En metode til opdræt Drosophila melanogaster under Axeniske og gnotobiotiske betingelser præsenteres. Fly embryoner dechorionated i natriumhypochlorit, overføres aseptisk til sterilt kost, og opdrættet i lukkede beholdere. Pode kost og embryoner med bakterier fører til gnotobiotiske foreninger, og bakteriel tilstedeværelse bekræftes ved plating hele kroppen Drosophila homogenater.
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
De fleste dyr er intimt forbundet med bakterier (mikrobiota «) fra fødsel til død 1. Sammenligninger af mikroorganismer-fri ( 'axenisk «) og mikroorganisme-associerede (' konventionelle ') dyr har vist mikrober påvirke forskellige aspekter af dyrs sundhed, herunder metaboliske, ernæringsmæssige, vaskulær, lever-, respiratorisk, immunologiske, endokrine og neurologiske funktion 2. Frugten flyve Drosophila melanogaster er en vigtig model til forståelse mange af disse processer i tilstedeværelse af mikrober 3,4 og for at studere mikrobiota indflydelse på dyresundhed 5,6. Ingen bakteriearter er til stede i hver enkelt ( "kerne"), men Acetobacter og Lactobacillus arter numerisk dominere mikrobiota af både laboratorie-opdrættet og vild-fanget D. melanogaster. Andre Acetobacteraceae (herunder Komagataeibacter og Gluconobacter), Firmicutes (såsom Enterococcus og Leuconostoc), og enterobakterier er enten ofte til stede i Drosophila enkeltpersoner på lav tæthed, eller uregelmæssigt til stede ved høj overflod 7-12.
Den mikrobiota af Drosophila og pattedyr er ustadig inden for og på tværs af generationer 14,19. Mikrobiota ustadighed kan føre til fænotypisk støj ved måling mikrobiota-afhængige egenskaber. For eksempel Acetobacteraceae indflydelse lipid (triglycerid) opbevaring i Drosophila 15-18. Hvis Acetobacteraceae er mere rigelige i fluer med et hætteglas end i et andet 19, kan isogene fluer har forskellige fænotyper 20. En løsning på problemet med mikrobiota ustadighed i mus 14 har været i praksis siden 1960'erne, ved at indføre et defineret fællesskab af 8 dominerende mikrobielle arter til muse unger hver ny generation (ændret Schaedler flora),sikre, at hver hvalp er udsat for de samme centrale medlemmer af musen mikrobiota. Denne praksis kontrollerer for mikrobiota sammensætning, selv når mikrobiota er ikke det primære mål for studiet 32, og satte præcedens for at sikre tilstedeværelsen af centrale mikrober i forskellige eksperimentelle betingelser.
At definere indflydelse mikrober på Drosophila ernæring, har flere protokoller til at udlede Axeniske flueliner blevet udviklet, herunder hypochlorit dechorionation af embryoner (enten afledt de novo hver generation eller vedligeholdes generationally ved overførsel til sterile diæter) og antibiotisk behandling 13. Der er fordele for forskellige tilgange, såsom lethed og hurtighed for både af antibiotika behandling og seriel overførsel, versus større kontrol med forstyrrende variabler med de novo dechorionation (fx æg tæthed, resterende kontaminerende mikrober, off-target antibiotiske virkninger). Uanset fremgangsmåden tilforberedelse, indførelse af bestemte mikrobielle arter Axeniske embryoner tillader kultur af Drosophila med definerede ( 'gnotobiotiske «) samfund. Alternativt efterligner brugen af Schaedler flora, dette samfund kunne podes til konventionelt lagt æg (følgende trin 6-7 kun) for at sikre tilstedeværelsen af egenskab-påvirke mikrober i hvert hætteglas og undgå komplikationer af mikrobiota ustadighed. Her beskriver vi protokollen for at hæve axenisk og gnotobiotiske Drosophila ved de novo dechorionation af embryoner, og til bekræftelse af tilstedeværelsen af indførte eller kontaminerende mikrobiel taxa.
Den her beskrevne metode er en af flere metoder til embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, sammen med alternative metoder til opdræt Axeniske fluer, herunder seriel overførsel af Axeniske voksne 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andre dechorionation metoder omfatter ethanol vaske og reducere 11,25,26 eller forlænge 8 hypochlorit behandling. Forskellige vasketrin kan støtte opdræt forskellige flyve genotyper: i en tidligere undersøgelse meste af ~…
The authors have nothing to disclose.
Nogle oplysninger om denne protokol blev optimeret med hjælp fra Dr. Adam Dobson, der også nyttige bemærkninger til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Fonden for National Institutes of Health (FNIH) tilskud nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, og AED). FNIH tilskud nummer 1F32GM099374-01 (PDN), og Brigham Young University startup midler (JMC, MLK, MV). Offentliggørelse omkostninger blev støttet af Brigham Young University College of Life Sciences og Institut for Plantebiologi og Wildlife Sciences.
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |