En metod för uppfödning Drosophila melanogaster enligt axenisk och gnotobiotiska villkor presenteras. Fly embryon dechorionated natriumhypoklorit, överfördes aseptiskt till sterila diet, och föds upp i slutna behållare. Ympning kost och embryon med bakterier leder till gnotobiotiska föreningar, och bakteriell närvaro bekräftas genom plätering hela kroppen Drosophila homogen.
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
De flesta djur är intimt förknippade med bakterier (mikroorganismer) från födseln till döden 1. Jämförelser av mikroorganismer fria (axenisk ") och mikroorganismassocierade (" konventionella ") djur har visat mikrober påverkar olika aspekter av djurhälsa, inklusive metaboliska, näringsmässiga, vaskulär, lever-, respiratoriska, immunologiska, endokrina och neurologisk funktion 2. Bananflugan Drosophila melanogaster är en viktig modell för att förstå många av dessa processer i närvaro av mikrober 3,4 och för att studera mikrobiota inverkan på djurhälsa 5,6. Inga bakteriearter finns i varje individ ( "kärna"), men Acetobacter och Lactobacillus arter dominerar numeriskt mikrobiota av både laboratorie uppfödda och vildfångad D. melanogaster. Andra Acetobacteraceae (inklusive Komagataeibacter och Gluconobacter), Firmicutes (t.ex. Enterococcus och Leuconostoc), och Enterobacteriaceae är antingen ofta förekommer i Drosophila individer med låg förekomst, eller oregelbundet närvarande vid hög förekomst 7-12.
Mikrobiota av Drosophila och däggdjur obeständig inom och mellan generationer 14,19. Mikrobiota förgänglighet kan leda till fenotypisk buller vid mätning mikrobiota beroende egenskaper. Till exempel Acetobacteraceae inflytande lipid (triglycerider) lagring i Drosophila 15-18. Om Acetobacteraceae är mer rikligt i flugor i en flaska än i en annan 19, kan isogena flugor ha olika fenotyper 20. En lösning på problemet med mikrobiota förgänglighet i möss 14 har i praktiken sedan 1960-talet, genom att införa en definierad gemenskap av 8 dominerande mikrobiella arter mus valpar varje ny generation (förändrad Schaedler flora),se till att varje valp utsätts för samma nyckelpersoner i musen mikroorganismer. Denna praxis kontroller för mikrobiota sammansättningen även när mikrobiota är inte det primära målet för studien 32, och sätter prejudikat för att säkerställa förekomsten av viktiga mikrober i en mängd olika experimentella betingelser.
För att definiera påverkan av mikrober på Drosophila näring har flera protokoll för att härleda axenisk fluglinor utvecklats, bland annat hypoklorit dechorionation av embryon (antingen härrör de novo varje generation eller underhålls generationally genom överföring till sterila dieter) och antibiotikabehandling 13. Det finns fördelar för olika metoder, såsom lätthet och snabbhet för både av antibiotika behandling och seriell överföring, jämfört med större kontroll över störande variabler med de novo dechorionation (t.ex. ägg densitet, restkontaminerande mikrober, off-target antibiotika effekter). Oberoende av metoden förberedning, införandet av specificerade mikrobiella arter axenisk embryon tillåter odling av Drosophila med definierade ( "gnotobiotiska) samhällen. Alternativt imitera användningen av Schaedler flora, denna gemenskap kan ympas till konventionellt som ägg (efter steg 6-7) för att säkerställa närvaron av egenskapspåverkande mikrober i varje flaska och undvika komplikationer av mikrobiota förgänglighet. Här beskriver vi protokoll för att höja axenisk och gnotobiotisk Drosophila av de novo dechorionation av embryon, och för att bekräfta närvaron av infört eller kontaminerande mikrobiella taxa.
Den metod som beskrivs här är en av flera metoder för embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, tillsammans med alternativa metoder för uppfödning axenisk flugor, inklusive seriell överföring av axenisk vuxna 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andra dechorionation metoder inkluderar etanol tvättar och minska 11,25,26 eller förlänga 8 hypoklorit behandling. Olika tvättsteg kan underlätta uppfödning olika flyga genotyper: i en tidigare studie fl…
The authors have nothing to disclose.
Vissa detaljer i detta protokoll har optimerats med hjälp av Dr Adam Dobson, som också värdefulla kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Stiftelsen för National Institutes of Health (FNIH) licensnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD och AED). FNIH licensnummer 1F32GM099374-01 (PDN), och Brigham Young University startmedel (JMC, MLK, MV). Kostnader för publicering stöddes av Brigham Young University College of Life Sciences och Institutionen för växt- och djurliv Sciences.
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |