA (nadic methyl anhydride) og 1 mlDMP-30 (2,4,6-tris dimetylaminometyl fenol). Bland harpiksen ved risting. Spin og tillate harpiksen å stå inntil bobler løse.
    Merk: Dette er standard medium hardhet oppskrift. Andre typer av elektronmikroskopi (EM) plastisk harpiks kan brukes, men bør testes med en ikke-essensiell kontrollprøve på forhånd, da ikke alle harpikser fungere for SBFSEM.
  22. Inkuber vev O / N i en 50: 50 blanding av innstøping harpiks og propylenoksyd, i en ampulle som er avkortet i begynnelsen, deretter udekket etter 2 timer, slik at propylenoksyd fordamper over en periode på omtrent til 8 - 10 timer.
  23. Overfør vev til 100% frisk innstøping harpiks i rene flasker i 2 timer.
  24. Embed prøver i frisk embedding harpiks, i flate muggsopp inneholder trykte papiretiketter, og kurere dem i en ovn ved 60 ° C i 48 timer. Etter ca en time, sjekk vevet plassering og justering igjen, og juster om nødvendig.
  25. Trim prøver til området av interesse og montere på en aluminiumspinne ved hjelp av geleringsg cyanoakrylat superglue eller en ledende epoksyharpiks, og deretter belegge med kolloidalt sølv lim rundt sidene av blokken for å tilveiebringe en ledende bane for aluminium pin.
  26. Undersøke vevsprøver ved hjelp av et scanning-elektronmikroskop-system utstyrt med en i-kammer ultramicrotome trinn og lav kV tilbakespredte elektrondetektor 32.
    Merk: Skaff Instrument- og site-trening i scanning elektronmikroskopi (SEM) bruke og bli en autorisert bruker. Alternativt kan samarbeid med en forsker eller kjernefasilitet for små prosjekter være mulig. Stråling trening kan også være nødvendig som SEM generere x-stråler.
  27. Å bilde prøvene, bruke følgende innstillinger: 2,25 kV, på 5-10 nm / pikslers oppløsning, med feltstørrelser mellom 80-250 mikrometer i x, y (annet felt størrelser mulig), og skive tykkelse på 50-100 nm, med en total på 250 - 600 skiver i en 16 - 20 timer tidsperiode.
    Merk: Innstillinger varierer betydelig mellom ulike mikroskoper, indiduelle prøver, og ønsket oppløsning. Disse innstillingene skal produsere bilder som er lett tolkes på mange prøver.

2. Analysere Imaging Datasett

Merk: Bilde J / Fiji programvare brukes til å analysere datasettet og er avhengig av TrakEM2 plugin. Forbehandling trinn kan utføres ved hjelp av et bredt utvalg av programvare, og kan være stort eller mindre avhengig av erfaring nivå og stabler oppnådd. De viktigste transformasjoner ved hjelp av open-source-programvare (ImageJ ver 1.50b, FIJI laste ned 1 oktober 2015) er beskrevet her.

  1. Konvertere bilder til 8 bit tiff-format fra de opprinnelige proprietære 16-bits bilder ved å åpne i programvaren og velge menyelementer Bilete → Type → 8 bit.
    1. Hvis automatisk kontrast / lysstyrke konvertering i dette trinnet er ikke ideelt for bilder, åpner 16-bits bilder, og trykk Bilete → Juster → Lysstyrke / kontrast. Velg et område som fungerer for alle bildene, og trykk Bruk. Deretter utfører conversion. Merk: På noen SEM, kan dette trinnet krever mikroskop produsent programvare.
    2. Hvis det er nødvendig, på grunn av uakseptabel bilde bevegelse mellom skiver (f.eks. Drift på grunn av lading), registrer / justere bildestakker (menypunkter Plugins → Registrering → ​​Linear StackAlignmentWithSIFT). I de fleste registrering programvare, satt for "oversettelse-only" modus i stedet for "stiv kropp".
      Merk: Mange tilnærminger og programvare kan fungere: de SIFT registrerings plug-in fungerer for mange applikasjoner, og det er en virtuell stabel versjon.
      1. Om nødvendig, forstørre lerretet før registrering (Bilde → Juster → CanvasSize) eller redusere den til et område av interesse (Bilde → Crop).
        Merk: Noen drift eller splaying kan forekomme, og prøve andre plugins eller programvare kan gi bedre resultater. Manuelle alternativer er også tilgjengelig (f.eks. ImageJ / FIJI, Plugins → Registrering → ​​ManualLandmarkSelection).
    3. Hvis Desired, skalere bilder til mindre og mer håndterlig størrelse (f.eks. 25%) ved hjelp ImageJ (Bilde → Scale).
  2. Start programvaren ved å velge Fil → import → bildesekvens og velg deretter tiff-filer.
  3. Start plugin ved å velge Fil → ny → TrakEM2 (blank). To vinduer vil åpne; en leder prosjektet og area_lists og den andre styrer tracing, og er referert til som den "lerret '.
  4. Laste bildet bunken inn i plugin ved å høyreklikke på lerretet import. Velg import og klikk på import stabelen. I pop-up alternativer, sjekk boksen for virtuelle stabler.
    Merk: Selv om bildestakker er allerede åpnet i programvaren, må de også åpnes i plugin. Datamaskinen kan kjøre mer jevnt hvis virtuelle stabler er merket av.
  5. Etter mipmap skapes og stabelen er lastet, høyreklikk for å gi navn til prosjektet under plugin-vinduet. Høyreklikk på "nytt prosjekt" i malen colUMN, og velg "legg til ny barns for det prosjektet. Høyreklikk igjen for å velge 'area_list'.
  6. Sett Z-aksen omfanget av prosjektet til å bli enige med de opprinnelige elektronmikroskop innstillingene ved å høyreklikke på lerretet, og klikk deretter på skjermen og velg kalibrering. Også sette Z-skala ved å velge alle lag i plugin-vinduet, høyreklikk for å velge skala Z og tykkelse.
  7. Klikk og dra "prosjekt" og alle "barn" i prosjektet delen Objekter å skape den "området lister" under "Z space 'fane i lerretet vinduet.
  8. Velg "område listen 'og høyreklikk for å velge og sette en farge. Nå kan du bruke pensel verktøy for å spore objekter som mitokondriene, i elektronmikroskop bilder. Bruk Shift + klikk for å fylle ut et lukket sirkel, Ctrl + bla 'for å zoome inn og ut, og "Alt + klikk for å slå pensel markøren inn et viskelær.
  9. Velg to områder av ~ 10 - 15 mikrometeretter 10 - 15 mikrometer i øvre venstre hjørne og nedre høyre hjørne av bildet og identifisere alle mitokondrier innenfor disse områdene for å tillate objektiv prøvetaking av mitokondrier i hver datasettet.
  10. På "lerret", observere og spore mitokondrier gjennom seksjonene. Merk: Mitokondrier er ganske mørkt / tette vises organeller, av samme størrelse i diameter og løst sylindriske. Den unike cristae dannet av den indre membran er lett gjenkjennelig inne i denne organelle.
  11. Når du er ferdig med å spore, høyreklikk på area_list under plass kategorien Z, velge 'Vis i 3D ". Dette vil lansere 3D-visningen plugin for å vise en 3D rekonstruksjon av spores bildet.
    1. For å utføre mitokondrie volummålinger, velger objekt i 3D-visningen, klikk på fanen "Rediger" og velg "Object Properties '. Den mitokondrie volumestimat er oppført sammen med flere andre målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser at hjernen mitokondrie morfologi og størrelse er heterogen i forskjellige nevronale underrommene. Konfokalmikroskopi på lav tetthet nevronale kulturer transduced med lentivirus uttrykker mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein viste at mitokondriene bosatt i neuronal soma danne en retikulære nettverk, mens de som bor i distale neurites viser en diskret langstrakt morfologi (Figur 1 AB). Ved hjelp av SBFSEM teknikk, ble det mitokondrielle morfologi, størrelse, volum og fordeling analyseres i musehjerne. Tredimensjonale (3D) bilder av mitokondrier ble rekonstruert fra både neurites og synapser i mus hjernen hippocampus. De presynaptiske mitokondrier ble identifisert og antall presynaptiske boutons huser bosatt mitokondrier kvantifisert. Heterogenitet i størrelse på mitokondrier ble observert i det dendritiske versus aksonal kamrene (Figur en CD). Videre har mange små presynaptiske avdelinger i musen hjernen hippocampus var blottet for mitokondrier (figur 2 AC). Den volumetriske målinger av både presynaptiske og extrasynaptic mitokondrier avslørte at volumet eller størrelsen på mitokondriene er bosatt innenfor nevronale presynapses var betydelig mindre enn de som er bosatt i extrasynaptic regionen (figur 2 DF). Interessant, den to-dimensjonale (2D) størrelsesfordelingen av mitokondrier, målt fra et objektiv prøvetaking av 200 ikke-somatiske mitokondrier viste at ~ 11% av mitokondrie fraksjonen ligger under oppløsningsgrensen for lysmikroskopi (figur 2G). I tillegg gir de 2D-bilder ervervet av SBFSEM analyse økt oppløsning til å visualisere de ultra egenskapene til enkelte mitokondrier (figur 3 AB). På grunn av den klart synlige topografien i vev, er det videre mulig å klassifisere mobil kompartment av mitokondrier ved å bestemme sin nærhet til lett identifiserbare strukturer som kjernen (somatisk) og synaptiske vesikler (presynaptisk) (figur 3 AB). For å identifisere mitokondriene til stede i neuronale prosesser rekonstruere den enkelte prosess som axon eller dendritt basert på tilstedeværelsen eller fraværet av presynaptiske boutons henholdsvis 42. Basert på disse resultatene, foreslår vi at SBFSEM er et svært verdifullt analytisk teknikk for å identifisere mitokondrie form, størrelse, antall og fordeling i hjernevev og at eventuelle grove feil i mitokondrie struktur og fordeling kan også bestemmes ved hjelp av denne metoden. Siden ultrastrukturelle karakteristika for forskjellige celletyper i hjernen er forskjellige, for eksempel. Tilstedeværelsen av glykogen granulat i astrocytter, er det også mulig å analysere de celle-type-spesifikke forskjeller i hjernen mitokondriene.

Figur 1 Figur 1:. Heterogenitet i nerve mitokondrie morfologi og distribusjon Kortikale kulturer fra postnatal dag 1 museunger ble omformet med lentivirus uttrykker mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (mito-GFP). (A) Viser nevronale soma uttrykker mito-GFP, merk reticulate nettverk av mitokondriell morfologi; Nu = kjerne; skala bar = 5 mikrometer. (B) Viser langstrakt mitokondriell morfologi i distale neurites; skala bar = 5 mikrometer. (C) Representant 2D-bilde fra SBFSEM datasett generert fra musen hjernevev, er mitokondriene farget i grønt, dendritter er farget i blått og aksonal varicosities er farget i brunt; skala bar = 1 mikrometer. (D) 3D rekonstruksjoner av mitokondrier i neurites av mus hjernevev, merk forskjellen i størrelse mellom dendrittiske og aksonal mitokondrier .indikatorered av store og små pilspiss henholdsvis; skala bar = 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Serie Block-ansikt Scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) Analyse avslørt Lav overflod av Mitokondrier på den presynaptiske terminaler (A) Representant 2D ultramicrograph fra SBFSEM datasett analyse hentet fra hippocampi av P15 villtype mus;. skala bar = 1 mikrometer. (B) Viser 3D rekonstruksjon av 10 presynaptiske nerveterminaler. Merk at bare fire av 10 presynaptiske terminaler viste merkbar mitokondriene; skala bar = 1 mikrometer. (C) stolpediagram som viser kvantifiseringen av 173 rekonstruerte presynaptiske nerveterminaler fra SBFSEM datasett analyse. (D) Representant 2D-bilde fra SBFSEM datasett viser extrasynaptic mitokondriene i blått og presynaptiske mitokondrier i grønt; skala bar = 1 mikrometer. (E) 3D rekonstruksjoner av den presynaptiske og extrasynaptic mitokondrier fra SBFSEM datasettet ved hjelp av programvaren; skala bar = 1 mikrometer. (F) bar graf som viser volumet av extrasynaptic og presynaptiske mitokondrier. Data er avsatt som gjennomsnitt ± SEM; n = 3 forskjellige datasett (inkluderer 62 presynaptiske mitokondrier og 80 extrasynaptic mitokondrier i totalt); * Viser p-verdi = 0,0405. (G) En 15 av 15 um område i alle fire hjørner av bilder ble merket og alle ikke-somatiske mitokondrier ble identifisert til å tillate tilfeldig prøvetaking. Den minste dimensjon på ~ 200 mitokondrier ble målt. Pai Grafen viser at ~ 11% av ikke-somatiske mitokondrier var <200 nm i dimensjon som er under oppløsningsgrensen for lysmikroskopi. Dette tallet har been tilpasset fra Chavan et al 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: 2D SBFSEM Bilder fra Lateral geniculate Nuclei of Mouse Brain (A) To dimensjonal representant SBFSEM bilde fra side leddet kjerner (8/8 mikrometer) som viser en detaljert topografi av regionen.. Soma og kjernen er angitt; skala bar = 2 mikrometer. (B) En forstørrelse av området merket med en rød firkant i panel A. Legg merke til at den ytre og indre membraner av mitokondrier, så vel som cristae dannelse er klart synlig. Topografien og relasjoner til andre organeller og cellestruktur er også observert. PS viser eksempel på presynaptisk mitokondrieneog NS angir eksempel på ikke-synaptisk (NS) somatisk mitokondriene; skala bar = 1 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kompleksiteten av nervesystemet utgjør en betydelig utfordring i å rekonstruere store volumer vev og analysering av morfologien og fordelingen av organeller som mitokondrier med tilstrekkelig oppløsning. Flere celler, inkludert neuroner, oligodendrocytter og astrocytter med mange prosesser forlenget i tre dimensjoner samhandle innenfor hjernevevet 43. Siden mitokondriene ligger både i soma av celler og fjerne prosesser, er mitokondrie morfologi svært pleomorphic i nervesystemet (figur 1). Tilstrekkelig 3D strukturell informasjon med tilstrekkelig oppløsning kan derfor ikke bli kjøpt ved konvensjonelle lys mikroskopi teknikker slik som konfokal eller to-foton mikroskopi 44,45. Elektronmikroskopi er den eneste for tiden tilgjengelige teknikk som tillater rekonstruksjon av store volumer av nervevev med tilstrekkelig høy oppløsning. Tradisjonelt har 3D rekonstruksjon av nervevev vært oppnåd etter serie delen transmisjonselektronmikroskopi (SSTEM) av ultratynne seksjoner 29. Imidlertid har de siste teknologiske fremskritt forbedret kvaliteten på volum elektronmikros datainnsamling og automasjon.

SBFSEM er en automatisert blokk-ansikt avbildningsteknikk som kombinerer seriesnitte inne i kammeret av et scanning elektronmikroskop for å rekonstruere 3D-vevet struktur over flere hundre mikrometer, med en oppløsning som er tilstrekkelig til å følge de tynneste cellulære prosesser og identifisere små organeller . Denne teknikken har åpnet opp muligheten for rutinemessig å rekonstruere både virvelløse og virveldyr nervesystem. Det involverer flere trinn inkludert prøveopparbeidelse, scanning elektronmikroskop drift, datainnsamling, bilde post-prosessering og bildeanalyse. Disse prosedyrene krever spesialiserte hands-on opplæring og sertifisering for scanning elektronmikroskop drift. Tre forhold er kritikeral ie. dissekere den riktige hjernen anatomisk region, skaffe bilder med høy oppløsning, og utføre riktig bildeanalyse. Etter dissekere den anatomiske region av interesse fra vibratome skive fast hjernevev, er det avgjørende å ta bildet for å bevare riktig retning. Det kan ellers være vanskelig å finne den riktige stedet for bildebehandling. Innhenting av bilder med høy oppløsning avhenger av tilstrekkelig fiksering og riktig etterfeste flekker prosedyrer. Hjernen har en tendens til å gjennomgå rask forverring i sin ultra etter døden. Derfor er det viktig å løse hjernen i en glutaraldehyd-løsning ved bruk av riktig transcardial perfusjon metode. Dette bør følges av ytterligere fiksering av hjernen i glutaraldehyd-løsning i minst 24 timer. Siden oppløsningen er helt avhengig av en kombinasjon av en rekke tungmetaller farvemetoder, er det viktig å følge den post-festemetode som beskrevet i protokollen for å erverve quantifiable bilder. Oppløsninger skal fremstilles som beskrevet i fremgangsmåtene. Til slutt, for nøyaktig bildeanalyse organeller / s som skal analyseres bør identifiseres utvetydig (f.eks. Ved å visualisere ultra egenskaper) før sporing, og programvaren retningslinjer må følges nøye. Oppløsningen på de oppkjøpte bildene bør være kjent for konvertering fra piksler til nanometer for volumetriske målinger.

Foruten den programvaren som er beskrevet i protokollen for å utføre bildeanalyse, kan andre tilgjengelig programvare er som rekonstruere, Knossos også anvendes. Selv om det legges vekt på den beskrevne protokoll er på visning mitokondriene i nervesystemet, det kan bli modifisert for å generere høy oppløsning 3D informasjon om forskjellige andre subcellulære strukturer (f.eks. Endoplasmatiske retikulum, lysosomer osv.) I en rekke forskjellige vev.

Mens en detaljert feilsøkingsguiden for scanning elektronmikroskop operation er utenfor omfanget av denne artikkelen (se instrument brukerveiledninger og treningsinformasjon), oppstår noen problemer rutinemessig under bildebehandling eksperimenter og forstå hvordan å feilsøke dem kan hjelpe nye brukere eller de skaffe bilder gjennom samarbeids / kommersielle kilder. Et vanlig problem lades av prøven som forekommer hovedsakelig i harpiks områder som inneholder lite eller ingen farget materiale. I et "positivt" bilde (ie. Cytosol er hvit), kjernen, blodårer, og tomme harpiks strekninger kan virke "svertet". I tillegg lade også fremmer lokal bjelke drift som resulterer i tydelig bilde fordreining. Mulige løsninger varierer mellom instrumenter og prøver. Redusere kV innstillinger Reduserer "sverting" artefakt, men kan fremme mer bjelke drift. Ved hjelp av et nedre vakuum-modus, og med nitrogen (N2) gass, vanndamp, osv. i kammeret reduseres også lading, men til en betydelig kostnad for oppløsning og signal-til-støy-forhold. Et annet vanlig problem er kniv hopper. Langsommere scanning kan forårsake trålen induserte skader på blokken overflate, som kutter ujevnt eller ikke i det hele tatt for noen avbildning / kutte sykluser (dvs.. Følgende bilder vises på samme måte). Flere løsninger finnes blant annet å øke snittdybde / skivetykkelse med redusert z-oppløsning, øker skannehastighet og consequentially akseptere mer støyende bilder, redusere pikselstørrelse og akseptere lavere x / y-oppløsning, og velge prøver eller områder med mer intens farging (som dårlig -stained områder lade mer, skade lettere, og krever lengre stråle eksponering for å få bilder med akseptabel signal -støy prosenter). Rusk gjenavsetning på blokken ansikt er en annen kilde til gjenstand i bilder, og hvis dette skjer ofte det kan kreve pause oppkjøpet, og nøye rengjøring av kniven (blåser luft), eller retrimming prøven til en mindre størrelse. Block-ansikt lading fremmer også gjenavsetning, og fremgangsmåten ovenfor kanhjelp. Korreksjon av fokus og stigmation kan også være nødvendig som mikroskop bilder prøvene sammenhengende i mange timer til uker, der tiden vakuum dybden øker i kammeret, krever stigmation korreksjoner. Hver scanning elektronmikroskop varierer i henhold til alder og egenskaper, og erfaring er den beste guiden. Plutselige dramatiske endringer i stigmation eller fokus kan oppstå når seksjonert materialet fester seg til mikroskop bildebehandling komponenter. Kammeret må åpnes og materialet nøye forskyves gjennom vakuum eller komprimert nitrogen. Dette krever absolutt spesialisert trening.

Det er noen ulemper ved SBFSEM teknologi med hensyn til sin nytte i å analysere hjernen mitokondriene. En stor ulempe, som er felles for alle mikroskopi av faste vev, er at den gir statiske bilder av en svært dynamisk organelle. Mitokondrier gjennomgå kontinuerlige fisjon og fusjon sykluser 26, er mobile og trafikkert langs neurite behandler 21. Defekter i mitokondrie menneskehandel og dynamikk som ikke er rent numerisk eller strukturelle kan lett bli savnet av denne tilnærmingen, selv om, ved å se på antall mitokondrier i en anatomisk definerte rom som presynapse man kan tolke om transport av mitokondriene kan endres 39 . En annen ulempe er at den utføres bare i en liten del av hjernen, derfor kretser spesielle defekter i mitokondrie-fordelingen kan bli savnet. Samsvar nærmer 28,46 råd muligheten til å kombinere confocal og multiphoton bildebehandling med SBFSEM teknologi for å generere både molekylære og ultra data. For mitokondrie analyse, derfor kan det være nyttig å utføre SBFSEM etter lys mikroskopisk undersøkelse av hjerneseksjoner, enten ved hjelp av mitokondrielle antigen spesifikt antistoff eller ved hjelp av et transgen som uttrykker mitochondrially rettede fluorescerende protein. dette combinational strategi kan gi en robust metode for å identifisere mitokondrielle defekter i musemodeller av nevrologiske og mitokondrie lidelser.

Det finnes også tekniske begrensninger som er felles for mange former for elektronmikroskopi som skyldes bruk av harde fiksativ, heavy metal flekker og ujevn gjennomtrenging av kjemikalier. Andre begrensninger kan stamme fra plast innebygging av vevsprøver. Tomme regioner av harpiks og tynt farget strukturer beholde elektroner under avbildning, forårsaker bjelke nedbøyning og drift (bilde fordreining), så vel som kunstig belastningssignaler (f.eks. Mørke kjerner og blodkarlumen), som begge har betydning for oppløsning. Bjelke skade på harpiksen fremmer også ujevn skjæring, og av denne grunn avbildning typisk krever skiver 50 - 100 nm som skal skjæres fra blokken ansikt, som produserer ikke-isotrophic voksler i datasettene. Andre begrensninger for enkelte bruksområder er at delene blir ødelagt og kan ikke reexamined senere,noe som kan tvinge brukerne til å samle høyoppløselige bilder av områder som kanskje ikke inneholder nyttige data.

En stor fordel med SBFSEM er at det automatiserer prosessen med seksjonering og bildebehandling blokker av vev ved å innlemme en tilpasset mikrotom til et lavt vakuum SEM kammer 32,33. Siden bildene er hentet direkte fra blokken ansikt før hvert kutt, er problemene i § skrukker, komprimering og tap under håndtering vesentlig unngått, selv rusk deponering og fordreining grunn til å blokkere ansikt lading bidrar til en viss image tap og forvrengning . Videre er bildene innhentet i rå datasett allerede justert og krever bare mikrometer-skala registrering for å imøtekomme bjelke drift for å være mottakelig for de fleste analyser. På grunn av den automatiserte snitteprosessen, når systemet vakuum har stabilisert seg, store volumer av vev kan avbildes uten vesentlig operatør engasjement. Det er flere fordeler med å bruke denneteknologi i å utføre morfologiske og kvantitative studier på organeller og intracellulære strukturer. En fordel er å få informasjon om 3D-struktur av mitokondriene innen rimelig tid. Tilgjengeligheten av åpen kildekode rekonstruksjon programvarepakker som Rekonstruks 47, TrakEM 48 og Knossos 49-51 har gjort denne teknologien et kraftig analyseverktøy hvor detaljert 3D ultra av nevronale nettverk fra eksperimentelle dyremodeller kan sammenlignes direkte. Den semiautomated og helautomatisk bildeanalyse nærmer 52 er sannsynlig å produsere svært mekanistiske data hos dyr hvor mitokondriell morfologi, funksjon og / eller biogenesis forventes å bli påvirket. Tidligere SBFSEM analyse ble sterkt hindret på grunn av lavere oppløsning, har imidlertid nyere prøveprepareringsteknikker som innebærer forbedret fargemetoder 40 betydelig forbedret oppløsningen i en grad at selv en enkelt synaptic vesicle kan lett løses. På denne oppløsningen ultra defekter i mitokondriene som vakuolisering, membran avbrudd og tap av cristae kan lett observeres, og fordelingen av defekte mitokondriene i cellene kan bestemmes 38,39. Den høye oppløsning av denne teknikken gir en stor fordel fremfor lysmikroskopi hvor oppløsningen er begrenset til ~ 200 nm i XY akse og ~ 500 nm i Z-aksen. Mitokondrier er derfor bare ved oppløsningsgrensen for lysmikroskopi 53. Selv om mitokondrier har dimensjoner under oppløsningsgrensen kan fortsatt bli visualisert ved lysmikroskopi, deres dimensjoner kan ikke måles pålitelig. Viktigere, kan mitokondrier som er atskilt med en avstand mindre enn oppløsningsgrensen av et lysmikroskop ikke løses ved lysmikroskopi. En annen fordel er at den mitokondrielle strukturanalyse kan utføres innenfor rammen av vev, uten isolering av organeller. Dette kan allav for hensiktsmessige sammenligninger innenfor vev basert på mitokondrie lokalisering, for eksempel aksonal vs. somatiske og / eller dendrittiske mitokondriene. En ytterligere fordel er at det vanligvis er mulig å bestemme hvorvidt mitokondriene er neuronal eller neuroglial i lokalisering ved å følge fremgangsmåtene til en definerende organelle, slik som glial filamenter og glykogen for astrocytter eller myelin for oligodendrocytter. Prosessene av nerveceller og neuroglial celler er ofte i umiddelbar nærhet, og med 2D tilnærminger, for eksempel TEM kan det være vanskelig å tildele med tillit hvilke prosesser er nevronal og som er neuroglial.

Som konklusjon tilveiebringer SBFSEM teknologi stabler av seriebilder som dekker vevsområder 20 - 1000 pm i størrelse med ultra oppløsning av 5 - 10 nm eller høyere, noe som gjør at hele sentralnervesystem-celler og organeller som mitokondrier som skal avbildes, måles og rekonstruert . I denne artikkelen har vi prosatt noen praktiske tilnærminger til å gjøre bruk av denne teknologien. Fremtidige bruksområder er å analysere mitokondriestruktur og distribusjon i forskjellige dyremodeller av nevrologiske sykdommer som nevrologiske og nevrodegenerative sykdomsmodeller samt analysere de ulike subcellulære ultrastructures som endoplasmatiske retikulum, kjerne og / eller lysosomer i hele celler eller vev under sunn og sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Neuroscience SBFSEM mitokondrier OXPHOS hjerne synapse 3D rekonstruksjon
Analyse av Brain Mitokondrier Bruke Serial Block-Face Scanning elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter