JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

Oppdragelse bananflue<em> Drosophila melanogaster</em> Under Axenic og gnotobiotiske betingelser

Published: July 30, 2016
doi:
10.3791/54219
, , , , , ,
1Department of Plant and Wildlife Sciences,Brigham Young University, 2Department of Entomology,Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics,Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School, 5Biological Sciences,SUNY Oswego

Summary

En fremgangsmåte for oppdrett Drosophila melanogaster henhold axenic og gnotobiotiske betingelser er presentert. Fly embryoer er dechorionated i natriumhypokloritt, overføres aseptisk til sterilt kosthold, og alet opp i lukkede beholdere. Inoculating kosthold og embryoer med bakterier fører til gnotobiotiske foreninger, og bakteriell tilstedeværelse er bekreftet av plating hele kroppen Drosophila homogenates.

Abstract

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Introduction

De fleste dyr er nært forbundet med bakterier ( 'bakterieflora') fra fødsel til død en. Sammenligninger av mikroorganismer fritt ( 'axenic') og mikro-assosiert ( 'vanlig') dyr har vist mikrober påvirke ulike aspekter av dyrehelse, inkludert metabolske, ernæringsmessige, vaskulær, lever, luftveier, immunologiske, endokrine og nevrologiske funksjon 2. Bananflue Drosophila melanogaster er en nøkkel modell for forståelse av mange av disse prosesser i nærvær av mikrober 3,4 og for å studere floraen innflytelse på dyrehelse 5,6. Ingen bakteriearter er til stede i hver enkelt ( "kjerne"), men Acetobacter og Lactobacillus arter numerisk dominere microbiota av både laboratorie oppdrettet og villfanget D. melanogaster. Andre Acetobacteraceae (inkludert Komagataeibacter og Gluconobacter), Firmicutes (for eksempel Enterococcus og Leuconostoc), og Enterobacteriaceae enten er ofte til stede i Drosophila individer ved lav overflod, eller uregelmessig tilstede ved høy overflod 7-12.

Den bakterieflora av Drosophila og pattedyr er ustadige innenfor og på tvers av generasjoner 14,19. Microbiota inconstancy kan føre til fenotypiske støy ved måling microbiota avhengige egenskaper. For eksempel Acetobacteraceae innflytelse lipid (triglyserider) lagring i Drosophila 15-18. Hvis Acetobacteraceae er mer rik på fluer i ett hetteglass enn i en annen 19, kan isogene fluer ha forskjellige fenotyper 20. En løsning på problemet med microbiota ustadighet i mus 14 har vært i praksis siden 1960-tallet, ved å innføre et definert fellesskap av 8 dominerende mikrobielle arter på museunger hver ny generasjon (endret Schaedler flora),sikre at hver valp er utsatt for de samme sentrale medlemmer av musebakterieflora. Denne praksisen kontroller for bakterieflora sammensetning, selv når den bakterieflora ikke er det primære målet for studium 32, og setter presedens for å sikre tilstedeværelse av nøkkel mikrober i en rekke eksperimentelle betingelser.

For å definere påvirkning av mikrober på Drosophila ernæring, har flere protokoller for å utlede axenic snører blitt utviklet, inkludert hypokloritt dechorionation av embryoer (enten avledet de novo hver generasjon eller vedlikeholdes generationally ved overføring til sterile dietter) og antibiotikabehandling 13. Det er fordeler med å ulike tilnærminger, for eksempel letthet og hurtighet for begge antibiotika behandling og seriell overføring, kontra større kontroll over konfunderende variabler med de novo dechorionation (f.eks egg tetthet, rest forurensende mikrober, off-target antibiotika effekter). Uavhengig av fremgangsmåten ifølgeforberedelse, innføring av spesifiserte mikrobielle arter axenic embryoer tillater kulturen i Drosophila med definerte ( 'gnotobiotiske') samfunn. Alternativt, etterligne bruk av Schaedler flora, dette fellesskapet kan bli vaksinert med konvensjonelt lagt egg (Følgende trinn 6-7) for å sikre tilstedeværelse av egenskap-påvirke mikrober i hvert hetteglass og unngå komplikasjoner av bakterieflora ustadighet. Her beskriver vi protokollen for å heve axenic og gnotobiotiske Drosophila av de novo dechorionation embryoer, og for å bekrefte tilstedeværelse av introduserte eller forurensende mikrobiell taxa.

Protocol

1. Kultur Bakterier (Start ~ 1 uke før Plukke egg) Forbered endret MRS 20 (mMRS) plater og buljong rør (tabell 1). Hell 20 ml mMRS agar i hver 100 mm Petri plate og avkjøl / tørke over natten, eller 5 ml mMRS kokes i 18 mm prøverør. Streak Acetobacter pomorum, A. tropic, Lactobacillus brevis, og L. plantarum på mMRS agarskåler. Inkuber Acetobacter over natten ved 30 ° C. Inkuber Lactobacillus anaerobt ved å p…

Representative Results

Vellykket oppdrett av axenic fluer bekreftes av isolering av ingen CFU fra hele kroppen homogenizations av D. melanogaster voksne (figur 1). Alternativt, hvis belagt homogenate gir kolonier, blir ampullene forurenset og bør kastes. For gnotobiotiske fluer, ble hver av de fire bakterieisolater isolert fra bassenger av 5 voksne menn, viser forskjeller i totale levedyktige CFU assosiert med voksne fluer (figur 1). Hver bakteriearter har en distink…

Discussion

Metoden som beskrives her er en av flere tilnærminger for embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, sammen med alternative metoder for oppdrett av axenic fluer, inkludert seriell overføring av axenic voksne 18,27 eller antibiotikabehandling 13,18. Andre dechorionation metoder omfatter etanol vasker og redusere 11,25,26 eller forlenge 8 hypokloritt behandling. Ulike vasketrinn kan hjelpe oppdragelse forskjellige flue genotyper: I en tidligere studie fleste av ~…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Noen detaljer om denne protokollen ble optimalisert med hjelp av Dr. Adam Dobson, som også gitt nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen for National Institutes of Health (FNIH) stipend nummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, ajd, og AED). FNIH tilskuddet antallet 1F32GM099374-01 (PDN) og Brigham Young University oppstartsfond (JMC, MLK, MV). Publiseringskostnadene ble støttet av Brigham Young University College of Life Sciences og Institutt for plante- og dyre Sciences.

Materials

Brewer's Yeast MP Biomedicals, LLC. 903312 http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
Glucose Sigma Aldrich 158968-3KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US
Agar Fisher–Lab Scientific fly802010 https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
Welch's 100% Grape Juice Concentrate Walmart or other grocery store 9116196 http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container Webstaurant Store 999L5032Y http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Translucent Round Deli Container Lid Webstaurant Store 999YNL500 http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
Stock Bottles Genesee Scientific 32-130 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
Droso-Plugs Genesee Scientific 49-101 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Nylon Mesh Genesee Scientific 57-102  https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Plastic Bushing Home Depot 100343125 http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125
Specimen Cup MedSupply Partners K01-207067 http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Repeater M4 Eppendorf 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 ml Centrifuge Tubes Laboratory Product Sales TR2003 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
Food Boxes USA Scientific 2316-5001 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Lysing Matrix D Bulk MP Biomedicals, LLC. 116540434 http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search
Filter Pipette Tips, 300μl USA Scientific 1120-9810 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
Petri Dishes Laboratory Product Sales M089303 https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
Ethanol Decon Laboratories, INC. 2701 http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
Paintbrush Walmart 5133 http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
Forceps Fisher 08-882 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) Walmart 550646751 http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Universal Peptone Genesee Scientific 20-260 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
Yeast Extract  Fisher Scientific BP1422-500 https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
Dipotassium Phosphate Sigma Aldrich P3786-1KG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Ammonium Citrate Sigma Aldrich 25102-500g http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
Sodium Acetate VWR 97061-994 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Manganese Sulfate Sigma Aldrich 10034-96-5 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en&region=US&focus=product
MRS Powder Sigma Aldrich 69966-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US
96 Well Plate Reader BioTek (Epoch)  NA http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html
1.7 ml Centrifuge Tubes USA Scientific 1615-5500 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Filter Pipette Tips, 1000μl USA Scientific 1122-1830 http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 Well Plates Greiner Bio-One 655101 https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/
Ceramic Beads MP Biomedicals, LLC. 6540-434 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434
Tissue Homogenizer MP Biomedicals, LLC. 116004500 http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500
Class 1 BioSafety Cabinet Thermo Scientific  Model 1395 http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due–animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272 (2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117 (2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749 (2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312 (2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860 (2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576 (2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Tags

Drosophila MelanogasterAxenicGnotobioticMicrobiotaSterile DietMRS AgarLactobacillusAcetobacterGrape Juice AgarYeast PasteEgg Collection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koyle, M. L., Veloz, M., Judd, A. M., Wong, A. C., Newell, P. D., Douglas, A. E., Chaston, J. M. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54219, doi:10.3791/54219 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image