Summary

L'élevage du Fruit Fly<em> Drosophila melanogaster</em> Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

Une méthode pour l' élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l'hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l'alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

La plupart des animaux sont intimement associés à des bactéries ( «microbiote») de la naissance à la mort 1. Les comparaisons de ( «classique») des animaux exempts de micro – organismes ( 'axénique') et un micro-organisme associé ont montré microbes influencent divers aspects de la santé animale, y compris métabolique, nutritionnel, vasculaire, hépatique, respiratoire, immunologique, endocrinien, et la fonction neurologique 2. La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un modèle clé pour comprendre un grand nombre de ces processus dans la présence de microbes 3,4 et pour l' étude microbiote influence sur 5,6 de la santé animale. Aucune espèce bactérienne est présente dans chaque individu ( «noyau»), mais les espèces Acetobacter et Lactobacillus dominent numériquement le microbiote des deux élevés en laboratoire et sauvages capturés D. melanogaster. Acetobacteraceae autres (y compris Komagataeibacter et Gluconobacter) Firmicutes (comme Enterococcus et Leuconostoc), et entérobactéries sont soit souvent présent chez les individus de drosophile à faible abondance, ou irrégulièrement présent à forte abondance 7-12.

Le microbiote de la drosophile et les mammifères est inconstante au sein et à travers les générations 14,19. Microbiota inconsistance peut conduire à un bruit phénotypique lors de la mesure des traits de microbiote-dépendants. Par exemple, le stockage Acetobacteraceae influence lipides (triglycérides) chez la drosophile 15-18. Si Acetobacteraceae sont plus abondants dans les mouches d'un flacon que dans un autre 19, les mouches isogéniques peuvent avoir différents phénotypes 20. Une solution pour le problème de microbiote inconsistance chez la souris 14 a été dans la pratique depuis les années 1960, par l' introduction d' une communauté définie de 8 espèces microbiennes dominantes souriceaux chaque nouvelle génération (modifié la flore SCHAEDLER),veiller à ce que chaque chiot est exposé aux mêmes membres clés de la microflore de la souris. Cette pratique contrôle de la composition du microbiote même lorsque le microbiote est pas la cible principale de l' étude 32, et crée un précédent pour assurer la présence de microbes clés dans une variété de conditions expérimentales.

Pour définir l'influence des microbes sur la drosophile nutrition, plusieurs protocoles pour dériver des lignes de mouche axéniques ont été mis au point, y compris l' hypochlorite dechorionation d'embryons (soit dérivée de novo chaque génération ou maintenu generations par transfert à des régimes alimentaires stériles) et un traitement antibiotique 13. Il y a des avantages à différentes approches, telles que la facilité et la rapidité à la fois du traitement aux antibiotiques et transfert en série, par rapport à un plus grand contrôle des variables confondantes avec de novo dechorionation (par exemple, la densité des oeufs, des microbes contaminants résiduels, les effets hors-cible d' antibiotiques). Indépendamment de la méthode dela préparation, l' introduction d'espèces microbiennes spécifiées aux axéniques embryons permet la culture de Drosophila avec les communautés ( 'gnotobiotiques') définis. Alternativement, imitant l'utilisation de la flore SCHAEDLER, cette communauté pourrait être inoculé aux œufs conventionnellement fixées (en suivant les étapes 6-7 seulement) pour assurer la présence de microbes de traits influençant dans chaque flacon et éviter les complications de microbiote inconsistance. Nous décrivons ici le protocole pour élever axénique et gnotobiotique Drosophila par de novo dechorionation d'embryons, et pour confirmer la présence de taxons microbien introduit ou contaminant.

Protocol

1. Les bactéries Culture (Début ~ 1 semaine avant cueillette des oeufs) Préparer MRS modifié 20 (TMM) plaques et tubes de bouillon (tableau 1). Verser 20 ml de gélose mmrs dans chaque plaque 100 mm de Pétri et laisser refroidir / sécher pendant la nuit, ou 5 ml mmrs bouillon dans 18 tubes à essai en mm. Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis et L. plantarum sur mmrs plaques d' agar. Incuber Aceto…

Representative Results

Élevage réussie de mouches axéniques est confirmé par l' isolement d'aucune CFU de homogénéisations corps entier de D. adultes melanogaster (Figure 1). Alternativement, si le broyat plaqué donne des colonies, les flacons sont contaminés et doivent être jetés. Pour les mouches gnotobiotiques, chacun des quatre isolats bactériens ont été isolés à partir de pools de 5 mâles adultes, ce qui démontre les différences de CFU viables t…

Discussion

La méthode décrite ici est l' une de plusieurs approches pour l' embryon dechorionation 8,11,18,25,26,27, ainsi que d' autres méthodes d'élevage des mouches axéniques, y compris le transfert série des adultes axéniques 18,27 ou un traitement antibiotique 13,18. D' autres méthodes de dechorionation comprennent des lavages à l'éthanol et à réduire les 11,25,26 ou étendent 8 traitement hypochlorite. Étapes de lavage différen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Certains détails de ce protocole ont été optimisés avec l'aide du Dr Adam Dobson, qui a également fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour les National Institutes of Health (SPNI) numéro de subvention R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD et AED). SPNI numéro de subvention 1F32GM099374-01 (PDN), et Brigham Young University démarrage des fonds (JMC, MLK, MV). Les frais de publication ont été soutenus par le Collège universitaire Brigham Young Life Sciences et du ministère des plantes et de la faune Sciences.

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html

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Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).

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