Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/54214
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Abstract

המוח האנושי הוא איבר זוללי אנרגיה אנרגיה שמסתמכת בעיקר על גלוקוז כמקור דלק. גלוקוז catabolized ידי המיטוכונדריה במוח באמצעות הגליקוליזה, חומצה תלת-קרבוקסיליות (TCA) זירחון מחזור חמצוני (OXPHOS) מסלולים לייצר את האנרגיה בתאים בצורת אדנוזין אדנוזין (ATP). ירידת ערך של ייצור ATP במיטוכונדריה גורמת להפרעות המיטוכונדריה, המציגי קליני עם תסמינים נוירולוגיים myopathic בולטים. פגמים מיטוכונדריאלי נוכחים גם הפרעות התפתחותיות (הפרעת ספקטרום האוטיזם למשל) והפרעות ניווניות (למשל amyotrophic טרשת לרוחב, אלצהיימר ופרקינסון). לפיכך, יש התעניינות מוגברת בתחום לביצוע ניתוח 3D של מורפולוגיה המיטוכונדריה, מבנה והפצה הן לפי מדינות בריאות מחלה. מוח המורפולוגיה המיטוכונדריה היא מגוונת מאוד, עם כמה המיטוכונדריה במיוחד אלההאזור הסינפטי להיות בטווח של קוטר <200 ננומטר, שהוא מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור המסורתית. הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) במוח מגביר באופן ניכר את זיהוי organellar ידי מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, זה לא להתגבר על אילוצים על הרגישות של זיהוי של המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית ללא oversaturating התמונות של המיטוכונדריה גדול בגודל. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים סדרתי שימש בהצלחה לאפיין המיטוכונדריה ב הסינפסה העצבית, טכניקה זו היא מאוד זמן רב במיוחד כאשר משווים דגימות מרובות. מיקרוסקופיה אלקטרונים סורקים סדרה לחסום פנים (SBFSEM) הטכניקה כוללת בתהליך אוטומטי של חתך, בלוקי הדמיה של רכישת רקמות ונתונים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבצע SBFSEM של אזור מוגדר מהמוח מכרסם לשחזר במהירות ולדמיין מורפולוגיה המיטוכונדריה. טק זהnique יכול לשמש גם כדי לספק מידע מדויק על מספר המיטוכונדריה, נפח, גודל והפצה באזור המוח מוגדר. מאז רזולוציית התמונה המתקבלת היא גבוהה (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) פגמים מורפולוגיים ברוטו המיטוכונדריה יכול גם להתגלות.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים דינמיים אשר משנים את צורתם ומיקומם תלוי רמזים הסלולר וצרכימים, באינטראקציה הדוקה עם שלד תא תא, ובתגובה לאירועים סלולריים כמו זרמי סידן בנוירונים 1. המיטוכונדריה גם אינטראקציה עם אברונים תאיים אחרים למשל reticulum endoplasmic, אשר בתורו מסדיר הדינמיקה שלהם המטבוליזם 2. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי מראה ההטרוגניות של סוגי תאים שונים כלומר. את הצורה של אברון משתנית צינורי לזה מורכב יריעות, צקי אליפסות 3. הוכח כי חלבוני מחזור היתוך וביקוע המיטוכונדרי יכולים לווסת את המיקום, גודל, צורה והפצה של המיטוכונדריה 4. יתר על כן, שינויים בצורת המיטוכונדריה המשויכים ניווניות של מערכת עצבים, פלסטיות עצבית, ניוון שרירים, איתות סידן, דור מיני חמצן תגובתי כמו גם תוחלת חיים ומות תא להפליל that תא ספציפי מורפולוגיה המיטוכונדריה היא קריטית לשמירה על תפקוד סלולארי רגיל 5-11.

פונקצית bioenergetic גדולה של המיטוכונדריה היא ליצור אדנוזין אדנוזין (ATP) על ידי ביצוע סדרה של תגובות מטבוליות שכוללות פירוט מלא של חומרי הזנה (גלוקוז כלומר, חומצות-שומן או אמינו חומצות) דרך מחזור TCA ו OXPHOS מסלולי 12. המוח האנושי מהווה רק 2% ממשקל הגוף אולם היא צורכת ~ 20% מהאנרגיה הכוללת המיוצר מה שהופך אותו באנרגיה מאוד תובעני איבר 13. לכן זה לא מפתיע כי תפקוד המיטוכונדריה בבני האדם מוביל למספר רב של ביטויי נוירולוגיות 14-17. מוטציות גנטיות רכיבי OXPHOS הפוגעות מובילים דור ATP להפרעות המיטוכונדריה 17,18, אשר הן קבוצה הטרוגנית קליני של הפרעות עם שכיחות של ~ 1: 5,000 אנשים, ואחד הגורם השכיח ביותר של מ 'פרעות etabolic אצל ילדים ומבוגרים. גירעון של ATP נגזרות המיטוכונדריה משפיע על מערכות איברים מרובות עם איברים בדרישת אנרגיה גבוהה כגון מוח, לב ושרירי שלד להיות מושפעים בעיקר בחולים אלו 14,17,18. בשנים האחרונות, מחקרים רבים סיפקו ראיות תפקוד המיטוכונדריה הן הפרעות התפתחותיות ו ניווניות 15-17,19,20. מאז המיטוכונדריה חיוני קריטיים להתפתחות המוח ותפקודו, קיים הכרח לפתח פרוטוקולים שיכולים לנתח שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה מוח, מבנה, גודל, מספר והפצה תחת שני המדינות בריאות וחולות. מודלים עכבר עם חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (GFP) הופקו לדמיין תנועות המיטוכונדריה ולוקליזציה במוח 21,22. אמנם זה הוא כלי שימושי מאוד לבחון תנועתיות המיטוכונדריה והפצה כללית, ישנם כמה חסרונות אשר includדואר רזולוציה מוגבלת ורגישות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תכונות אלה מקשות לעקוב אחר המיטוכונדריה בגודל קטן יחסית. באופן דומה, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכי סדר נוצל בהצלחה כדי להציג המיטוכונדריה הסינפטי 23, אך שיטה זו היא זמן רב מאוד. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ידועה להיות מאוד דינמי כפי שהם עוברים מחזורי ביקוע ואיחוי רציפים, וברוב התאים המיטוכונדריה לשמור על רשת מחוברת ביותר 24-26. נוירונים ביותר מקוטבים תאים דנדריטים עם מרובי אקסונים מורחבים, ואת המיטוכונדריה יוצר רשת רשתי המחובר בגוף התא ייתכן שיהיה צורך להפריד כפי שהם עושים את דרכם דרך neurites אלה (איור 1). זה עושה המיטוכונדריה המוח מאוד מגוונת בגודל ובצורה. לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לחסום פנים סדרתי (SBFSEM) טכניקה, צפינו בעבר כי ההבדל בהיקף או גודל mitochondr extrasynapticIA למיטוכונדריה נוכחים במסופים העצבים יכול להיות הרבה כמו שש עשר לקפל 27.

קיימות מספר גישות לביצוע נפח מנתח 28, הכולל TEM סעיף סדר 29, קלטת אוטומטית איסוף ultramicrotome 30 SEM, ממוקד אלומת יוני SEM 31, ו SBFSEM 32. ניתוח SBFSEM יש יתרונות בכך שהיא כוללת את הרזולוציה כדי לספק נתונים כמותיים על הצורה, גודל מורפולוגיים, הפצת מספר אברונים כגון המיטוכונדריה באזורים עד 1 מ"מ של המוח. המבצע הטכני הוא גם הכי פחות תובעני, עם רכישת נתונים וניתוח במסגרת היכולות של מעבדות ביולוגיות רבות שאין להן ניסיון EM קודם. הופעתו של מכשירים מסחריים להפקת תמונות בסעיף דמוי סדרתי עשתה ניתוח ultrastructural 3D של רקמות טכניקה שיגרתית, אשר נוסף מאפשרת ניתוח volumetric משוחד בצורה מהירה דיר 28 32, על בסיס רעיון הוצג על ידי לייטון בשנת 1981 33. מחקרים רבים מאז הקים טכניקה זו ככלי מרכזי בניתוח שחזור של מעגלים עצביים 34. יתר על כן, עבור פרויקטים בקנה מידה הרבה יותר קטן, הוא מספק ניתוח שחזור לזהות אברונים הסלולר 27,35-39. מאז, התמונות רכשו נגזרות אלקטרוני פיזור בחזרה מתח נמוך, פרוטוקולים מכתימים חדשים המשלבים טכניקות מכתימות מתכות כבדות ידועות שונות פותחו כדי להגדיל את הרזולוציה 40.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור ניצול הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים 3D וניתוח נפח של המיטוכונדריה במוח מבוסס על שיטות שבעבר שימשו על ידינו ואחרים 38,39,41. השיטות שלאחר עיבוד רקמות משמש תוארו בעבר על ידי Deerinck ואח40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה טק.

זהירות: אמצעי זהירות קיצונית יש לנקוט בעת טיפול והשלכת מספר מרכיבים בשימוש בפרוטוקול זה. לפני השימוש, מקומיים הנחיות מוסדיות ושיטות בריאות ובטיחות חייבים יוקמו אחריו, במיוחד עבור tetroxide אוסמיום, אשר תנודתי רעילה במיוחד תצטט uranyl, שהוא גם מתכות כבדות ומקור הרדיואקטיביות, וחנק עופרת, שהוא רעל מתכות כבד. Thiocarbohydrazide (TCH) יכול לפרק לייצר גזים נפיצים ורעילים, אם טיפל באופן שגוי. מוסדות רבים יצטרכו מתקן הליבה EM שבו ריאגנטים אלה מנוצלים באופן שגרתי והוא יכול לספק סיוע.

1. הכנת רקמת המוח והדמיה SBFSEM

  1. להרדים צעיר - עכבר שחור C57 (~ 2 בן 4 חודשים) (זן C57BL / 6-י) באמצעות 4 - 5% isoflurane בעקבות ההנחיות המוסדיות. אשר הרדמה על ידי ניטור אובדן טונוס שרירים, חוסר תנועות רצוניות ותגובות גירויים מרתיעים כמו קמצוץ זנב.
  2. הצמד את העכבר על מגש לנתיחה ולעשות חתך בעור לאורך קו אמצע גחון. ודא חתכים נוספים בעור לחשוף את החזה של העכבר. לחתוך את הסרעפת, ובזהירות לנתח את חלל בית החזה לאורך בפריפריה כדי לחשוף את הלב הפועם, ולאחר מכן לבצע חתך על העלייה הימנית.
  3. באמצעות צינורית פרפר, cannulate החדר השמאלי. Perfuse העכבר transcardially באמצעות 10 - 20 מ"ל של חיץ מלוחים פוספט (PBS) pH 7.2, עד exsanguination אושר על ידי שינוי צבע של הכבד.
    הערה: שינוי הצבע של כבד משמש כמדריך כדי לקבוע את מידת exsanguination. ודאו שינויי צבע כבד מפני חום אדמדם חיוורים ורודים.
  4. Perfuse העכבר transcardially באמצעות 10 - 20 מ"ל של 2% glutarאלדהיד ו -4% paraformaldehyde שנעשה חיץ 0.10 M cacodylate (7.2 pH), כדי לתקן את רקמת המוח במהירות מבפנים. קיבוע מנוטר על ידי התבוננות התקשות הזנב.
    הערה: הכן 0.10 M cacodylate חיץ (pH 7.2) על ידי המסת 2.14 גרם של cacodylate נתרן 80 מ"ל מים, להוסיף חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH, ולהפוך את נפח 100 מ"ל עם מים.
  5. בעקבות זלוף, לערוף את העכבר, לנתח את המוח, ואחריו קיבעון חיץ 0.10 M נתרן cacodylate (7.2 pH) המכיל glutaraldehyde 2% ו -4% paraformaldehyde למשך 48 שעות ב 4 o C.
  6. לאחר 48 שעות לעשות 400 חלקים העטרה מיקרומטר באמצעות vibratome ואז בזהירות לנתח את האזור של עניין במוח (למשל, בהיפוקמפוס) תחת המיקרוסקופ לנתיחה 42. בזהירות לחתוך את הרקמה ולצלם תמונה לשימורי אורינטציה.
    הערה: הודעת שיטות עיבוד של מכתים רקמות SBFSEM משלבת מגוון של שיטות מכתימות מתכות כבדותכדי לשפר את הרזולוציה ומבוססים על השיטה שפותחה בעבר על ידי Deerinck ואח 40.
  7. שטוף את הרקמות קבועות glutaraldehyde 3 פעמים, 5 דקות כל אחד 0.1 M cacodylate חיץ (pH 7.2).
  8. כן פתרון חומצה טאני 0.1% על ידי המסת חומצת טאני ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ (pH 7.2). מערבולת עד שהיא נמסה ולסנן דרך 0.45 מיקרומטר מסנן, במידת הצורך.
  9. Postfix הרקמות עם cacodylate שנאגרו 0.1% חומצה טאני ידי דוגרים מגיב 1 מ"ל עבור 30 - 60 דקות ב RT.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בגודל רקמות, אבל 30 דקות עובדות הכי טובות ברוב הרקמות.
  10. לשטוף רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב חיץ cacodylate (pH 7.2).
  11. ממיסים פרוציאני אשלגן 0.3 גרם 0.86 גרם נתרן cacodylate ב 10 מ"ל מזוקקים H 2 O (DH 2 O). שמור את הפתרון פרוציאני אשלגן על הקרח. רק לפני השימוש, מוסיפים 10 מ"ל של 4% tetroxide אוסמיום (OSO 4).
  12. כתם הרקמות עם 2% osפתרון mium-פרוציאני במשך 90 דקות, על הקרח. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  13. הכן 1% thiocarbohydrazide פתרון (TCH) על ידי המסת 0.1 גרם TCH ב 10 מ"ל DH 2 O. ממיסים ב 60 ° C על ידי מתערבל כל 10 דקות עד להמסה מלאה. שימו לב להוראות הבטיחות בזמן הטיפול TCH, במיוחד לטפל כדי למנוע שימוש של מתכות, חימום לטמפרטורה גבוהה, או פתרון המאפשר להתייבש.
  14. פנק את הדגימות עם 1 מוכן טרי% TCH במשך 20 דקות ב RT. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  15. לדלל 4% OSO 4 ל -2% עם DH 2 O, רקמות הכתם עם tetroxide אוסמיום מימית 2% על ידי דוגרים במשך שעה 1. לשטוף רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחד עם DH 2 O.
  16. דגירה דגימות O / N ב אצטט uranyl 1% ב DH 2 O על 4 מעלות צלזיוס.
  17. כן פתרון aspartate יתרון וולטון (כפי שתואר על ידי Deerinck ואח 40).
    1. ממיסים 0.998 גרם L-Aspartate ב 250 מ"ל DH 2 Oולאחר מכן להוסיף 10 N אשלגן הידרוקסידי (KOH) באופן dropwise עד pH מגיע 5.5. לאחר תקנון pH, להוסיף 0.066 גרם של חנקת הובלה 10 מיליליטר אספרטית מניות חומצה וחומה עד 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  18. לשטוף רקמות ב DH 2 O ו דגירה עם כתם aspartate יתרון וולטון למשך 30 דקות בתנור C 60 °. לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד ב DH 2 O.
  19. מייבשי דגימות באמצעות סדרה של אלכוהול עבורן באמצעות פתרונות צוננים של 20%, 50%, 75%, 85% אתנול 95% במשך 5 דקות כל אחד, ואחריו 100% אתנול 3 פעמים, 10 דקות כל אחד.
    הערה: השתמש 100% אתנול מבקבוק טרי נפתח, כמו אתנול נפתחה סופג מים מהאוויר ולגרום הטבעה להיכשל. incubations יותר יהיה צורך עם דגימות רקמה גדולות.
  20. לשטוף דגימות 2 פעמים, 15 דקות כל אחד ב פרופילן אוקסיד.
  21. הפוך שרף הטבעה פלסטיק באמצעות שרף 25 מ"ל, 10.5 מ"ל DDSA (dodecenyl אנהידריד succinic), 15.5 מ"ל NMA (אנהידריד מתיל nadic) ו 1 מ"לDMP-30 (פנול 2,4,6-טריס dimethylaminomethyl). מערבב את השרף על ידי רועד. ספין ולאפשר שרף לעמוד עד נחישות בועות.
    הערה: זהו מתכון קושי בינוני סטנדרטי. סוגים אחרים של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) שרף פלסטיק ניתן להשתמש, אך יש לבדוק עם מדגם שליטה שאינם חיוניים מראש שלא כל שרפים לעבוד SBFSEM.
  22. דגירה הרקמות O / N ב 50: לערבב 50 של תחמוצת שרף פרופילן הטבעה, בבקבוקון כי הוא הכתיר בהתחלה, אז לא אטום אחרי 2 hr כך פרופילן אוקסיד מתאדה על פני תקופת 8 על - 10 שעות.
  23. מעביר את הרקמות שרפו הטבעה טריה 100% צלוחיות נקיות עבור שעה 2.
  24. דגימות שבץ שרף הטבעה טריה, בתוך תבניות שטוחות המכילות מודפסות מדבקות נייר, ולרפא אותם בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. אחרי בערך שעה 1, בודק את מיקום רקמות ויישור שוב, ולהתאים במידת הצורך.
  25. חתוך דגימות לאזור של עניין הר על פיני אלומיניום באמצעות גליןדבק מגע cyanoacrylate גרם או שרף אפוקסי מוליך, אז מעיל עם מי כסף להדביק סביב הצדדים של הבלוק כדי לספק נתיב מוליך לפין אלומיניום.
  26. לבחון דגימות רקמות באמצעות מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מצויד הבמה ultramicrotome ב-קאמרית גלאי אלקטרונים backscattered נמוך kV 32.
    הערה: קבל instrument- והאתר אימון במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) להשתמש ולהיות משתמש מורשה. לחלופין, בשיתוף עם מתקן חוקר או ליבה עבור פרויקטים קטנים עשוי להיות אפשרי. אימון קרינה ייתכן גם שיהיה צורך כמו SEMs ליצור צילומי רנטגן.
  27. כדי לדמות את הדגימות, השתמש את ההגדרות הבאות: 2.25 ק ו, ב 5 - 10 ננומטר / פיקסל ברזולוציה, עם גדלים בשדה בין 80 - 250 מיקרומטר x, y (תחום אחר גדלים אפשריים), ועובי פרוס של 50 - 100 ננומטר, עם סך של 250 - 600 פרוסות בתוך 16 - פרק זמן של 20 שעות.
    הערה: הגדרות שונות מהותית בין מיקרוסקופים שונים, אינדידגימות vidual, ואת הרזולוציה הרצויה. הגדרות אלה צריכות להפיק תמונות כי הם לפירוש בקלות עבור דגימות רבות.

2. ניתוח מערך נתוני ההדמיה

הערה: תוכנת J התמונה / פיג'י משמשת כדי לנתח את הנתונים והוא מסתמך על תוסף TrakEM2. צעדי עיבוד מקדימים עשויים להתבצע באמצעות מגוון רחב של תוכנות, ועלולים להיות נרחב או קטין בהתאם לרמת ניסיון ואת הערימות שהושגו. התמורות העיקריות באמצעות תוכנת קוד פתוח (ImageJ Ver 1.50b, פיג'י להוריד 1 Oct 2015) מתוארים כאן.

  1. המרת תמונות בפורמט TIFF 8 קצת מתמונות 16 סיבי הקניינית המקוריות על ידי פתיחת התוכנה ובחירת פריטי תפריט → תמונת סוג → 8 סיבי.
    1. אם ההמרה ניגודיות / בהירות אוטומטית במהלך שלב זה אינו אידיאלי עבור תמונות, לפתוח מחדש את תמונות 16-bit, ו תמונה העיתונות → התאם → בהירות / ניגודיות. בחר טווח שמתאים את כל התמונות, ולחץ על החל. ואז לבצע גonversion. הערה: בחלק SEMs, צעד זה עשוי לדרוש תוכנה יצרנית מיקרוסקופ.
    2. במידת הצורך, בשל תנועת תמונות פסולה בין פרוסות (למשל. להיסחף בשל טעינה), לרשום / ליישר את ערימות תמונה (פריטי תפריט Plugins → רישום → לינארית StackAlignmentWithSIFT). ברוב תוכנות רישום, להגדיר עבור "תרגום בלבד" מצב ולא "גוף נוקשה".
      הערה: גישות רבות ותוכנה תפעלנה: עבודות תוספת הרישום לנפות עבור יישומים רבים ויש גרסת מחסנית וירטואלית.
      1. במידת הצורך, להגדיל את גודל הבד לפני רישום (תמונה → התאם → CanvasSize) או להפחית אותו תחום עניין (תמונה → Crop).
        הערה: החלק להיסחף או מפשק אותן למעלה ולמטה עלול להתרחש, ומנסה תוספים אחרים או תוכנה עשוי להניב תוצאות טובות יותר. אפשרויות ידניות זמינות גם (למשל. ImageJ / פיג'י, ManualLandmarkSelection → רישום Plugins →).
    3. אם דסירed, תמונות גוניות כקטן, יותר לניהול גודל (למשל. 25%) באמצעות ImageJ (Scale → תמונה).
  2. הפעל את התוכנה, → בחר קובץ רצף יבוא → תמונה ולאחר מכן בחר את קבצי TIFF.
  3. הפעל את התוסף ידי בחירת קובץ → TrakEM2 החדש → (בלנק). שתי חלון תפתחנה; אחת מנהלת הפרויקט area_lists והשני מנהלת מעקב, והוא מכונה בשם "בד '.
  4. טען את ערימת התמונה לתוך התוסף על ידי ביצוע לחיצה ימנית על יבוא הבד. בחר יבוא ולחץ על ערימת יבוא. בתוך האפשרויות המוקפצות, סמן את התיבה עבור ערימות וירטואליות.
    הערה: למרות ערימות התמונה כבר נפתחות בתוכנה, הם חייבים גם להיות נפתחו התוסף. המחשב עלול לפעול בצורה חלקה יותר אם תיבת הערימות הווירטואליות מסומנת.
  5. לאחר mipmaps נוצר הערימה נטענת, קליק ימני על שם הפרויקט מתחת לחלון התוסף. קליק ימני על "פרויקט חדש" ב col התבניתטור ה, ובחר 'להוסיף ילד חדש "עבור פרויקט זה. קליק ימני שוב כדי לבחור 'area_list'.
  6. הגדר את קנה המידה Z-ציר הפרויקט להסכים עם ההגדרות מיקרוסקופ אלקטרונים המקורי על ידי לחיצה ימנית על הבד, ולאחר מכן לחץ על תצוגה ובחר כיול. כמו כן, להגדיר את Z-המידה על ידי בחירת כל השכבות בחלון התוסף, לחץ על זכות לבחור המידה Z ועובי.
  7. לחץ וגרור את 'הפרויקט' וכל הילדים 'לתוך פרויקט האובייקטים בסעיף כדי ליצור את "רשימות האזור' תחת לשונית 'Z השטח' בחלון הבד.
  8. בחר את 'רשימת האזור' ועל שמאל לחץ כדי לבחור ולהגדיר צבע. עכשיו, להשתמש בכלי המכחול להתחקות אובייקטים כגון המיטוכונדריה, בתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. 'Shift + הלחיצה' השתמשתי למלא במעגל סגור, "Ctrl + לגלול 'כדי להתקרב ולהתרחק, ו' Alt + לחיצה 'לפנות סמן מברשת צבע לתוך מחק.
  9. בחר בשני תחומים של ~ 10 - 15 מיקרומטרעל ידי 10 - 15 מיקרומטר בפינה השמאלית העליונה לפינה הימנית התחתונה של התמונה ולזהות כל המיטוכונדריה בתוך אזורים אלה כדי לאפשר דגימה של המיטוכונדריה משוחדת בכל בסיס הנתונים.
  10. על 'בד', להתבונן להתחקות המיטוכונדריה לאורך חלקים. הערה: המיטוכונדריה הוא די כהים / אברונים המופיעים צפופים, בסדר גודל דומה בקוטר גלילי רופף. Cristae הייחודית שהוקמה על ידי הקרום הפנימי וניתן להבחין בקלות בתוך אברון זה.
  11. כאשר סיימו עם התחקות, לחץ לחיצה ימנית על area_list תחת לשונית Z השטח, בחר באפשרות 'צג ב -3 D ". זה יריץ את תוסף צופה 3D כדי לצפות שחזור 3D של התמונה לייחס.
    1. כדי לבצע מדידות נפח המיטוכונדריה, אובייקט נבחר הצופה 3D, לחץ על הכרטיסייה 'הערוך' ובחר 'מאפיינים חפצים. אומדן נפח המיטוכונדריה מופיע יחד עם כמה מדידות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מדגימים כי מורפולוגיה המיטוכונדריה המוח והגודל הוא הטרוגני-תאים תת עצביים שונים. מיקרוסקופיה Confocal על תרביות נוירונים בצפיפות נמוכה transduced בהבעת lentivirus חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד הראה כי המיטוכונדריה המתגוררים soma העצבית ליצור רשת רשתי, ואילו הגרים neurites דיסטלי להפגין מורפולוגיה מוארך בדידים (איור 1 א.ב.). באמצעות טכניקת SBFSEM, המורפולוגיה המיטוכונדריה, הגודל, הנפח וההפצה נותחו במוח העכבר. תלת מימד (3D) תמונות של המיטוכונדריה שוחזרו משני neurites וסינפסות בהיפוקמפוס במוח העכבר. המיטוכונדריה presynaptic זוהו ומספר boutons presynaptic מחסה המיטוכונדריה תושב לכמת. הטרוגניות בגודל של המיטוכונדריה נצפו הדנדריטים לעומת תאים אקסונלית (אלחוטיאיור 1 CD). יתר על כן, רבים תאים presynaptic קטן בהיפוקמפוס במוח העכבר היו נטולי המיטוכונדריה (איור 2 AC). מדידות הנפח של שני המיטוכונדריה presynaptic ו extrasynaptic חשפו כי ההיקף או הגודל של המיטוכונדריה המתגוררת בתוך presynapses העצבית היה קטן משמעותי מאלו המתגוררים באזור extrasynaptic (איור 2 DF). מעניין לציין, כי התפלגות גודל דו-ממדי (2D) של המיטוכונדריה הנמדד הדגימה משוחדת של 200 המיטוכונדריה הלא סומטיים הראה כי ~ 11% של שבריר המיטוכונדריה טמון מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור (איור 2G). בנוסף, תמונות 2D נרכשו על ידי ניתוח SBFSEM לספק מוגברות ברזולוציה לדמיין מאפייני ultrastructural של המיטוכונדריה בודד (איור 3 AB). בשל הטופוגרפיה נראה בבירור של הרקמה, זה עוד יותר ניתן לסווג את comp הסלולרartment של המיטוכונדריה על ידי קביעת קרבתו מבנים לזיהוי בקלות כמו גרעין (סומטי) ואת שלפוחית ​​סינפטית (presynaptic) (איור 3 AB). על מנת לזהות המיטוכונדריה נוכחת התהליכים העצביים, לשחזר את תהליך פרט האקסון או דנדריט מבוסס על קיומו או אי קיומו של boutons presynaptic בהתאמה 42. בהתבסס על תוצאות אלו, אנו מציעים כי SBFSEM היא שיטת אנליטית יקרה מאוד לזהות צורה המיטוכונדריה, גודל, מספר והפצה ברקמת המוח וכי פגמי ברוטו כל במבנה המיטוכונדריה והפצה ניתן גם נקבעו באמצעות שיטה זו. מאז מאפייני ultrastructural של סוגי תאים שונים במוח הם ברורים, עבור למשל. נוכחות של גרגרי הגליקוגן האסטרוציטים, אפשר גם לנתח את ההבדלים מסוג תא ספציפי במיטוכונדריה המוח.

איור 1 איור 1:. הטרוגניות העצבית מיטוכונדריאלי המורפולוגיה והפצת תרבויות קורטיקלי מ גורי עכבר היום לאחר לידת 1 היה transduced עם מבטא lentivirus חלבון פלואורסצנטי ירוק mitochondrially במיקוד (Mito-GFP). (א) מציג סומה נוירונים להביע Mito-GFP, שים לב רשת Reticulate של מורפולוגיה המיטוכונדריה; נו = גרעין; סרגל = 5 מיקרומטר. (ב) מראה מורפולוגיה המיטוכונדריה מוארכת neurites דיסטלי; סרגל = 5 מיקרומטר. (C) התמונה נציג 2D מן הנתונים SBFSEM שנוצר מרקמת המוח העכבר, המיטוכונדריה מגואלות בירוק, דנדריטים מגואלות ב ורידים כחולים אקסונלית מגואלות בצבע חום; סרגל = 1 מיקרומטר. (ד) 3D שחזורים של במיטוכונדריה של neurites של רקמת מוח עכבר, לציין את ההבדל בגודל בין דנדריטים indicat המיטוכונדריה אקסונליתאד על ידי ראש חץ גדול וקטן בהתאמה; סרגל = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: סריקה בלוק פנים סידורי מיקרוסקופית אלקטרונים (SBFSEM) ניתוח חשף שפע נמוך של המיטוכונדריה במסופי Presynaptic (א) נציג 2D ultramicrograph מניתוח הנתונים SBFSEM המתקבל hippocampi של עכברי-בר P15;. סרגל = 1 מיקרומטר. (ב) מציג שחזור 3D של 10 מסופי העצב presynaptic. שים לב, רק 4 מתוך 10 מסופי presynaptic הראה המיטוכונדריה צויר בהם; סרגל = 1 מיקרומטר. (ג) גרף בר מראה את לכמת 173 משוחזר מסופי העצב presynaptic מן SBניתוח נתוני FSEM. (D) תמונת נציג 2D ממאגר נתוני SBFSEM מראים את המיטוכונדריה extrasynaptic במיטוכונדריה הכחולה presynaptic בירוק; סרגל = 1 מיקרומטר. (E) 3D שחזורים של המיטוכונדריה presynaptic ו extrasynaptic מן הנתונים SBFSEM באמצעות התוכנה; סרגל = 1 מיקרומטר. (F) גרף בר מראה את עוצמת הקול של המיטוכונדריה extrasynaptic ו presynaptic. נתונים הם זממו כמו ממוצע ± SEM; n = 3 מערכי נתונים שונים (כולל 62 המיטוכונדריה presynaptic ו -80 המיטוכונדריה extrasynaptic בסך הכל); * מתאר ערך p = 0.0405. (G) אזור 15 על ידי 15 מיקרומטר בכל ארבע הפינות של תמונות סומן וכל המיטוכונדריה הלא סומטיים זוהתה לאפשר דגימה אקראית. הממד לפחות של המיטוכונדריה ~ 200 נמדד. גרף פאי מראה כי ~ 11% של המיטוכונדריה הלא סומטיים היו <200 ננומטר בממד שהוא מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור. יש נתון זה בeen מותאמת שאוון ואח 27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תמונות 2D SBFSEM מן גרעיני Lateral ברך של עכבר המוח (א) שתי תמונת SBFSEM נציג ממדי מן הגרעין הברך הצדי (8/8 מיקרומטר) מפגין טופוגרפיה מפורטת של האזור.. סומה גרעין מסומנת; סרגל = 2 מיקרומטר. (ב) גדלה של לאיזור שמסומן הריבוע אדום בבאור א פנל כי הקרומים החיצוניים ופנימיים של המיטוכונדריה וכן cristae היווצרות גלויים לעין. הטופוגרפיה ויחסי כדי אברונים אחרים המבנה התאי הוא ציין גם. PS מציין דוגמא המיטוכונדריה presynapticו NS מציין דוגמה הלא הסינפטי (NS) המיטוכונדריה סומטיות; סרגל = 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המורכבות של מערכת העצבים מהוות אתגר משמעותי בשחזור כרך גדולה של רקמה וניתוח המורפולוגיה וההפצה של אברונים כגון המיטוכונדריה עם רזולוציה נאותה. מספר תאים כולל נוירונים, oligodendrocytes ו האסטרוציטים עם תהליכים רבים המורחבת בשלושה ממדים אינטראקציה בתוך רקמת המוח 43. מאז המיטוכונדריה מתגוררת היא סומה של תאים ותהליכים רחוקים, המורפולוגיה המיטוכונדריה היא pleomorphic מאוד במערכת העצבים (איור 1). מידע מבני 3D הולם עם רזולוציה מספיק ולכן לא ניתן נרכש על ידי שיטות מיקרוסקופיה האור רגילות כגון מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים 44,45. מיקרוסקופי אלקטרונים הוא הטכניקה זמינה כרגע רק המאפשרת שחזור של כמויות גדולות של רקמה עצבית עם רזולוציה גבוהה מספיק. באופן מסורתי, שחזור 3D של רקמה עצבית כבר להשיגד ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים סעיף סדרתי (SSTEM) סעיפים Ultrathin 29. עם זאת, התקדמות הטכנולוגית האחרונה שפרה את איכות רכישת נתונים במיקרוסקופ אלקטרוני הנפח והאוטומציה.

SBFSEM היא טכניקה הדמיה גוש-פנים אוטומטי המשלב חתך סדרתי בתוך החדר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, כדי לשחזר מבנה רקמות 3D במשך מאות מיקרומטרים, עם רזולוציה כי די בכך כדי לעקוב אחר תהליכי הסלולר הדק ולזהות אברונים קטנים . טכניקה זו פתחה את האפשרות של שחזור שגרתי שני מערכות חסרות חוליות חוליות עצבים. היא כוללת מספר שלבים כולל הכנת מדגם, תפעול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, רכישת נתונים, תמונה שלאחר עיבוד וניתוח תמונה. נהלים אלה דורשים הידיים על מיוחדים הכשרה והסמכה לתפעול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. שלושה גורמים מבקראל קרי. לנתח באזור אנטומי במוח הנכון, קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה, וביצוע ניתוח תמונה נכון. לאחר לנתח באזור אנטומי של עניין מן הפרוסה vibratome של רקמת המוח קבוע, חשוב לקחת את התמונה לשימורים בכיוון הנכון. זה יכול להיות אחר קשה לקבוע את הכתובת הנכונה עבור הדמיה. קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה תלוי קיבעון והליכים נאותים מכתים שלאחר תיקון ראוי. המוח נוטה לעבור הידרדרות מהירה ultrastructure שלה לאחר מותו. לכן, חשוב לתקן את המוח בתמיסת glutaraldehyde בשיטת זלוף transcardial נכונה. זו צריכה להיות מלווה על ידי קיבוע נוסף של המוח בתמיסה glutaraldehyde עבור שעה 24 לפחות. מאז רזולוציית התמונה תלויה לחלוטין על השילוב של מגוון שיטות מכתימות מתכות כבדות, זה קריטי לבצע את השיטה שלאחר התיקון כמפורט בפרוטוקול לרכוש quantifiablתמונות דואר. פתרונות צריכים להיעשות כמתואר השיטות. לבסוף, לניתוח תמונה מדויקת אברון / ים להיות מנותח צריך להיות מזוהה באופן חד-משמעי (למשל. על ידי הדמיה מאפיינים ultrastructural) לפני המעקב, ואת הנחיות התוכנה חייבת להיות צייתה באופן קפדני. הרזולוציה של התמונות שנרכשו צריכה להיות ידועה מר מ- פיקסלים כדי ננומטרים למדידות נפח.

מלבד התוכנה מתוארת הפרוטוקול לביצוע ניתוח תמונה, של תוכנה זמינה אחרת כמו לשחזר קנוסוס יכולה לשמש גם. למרות הדגש של הפרוטוקול המתואר הוא על הצגה במיטוכונדריה של מערכת העצבים, זה יכול להיות שונה כדי ליצור ברזולוציה גבוהה מידע 3D על מבני subcellular שונים אחרים (למשל. Reticulum endoplasmic, lysosomes וכו.) במגוון של רקמות.

בעוד מדריך מפורט על פתרון בעיות עבור o מיקרוסקופ אלקטרונים סורקperation הוא מעבר להיקף של מאמר זה (ראה מדריכים למשתמש מכשיר ומידע הכשרה), כמה בעיות מתרחשות באופן שוטף במהלך ניסויי הדמיה והבן כיצד לפתור אותם עשוי לעזור למשתמשים חדשים או אלה קבלה תמונות באמצעות מקורות שיתוף פעולה / מסחריים. בעיה נפוצה נטענת של המדגם אשר מתרחש בעיקר באזורי שרף המכילים חומר מועט, אם בכלל מוכתם. בתמונה "חיובית" (כלומר. Cytosol נראה לבן), הגרעינים, כלי דם, ומרחבי שרף ריקים עשויים להופיע "מושחרים". בנוסף, טעינה גם מקדמת להיסחף קרן מקומית וכתוצאה מכך השתאה תמונה נראית לעין. פתרונות אפשריים להשתנות בין מכשירים ודוגמאות. צמצום הגדרות ק ו מפחית את החפץ "השחרה" אך הוא עשוי לקדם להיסחף קורה יותר. שימוש במצב ואקום נמוך יותר, כולל חנקן (N 2) גז, אדי מים, וכו '. גם בתא מפחית טעינה, אבל במחיר משמעותי של רזולוציה סייגl לרעש יחס. בעיה נפוצה שנייה היא דילוג סכין. איטית סריקה עלולה לגרום ניזק נגרם קרן אל פני השטח לחסום שמחלק בצורה לא אחיד או בכלל לא הדמית חלק / חיתוך מחזורים (כלומר. תמונות רצופות מופיעות זהות). פתרונות קיימים מספר כולל הגדלת עובי חיתוך העומק / פרוסה עם z ברזולוציה מופחתת, גברת מהירות סריקת consequentially לקבל תמונות רועשות, הקטנת גודל פיקסל וקבלה נמוכה x / y ברזולוציה, ובחירת דוגמאות או באזורים עם כתמים עזים יותר (כפי גרוע באזורי -stained לגבות יותר, ניזק ביתר קל, ודורשים חשיפה קורית כבר להשיג תמונות עם מקובל אות -noise יחסים). רסיסי redeposition על פן הבלוק הוא מקור מזדמן של חפץ בתמונות, ואם זה קורה לעתים קרובות זה עשוי לדרוש השהיית הרכישה, ובזהירות לנקות את הסכין (האוויר נושב), או retrimming המדגם לגודל קטן יותר. טעינה בלוק פנים גם מקדם redeposition, ואת הצעדים שלעיל מאיעֶזרָה. תיקון מיקוד stigmation ייתכן גם שיהיה צורך כמו דגימות תמונות מיקרוסקופ ברציפות במשך שעות רבות עד שבועות, במהלכן שמעמיק ואקום בבית הבליעה, מחייב stigmation תיקונים. כל מיקרוסקופ אלקטרוני סורק שונה בהתאם לגיל ומאפיינים, וניסיון הוא המדריך הטוב ביותר. שינויים דרמטיים פתאומיים stigmation או מיקוד עלולים להתרחש כאשר חומר מחולק שומר על רכיבי הדמית מיקרוסקופ. התא חייב להיפתח וחומר וחלץ בזהירות באמצעות ואקום או חנקן דחוס. זה בהחלט דורש הכשרה מיוחדת.

יש כמה חסרונות של הטכנולוגיה SBFSEM לגבי השירות שלה בניתוח המיטוכונדריה במוח. חסרון עיקרי, המשותף לכל מיקרוסקופיה של רקמות קבועות, הוא בכך שהוא מספק תמונות סטטיות של אברון הדינמי מאוד. המיטוכונדריה עובר מחזורי ביקוע ואיחוי רציפים 26, הם ניידים שנסחרו לאורך neurite מעבד 21. פגמי סחר המיטוכונדריה ודינמיקה שאינם מספריים טהור או מבניים ניתן לפספס בקלות על ידי גישה זו, אם כי, על ידי הסתכלות על מספר המיטוכונדריה במרחב מוגדר מבחינה אנטומית כגון presynapse אחד יכול לפרש אם להובלת המיטוכונדריה עשוי להשתנות 39 . חסרון שני הוא שזה מתבצע רק חלק קטן של המוח, ולכן מעגלי פגמים ספציפיים בחלוקת המיטוכונדריה עלול לרדת לטמיון. גומל גישות 28,46 להרשות לעצמו את ההזדמנות לשלב את הדמיה confocal ו multiphoton עם הטכנולוגיה SBFSEM לייצר הן נתונים מולקולריים ultrastructural. לניתוח המיטוכונדריה, ולכן, הוא עשוי להיות שימושי כדי לבצע את SBFSEM לאחר בדיקה מיקרוסקופית לאור חלקים במוח או באמצעות נוגדן אנטיגן ספציפי המיטוכונדריה או באמצעות transgene המבטא חלבון פלואורסצנטי mitochondrially במיקוד. combinatio זהאסטרטגיה סופית עשויה לספק מתודולוגיה חזק כדי לזהות פגמים המיטוכונדריה בעכברי מודל של הפרעות נוירולוגיות המיטוכונדריה.

ישנן גם מגבלות טכניות המשותף צורות רבות של מיקרוסקופיה אלקטרונית כתוצאת משימוש fixatives הקשה, מכתימה מתכות כבדות וחדירה אחידה של כימיקלים. מגבלות אחרות יכולות לנבוע הטבעת הפלסטיק של דגימות רקמה. אזורים ריקים של שרף ומבנים מוכתמים בדלילות לשמור אלקטרונים במהלך הדמיה, גרימת סטיית קרן וסחיפה (תמונת עיקום) כמו גם אותות טעינה artifactual (למשל. גרעינים כהים לומן כלי דם), אשר שניהם לפגוע ברזולוציה. Beam נזק שרף גם מקדם חיתוך אחיד, ומסיבה זו, הדמיה בדרך כלל דורש פרוסות של 50 - 100 ננומטר יקוצצו מן פנים בלוק, ייצור ווקסלים הלא isotrophic ב בבסיסי הנתונים. מגבלות אחרות עבור יישומים מסוימים כוללים שהקטעים נהרסים ולא ניתן מחדש לאחר מכן,דבר העשוי לחייב משתמשים כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של אזורים שעשויים לא לכלול מידע שימושי.

יתרון עיקרי של SBFSEM הוא שזה לאוטומטי את תהליך חתך ההדמיה גושי רקמה על ידי שילוב של microtome מותאם אישית לתוך ואקום נמוך קאמרי SEM 32,33. מאז התמונות מתקבלות ישירות מהגוש פנים לפני כל קיצוץ, הבעיות של התקמטות סעיף, דחיסה והפסד במהלך הטיפול הם נמנעו באופן משמעותי, אם כי בתצהיר פסול העיקום בשל לחסום פן טעינה תורמות לאובדן תמונה ועיוות . יתר על כן, תמונות שהושגו מערכי נתונים גולמיים כבר מיושרים ודורשים רישום מיקרומטר בקנה מידה רק כדי להתאים להיסחף הקורה כדי להיות מקובל ביותר לניתוח. בגלל תהליך חתך אוטומטי, ברגע ואקום מערכת התייצב, ניתן הדמיה כרכים של רקמות גדולות ללא מעורבות משמעותית מצד המפעיל. ישנם יתרונות רבים של שימוש זההטכנולוגיה בביצוע מחקרים מורפולוגיים וכמותיים על אברונים ומבנים תאיים. אחד היתרונות הוא מקבל את המידע על מבנה 3D של המיטוכונדריה בתוך פרק זמן סביר. הזמינות של חבילות תוכנת שחזור קוד פתוח כמו לשחזר 47, TrakEM 48 ו קנוסוס 49-51 הפכה את הטכנולוגיה הזו כלי ניתוח מתקדמים שבו ultrastructure 3D המפורט של רשת עצבית מן במודלים של בעלי חיים ניסיוניים ניתן להשוות באופן ישיר. ניתוח התמונה semiautomated האוטומטי לחלוטין מתקרב 52 צפויים להפיק נתונים מכניסטית ביותר בחיות שבו מורפולוגיה המיטוכונדריה, פונקציה ו / או biogenesis צפויים להיפגע. מוקדם יותר ניתוח SBFSEM היה הפריע מאוד בשל ברזולוציה נמוכה, טכניקות הכנה מדגם אולם חדש יותר מעורבים שיטות מכתים משופרת 40 שיפרו באופן ניכר את הרזולוציה עד כדי שאפילו נ סינפטי יחידesicle יכול להיפתר בקלות. ברזולוציה זו פגמים ultrastructural במיטוכונדריה כגון vacuolation, הפרעה קרום, ואובדן cristae ניתן להבחין בקלות, ואת ההפצה של המיטוכונדריה הפגומה בתוך תאים ניתן לקבוע 38,39. הרזולוציה הגבוהה של טכניקה זו מספקת יתרון גדול על פני מיקרוסקופ אור שבו ברזולוציה מוגבלת ~ 200 ננומטר ציר XY ו ~ 500 ננומטר ציר Z. המיטוכונדריה הם אפוא רק על מגבלת הרזולוציה של מיקרוסקופ אור 53. למרות המיטוכונדריה שיש ממדים מתחת לגבול הרזולוציה עדיין ניתן דמיינה ידי מיקרוסקופ אור, המידות שלהם לא ניתן למדידה באופן מהימן. חשוב לציין, המיטוכונדריה כי הם מופרדים על ידי מרחק נמוך מגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ אור לא יכולה להיפתר על ידי מיקרוסקופ אור. יתרון נוסף הוא כי ניתוח מבני המיטוכונדריה יכול להתבצע בהקשר של רקמות, ללא בידוד של אברון. אל פח זהנמוך להשוואות המתאים בתוך הרקמה המבוססת על לוקליזציה המיטוכונדריה, עבור למשל אקסונלית לעומת סומטיים ו / או המיטוכונדריה הדנדריטים. יתרון נוסף הוא כי היא בדרך כלל ניתן לקבוע האם המיטוכונדריה הוא עצבי או neuroglial בלוקליזציה ידי ביצוע תהליכי אברון מגדיר, כגון חוטי גליה וגליקוגן עבור האסטרוציטים או המיאלין עבור oligodendrocytes. תהליכי נוירונים ותאי neuroglial הם בדרך כלל בסמיכות, ועם 2D גישות כגון TEM זה עלול להיות קשה להקצות בביטחון אילו תהליכים הם עצביים אשר neuroglial.

לסיכום, טכנולוגית SBFSEM מספקת ערימות של תמונות סדרתי ומכסת תחומי רקמה 20 - 1,000 מיקרומטר בגודל עם רזולוצית ultrastructural 5 - 10 ננומטר ומעלה, המאפשרים תאי מערכת עצבים מרכזיים כולה האברונים כגון המיטוכונדריה להיות צלמה, נמדד ושחזר . במאמר זה, יש לנו פרוvided כמה גישות מעשיות תוך שימוש בטכנולוגיה זו. יישומים עתידיים כוללים ניתוח המבנה המיטוכונדריה והפצה במגוון מודלים בבעלי החיים של מחלות נוירולוגיות כגון מודלי מחל התפתחותיות ו ניווניות, כמו גם בניתוח ultrastructures subcellular השונה כגון, גרעין reticulum endoplasmic ו / או lysosomes בתאים שלמים או רקמות תחת בריא מצבי מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Neuroscience גיליון 113 SBFSEM המיטוכונדריה OXPHOS המוח סינפסה שחזור 3D
ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, … More

Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter