Introduction
הטלומרים מגן קצוות כרומוזומליות מן ההיתוך והשפלה סוטים. הטלומרים יונקים מורכב G-עשיר חזרות hexameric, TTAGGG, מתחמי shelterin. רצף חוזרים הטלומרים של נמטודות דומה לאלה של יונקים (TTAGGC). רוב אאוקריוטים לנצל טלומרז להוסיף חזרות הטלומרים למטרות כרומוזומליות שלהם. עם זאת, 10 - 15% של תאים סרטניים לנצל מנגנון עצמאי טלומרז, המכונה אלטרנטיבי הארכת הטלומרים (ALT) 3. בעבר, דיווחנו כי חזרות הטלומרים הרצפים הקשורים אליו, כפי ששמו tAlt, היו מוגברים הטלומרים של קווים מוטנטים טלומרז ששרדו עקרות 2 קריטיות.
אורך הטלומרים נמדד על ידי PCR כמוני או על ידי כתם דרום, מספק אורך ממוצע של הטלומרים הכוללים 4,5,6,7. ספירה קראו חוזרים הטלומרים בנתוני רצף הגנום כולו הוא גם אינדיקטור של תוכן הטלומרים הכולל 8. למרות החטאאורך הטלומרים GLE ניתוח (Stela) עשוי לספק אורך הטלומרים יחיד, זה לא יכול לספק מידע מרחבים של הטלומרים 9. בעוד POT-1 :: חלבון הכתב mCherry מספק את המידע המרחבי של הטלומרים in vivo, זה לא יכול לייצג אורכי הטלומרים פעמיים תקועים, כמו POT-1 הוא הטלומרים חד גדיל חלבון מחייב 10.
בעוד שיטות הנ"ל לספק את המידע הממוצע של רצפים חוזרים, קרינת הכלאה באתרו (FISH) מאפשרת להתבונן בכמויות ובדפוסים המרחבי של רצפים בודדים של עניין בסולם כרומוזומליות. במקום טיהור DNA, רקמות או תאים מקובעים לשמר את המידע המרחבי יליד בדגים. לפיכך, FISH הוא כלי כמותי ואיכותי הן לצורך השגחה של רצפים חוזרים הפרט, כגון חזרות הטלומרים.
פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה עבור זיהוי סימולטני של שני teloחזרות גרידא אחרות המבוססות על שיפורים מן השיטות שתוארו קודם לכן 11,12. ג זחלים או מבוגרים elegans הם אורגניזם רב-תאי עם תאים מובחנים מאוד. ההטרוגניות של תאים מעכבים על ניתוח כמותי של מספר רב של נקודות הטלומרים. כדי למקסם את מספר התאים נתחו, עובר מבודדים להפיץ בשקופיות מצופות polylysine לדגים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול גם להיות משולב עם immunofluorescence.
כהוכחה כי הפרוטוקול עובד, אנו מראים כי אפשר לצפות ולכמת שני רצפים חוזרים שונים. בדיקת DNA נגד TALT1 נוצרה עם PCR פשוט שילוב digoxigenin-dUTP. ואז זה בדיקה TALT1 ו בדיקת PNA הטלומרים שכותרתו קרינה היו הכלאה זמנית. בהמשך לכך, digoxigenin זוהה על ידי שיטות immunofluorescence הקנונית. אנו מציגים כאן את התמונות נציג שבו TALT1 colocalized עם הטלומרים ב TRT-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בדיקות תיוג עם Digoxigenin-dUTP ידי PCR
- בצע תיוג PCR עם 10x תמהיל dNTP המכיל digoxigenin-dUTP כפי שתואר לעיל 13.
- לטהר מוצר PCR עם טיהור ספין-טור על פי ההוראה של היצרן.
- אם החללית היא קצרה יותר מ -200 נ"ב, להסיר digoxigenin-dUTP חינם עם כרומטוגרפיה ספין-טור מתערובת התגובה ולא טיהור ספין-טור.
2. הכנת שקופיות מצופות polylysine
הערה: התהליך כולו אורך כ -2 שעות. רוב השלבים מתבצעים בטמפרטורת חדר למעט שלב הייבוש.
- ניקוי שקופיות
- מניחים את השקופיות במיכל פלסטיק ולשטוף את השקופיות בקצרה עם מים מזוקקים (DW). הסר את המים ולמלא את המיכל עם DW המכיל נוזל לניקוי זכוכית 1%.
- להתסיס את השקופיות במשך 15 דקות ב 50 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את השקופיות עם DW 3פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
- שטפו את השקופיות עם אתנול 70% במשך 15 דקות עם תסיסה. מחק 70 אתנול% ומקום השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש במשך 15 דקות.
- ציפוי polylysine של שקופיות זכוכית רבות גם
הערה: ציפוי polylysine זכוכית שקופית הוא צעד חשוב, שכן הוא מספק את ההידבקות המדגמת לאורך כל ההליך המכתים. גרוע שקופיות מצופות תגרומנה לאובדן של מדגם.- לדלל את הפתרון polylysine המניה ל -0.01% (w / v) במים מזוקקים. הוסף 20 μl של% 0.01 בדילול (w / v) polylysine אל הבארות של שקופיות זכוכית נקיות.
- דגירת שקופיות הזכוכית במשך 5 דקות ב RT.
- מניחים את השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש 1 hr.
- אחסן את השקופיות polylysine בתיבת אבק חינם.
3. קיבוע של תולעים בשקופית זכוכית (איור 1)
- עוברים הכנות לקראת FISH
הערה: תולעים קציר לפני כל tהוא מחיידקים שבמזון הוא נצרך על ידי צפיית תקשורת הצמיחה תחת מיקרוסקופ. רעב מפחית ייצור ביצים של תולעים בוגרות ומגביר בקיעת ביצה. שיטות מפורטות מתוארות 14,15.- לגדל את התולעים 50 מ"מ פטרי צלחת פי שיטות סטנדרטיות 14.
- אחרי כל אוכל החיידקים הוא נצרך, לחתוך את התקשורת אגרה רבעון עם מרית. לעקר את המרית לפני החיתוך על מנת למנוע זיהום.
- מכניסים את כל פיסת אגר על צלחת התקשורת צמיחה נמטודות 100 מ"מ (NGM). להפוך את הפיסה אגרה במהופך עבור התולעים להגיע מזון חיידקים הטרי.
- לאחר 48 עד 72 שעות, לאסוף את התולעים עם חיץ M9. להוסיף 3 - 5 מ"ל של חיץ M9 על צלחת NGM. חיץ פיפטה M9 על פני השטח של NGM לשטוף את התולעים.
- אסוף את הנוזל עם תולעים ולהוסיף שפופרת 15 מ"ל.
הערה: אם ישן לכלוך אגר לאחר הקציר, צנטריפוגה התולעים בתמיסת 30% סוכרוז. בעוד ופסולת pelleted, תולעים לצוף עלהשטח. - הוסף חוצץ M9 לפצות את נפח עד 15 מ"ל. גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות ולהסיר את רוב למאגר M9. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר.
הערה: אם התולעים עדיין צפו לאחר צנטריפוגה, להגדיר את רמת הבלם של צנטריפוגות כדי מעריכה = 1. - חיץ לשאוב M9. הוסף פתרון הלבין את התולעים. לפי 0.5 מ"ל של תולעים, להוסיף 6.5 מ"ל של DW, 2 מ"ל של תת-כלורי, 1 מ"ל של 5 M KOH.
- דגירה תולעים עם נדנדה ב RT במשך 3 דקות ב 50 סל"ד. תולעים וורטקס למשך 15 שניות כדי לגזור את התולעים מכאניות ולחשוף את הביצים.
- שים את הצינור תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהלך לבן. ודא כי תולעים נחתכים בחצי וביצים משתחררות. כאשר רוב של הגוף הבוגר נמס, להוסיף למאגר M9 לפצות את נפח עד 15 מ"ל.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות. לשאוב רוב M9 ולהוסיף חיץ M9 טרי לפצות את הנפח עד 15 מיליליטר. צעד חוזר על לשטוף 3 פעמים.
הערה:הימנע משימוש כמות מוגזמת של תולעים, כפי שהם לעכב את התהליך הלבן. שמור את זמן התגובה הכולל פחות מ -8 דקות עד בכביסה. יתר מולבן ביצים לייצר autofluorescence החזק. - להוסיף פוספט בופר עם polysorbate-20 (PBST) עד 200 μl ו -200 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) כדי להפוך 2% PFA.
זהירות: מאז PFA הוא מסרטנים, ללבוש ביגוד מגן, כפפות מגן עין לפני שימוש PFA. - הוסף 40 μl של ביצים 2% PFA על הבאר של שקופית מצופה polylysine.
- מניחים את השקופיות בתא לח דגירה במשך 15 דקות ב RT. סגור את בתא הלח מייד אחרי המגלשות ממוקמות בתוך.
הערה: הביצים ליישב לתחתית של שקופית בעת היותו קבועה.
- הכנת בלוטות המין גזור לדגים
- תולעים בוגרות קציר גדל על 50 מ"מ NGM צלחת על ידי pipetting 1 מ"ל של חיץ M9. תולעים קציר לפני מחיידקים שבמזון ייגמרו.
- לשטוף את התולעים מכל שנינות חיידקיםh חיץ M9, 2 פעמים.
הערה: שיירי חיידקים עלולים להפריע בלוטות מין הגזורים יידבקו שקופיות מצופות polylysine. - גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה ב 300 x ז. הסר M9 ולהעביר את התולעים לצלחת NGM ריק ידי micropipette.
- הוסף 30 μl של חיץ M9 המכיל levamisole 2 מ"מ על באר שקופיות מטופלים polylysine.
- הוסף 500 μl של חיץ M9 לצינור 1 מ"ל. השתמש חיץ זה להעביר את התולעים על ידי פיפטה בפה.
- מלאו את קצה פיפטה בפה עם חיץ M9 ידי הצבת נימי בצינור 1 מ"ל המכיל למאגר M9.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, הכניס את קצה הפה פיפטה ממש מול ראש פיפטה בפה תולעת וגרור מבוגר כך שהראש של תולעים נכנס פיפטה בפה. לאחר ראש התולעים נכנס הקצה, הגוף כולו של תולעת יצויר אל הקצה.
- מעבירים את התולעים לשקופית מצופה polylysine באמצעות פיפטה בפה.
- באמצעות סכין גילוח, לחתוך שלf הראש או קצה הזנב של תולעים בשקופית. כאשר התולעת הוא חתך, בלוטות המין תצוץ. בלוטות המין ידבק שקופיות.
- הכן לפחות 30 תולעים היטב אחד. עוד בארות יכולות לשמש 30 תולעים אחרים.
- שים את השקופית בתא לח לשאוב את למאגר M9 עם פיפטה בפה.
- תקן את המדגם על ידי הוספת 20 μl של 2% PFA ב RT במשך 15 דקות בתא לח.
4. קיבוע ו Permeabilization
- הוסף בלוק אלומיניום על קרח יבש ולאחסן אותו במקפיא עמוק (-80 ° C). מתנול אצטון אחסן -20 ° C.
- לאחר שלב קיבעון PFA 3.1.15 או 3.2.11, להסיר מקבע באמצעות micropipette עוזב ~ 5 μl של מקבע.
- במילים אחרות שקופיות מצופה polylysine בשקופית המדגם. הסר את מקבע עם מגבת נייר אם הפתרון הוא מוגזם. אל תזיז את השקופיות פעם הם תקועים יחד.
- להקפיא את השקופיותעל בלוק אלומיניום עבור 15 דקות לפחות.
הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים. - בעוד השקופיות מוקפאות, הכניס את הצנצנות המכילות מתנול קר אצטון על קרח.
- קח את השקופיות החוצה ולסובב אותם להקפיא-לפצח את המדגם. מחק את השקופית העליונה. מיד להשרות את השקופית לתוך מתנול קר קרח למשך 5 דקות.
- העברת שקופיות אצטון קר כקרח במשך 5 דקות.
- שטפו את השקופיות 3 פעמים עם PBST במשך 5 דקות כדי להסיר מקבע שיורית. המשך לשלב הבא או לאחסן את השקופיות אתנול 100% ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים.
כלת 5. של תאים קבועים
- הוסף 20 μl של פתרון RNase (PBST המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל RNase). דגירת השקופיות בתא הלח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
- לשטוף את השקופית פעמיים ציטראט מלוחים ונתרן 2x עם polysorbate-20 (2x SSCT) במשך 15 דקות כל אחד.
- הוסף 20μl של פתרון הכלאה וקבע בתא לח בחממה 37 מעלות צלזיוס. אחרי השעה 1, להסיר את פתרון הכלאה ידי pipetting.
- לפני הסרת פתרון הכלאה, להכין את החללית. אם חללית גדילים כפולה DNA, לפגל חלליות על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על גוש יבש. לאחר חימום, לקרר את החללית על בקצרה קרח.
- הוסף 10 μl של פתרון הכלאה המכיל בדיקות המדגם. עבור בדיקת PNA, ריכוז שימוש ביחס של 1: 2,000 ועבור בדיקת DIG שכותרתו, ריכוז שימוש ביחס של 1: 200. מכסים את המדגם עם מכסה זכוכית.
- לשים מגבת נייר ספוגה במים על הגוש החום (80 מעלות צלזיוס). לשים כיסוי קופסת פלסטיק על גוש חום כדי לשמר את הלחות והטמפרטורה.
- לאחר הטמפרטורה של גוש החום התייצבה (עד 80 מעלות צלזיוס), במקום להחליק המדגם על מגבת נייר המחוממת לכסות את הדגימות עם כיסוי קופסא הפלסטיק. לפגל את המדגם עבור 3 דקות.
- Incאובאטה השקופיות בתא לח לילה בשעה 37 ° C.
6. מתרחץ Immunofluorescence
- לחמם את הפתרון לשטוף הכלאה (2x SSC, 50% לפוראמיד) ל -37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את המדגם ב PBST פעמים ב RT במשך 5 דקות. הסר את מכסה הזכוכית.
- לשטוף את המדגם בפתרון לשטוף הכלאה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לשטוף את שקופית המדגם ב PBST 3 פעמים ב RT. הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתא לח ב RT.
- הוסף 20 μl של פתרון חסימת דגירה במשך שעה 1 ב RT בתא לח.
- הסר פתרון חסימת ולהוסיף FITC פתרון נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות (1: 200) במשך 3 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
שמה ותצפית 7.
- לשטוף את השקופית מדגם עם PBST 2 פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
- הוסף 10 μl של פתרון הרכבה עם DAPI. החזר את מכסה הזכוכית ולחץ בעדינות. הסר פתרון עודףעם מגבת נייר.
- כדי למנוע אידוי של פתרון גובר, לאטום את הקצוות של זכוכית המכסה עם לק.
- שימו לב תחת מיקרוסקופ confocal. אל תכלול עובר עם רקע גבוה. דגש על תחום בעל 4 - 20 גרעינים.
- צלם תמונות על פי ההוראה של היצרן עם עדשה אובייקטיבית 100X.
הערה: Excite המדגם עם לייזר 405 ננומטר עבור DAPI, עם 555 ננומטר לייזר עבור Cy3, עם 488 ננומטר לייזר עבור FITC.
8. כימות איתותים הטלומרים
הערה: כימות נעשה כפי שתואר לעיל 16. כל התמונות כי הם להיות לעומת צריך לקחת עם אותה הגדרה כולל זמן חשיפה ומקור אור.
- לייצא את התמונה .tif בפורמט.
- הורד והתקן את תוכנת ניתוח תמונה.
- הפעילו את התוכנה וניתוח תמונה ולחץ מסכים כפתור.
- לחץ על לחצן פתוח. פתח את התמונות עם FISH הטלומרים ידי לחיצה כפולה על קובץ התמונה.
- נְקִישָׁה[עריכה] - [אזור עיבוד בחר], באזור הנבחר של ריבית על ידי שמאל לחץ וגרירה. אל תכלול את כל המכתים הלא ספציפי.
- לחץ [מידה] - [נקודת צפיפויות אופטיות], בחר בערוץ עם אות הטלומרים והזן את שם הקובץ כדי לשמור את התוצאות בקובץ .txt.
הערה: העמודה של התוצאות לפי הסדר הבא: הקרינה של נקודה, עוצמת רקע של ספוט שטח של המקום. - הצב את הספרות ולחסר עוצמת רקע של מקום מן הקרינה של נקודה. הערכים כעת ניתן לנתח סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זה היה בעבר דווח כי ניצול ALT יכול לצאת מן מוטציה טלומרז מחסר, TRT-1 (ok410), בתדירות נמוכה ידי שכפול מקומי פנימי 'תבנית של ALT' (tAlt) רצפים לצורך תחזוקה הטלומרים 2. באמצעות בדיקת PNA, הצלחנו לחזות הטלומרים ב בלוטות המין הגזורות (איור 2 א). האות הטלומרים הקלוש זוהה הוא TRT-1 (ok410) וניצולת ALT. האות מטושטשת היה חפפו רק עם DAPI, דבר המצביע על כך שהם לא יכולים להיות autofluorescence. הטלומרים דמויים ביניים חוזרים (ITR) הוא ציין באופן עקבי assay TRF בחקר ג elegans הטלומרים 4,10. בהתחשב סגולי גבוהה של חללית PNA, הם צפויים להיות ITR התפזר לאורך הגנום.
מספר כתמי הטלומרים היה כ -9 גרעין pachytene ב TRT-1 (ok410).במחקר הקודם, 12 מוקדים נצפו על ידי POT-1 :: חלבון mCherry, אשר נקשר ל- DNA הטלומרים התקועים היחיד 10. מרבים של 24 מוקדים לכל גרעין נצפו עובר הסוג הבר 17. התוצאה מראה כי שיטת הכתב mCherry עדיף לניסוי שבו מספר הטלומרים צריך לספור. עם זאת PNA FISH הוא מסוגל לזהות DNA הטלומרים פעמיים תקועים כמו גם DNA הטלומרים חד גדילי בפרופורציה עם אורך הטלומרים. לעומת זאת, מספר המקומות הטלומרים היה כ 7 ניצול ALT, אשר התמזג הכרומוזומים (N = 3) 2. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם התחזית כי כתמים הטלומרים יהיו 6 ניצול ALT. הגענו למסקנה כי עוצמת האות של ניצול ALT הייתה מספיק כדי לשים לב.
אות הטלומרים היה colocalized עם TALT1 ב הניצול ALT, דבר המצביע על כך TALT1 משמש כתבנית עותק הטלומרים בהעדר telomerase (איור 3). אות הטלומרים של ניצולי ALT גדל בהשוואה לזו של מוטציה הורית TRT-1 (ok410), המציין כי הטלומרים נשמרו וחסון בשורדי ALT ללא טלומרז (איור 4). האות של חללית PNA הייתה גדולה יותר מזה של תווית בדיקה-digoxigenin (איור 4). בדיקות עיצוב עם oligomer PNA עלולות לגרום אות חזקה יותר תיוג digoxigenin.
איור 1:. סקירה כללית של ניסוי FISH ביצים נקצר על ידי תולעים בוגרים הלבנה ומותק 2% PFA בשקופית מצופה polylysine. דוגמאות הן להקפיא-סדוק permeabilized עם מתנול אצטון לחדירת בדיקה. בדיקות מתווספות מדגם הכלאה בין הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. החללית שכותרתו Digoxigenin הוא זוהה על ידי immunofluorescence. הדגימות הם צילמו ואז quantifieD על ידי תוכנת ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הטלומרים דגים הגזורים בלוטות המין (א) הטלומרים (אדום) זוהה על ידי Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 בקצה הדיסטלי של בלוטות מין (ראש החץ). עוצמת ניצול ALT הוא גדול יותר מזה של TRT-1 (ok410). תמונת Z- מחסנית ניתנה עם הקרנת מקסימלית. גרעינים שמציינים חץ לבן הוא מוגדלים על הפינה הימנית העליונה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (ב) מספר נקודות הטלומרים לכל גרעין בשלב pachytene נמדד על ידי בדיקה ויזואלית. N = 50. ברי שגיאה, SEM. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. הטלומרים ו TALT1 הדגים עוברים תמונה מייצגת של הטלומרים (אדום) ו TALT1 (ירוק) FISH. הטלומרים ואת חללית TALT1 היו הכלאה עוברת בו זמנית. ה- DNA היה counterstained עם DAPI (כחול). סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. כימות FISH נתונים הטלומרים ועוצם TALT1 מתרשים 3 כומתו בתוכנת ניתוח תמונה (מתנת ד"ר פיטר Lansdorp). מקום כל היה לכמת עם OV רמת סףאה 15 להוציא הלא ספציפי רקע. T-test שימש להערכת מובהקות סטטיסטית. (* P <0.001). ברי שגיאה, SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא הפשטות של ההליך ללא נזק בולט את המורפולוגיה של המבנה התאי. צעדים אחדים היו אופטימיזציה עבור ג elegans FISH בפרוטוקול זה. השלבים הקריטיים לדגים מוצלחים כוללים תיוג של בדיקות, קיבעון של עוברים וחדירים. שיטת תיוג Digoxigenin-dUTP מספקת שיטת תיוג קלה לשימוש על ידי PCR או ניק-תרגום. כדי לתייג רצף יעד ארוך, ניק-תרגום הוא מועדף. במקרה זה, חלליות צריך להיות מעוכל עם אנזים הגבלה מתאים כדי להקל על החדירה של בדיקות. התג ביוטין-dUTP אינו מומלץ בגלל בדיקות שכותרתו ביוטין מיוצרות סכום עודף של אות רקע מן הציטופלסמה. למרות מגיב חסימה ביוטין אנדוגני זמין מסחרי, זה לא היה ניסיון.
פרוטוקול זה משתמש עוברי מבודד כדי להגדיל את הצפיפות של תאי כימותים יעילים. גרעיני מעיים של C. elegans הם גדולים, והם נמצאים polyploid, אשר תורמים מספר מוגזם ועוצמת כתמים הטלומרים בהשוואה לשאר גרעינים סומטיים. מסיבה זו, התולעת כולו אינה מתאימה כימות של הטלומרים ב C. elegans. לעומת זאת, עובר מתאימים להערכת אורך הטלומרים כפי שהם מספקים תאים הומוגנית ללא השפעת polyploidy.
פרוטוקול זה משתמש 2% מקבע PFA כי עבד מצוין לדגים הטלומרים. למרות glutaraldehyde מדווח לגרום אות רקע נמוך קיבעון יותר ב RNA הכלאה באתרו, glutaraldehyde גדל autofluorescence 18 באופן משמעותי. רקע עודף זה לא בוטל לאחר טיפול של borohydride נתרן, אשר מפחית קבוצת אלדהיד unreacted. מסיבה זו, glutaraldehyde לא היה בשימוש. אם יחס אות לרעש נמוך, זמן של prehybridization יכול להתארך עד כמה שעות כדי לחסום אתרים הלא ספציפיים מחייבים. בבנוסף, זמן של כביסה מחמירה ניתן להגדיל להקטין את רמת רקע.
טכניקה מכתימה ב סי אלגנס יכול להיות אתגר עבור טיפול permeabilization נכון. ג elegans מכיל שלד cuticular עבה אשר מעכב חדירת נוגדנים בדיקות. שיטה מכתימה נוגדן מסורתי כרוכה בטיפול collagenase, אשר דורש הרבה זמן תהליך האופטימיזציה. השיטה חדירה האנזימטית גם נזקים המורפולוגיה של תולעים בתמורה של יעילות החדירה. Freeze-סדק וטיפול מתנול-אצטון שמש להקל על חדירת בדיקה. Freeze-הסדק הוא פשוט ומהיר בהשוואה לטיפול chitinase או yatalase 19. התייבשות או התייבשות של סדרת מתנול לא נראה להשפיע על איכות FISH. צעדים אלה היו פשוט יותר בפרוטוקול זה. למרות זאת נמסרה כי עיכול proteinase K נדרש עבור RNA כלאה באתרו19, הבדל ברור לא נצפה בין תוצאות FISH הטלומרים עם ובלי טיפול K proteinase. בנוסף, להקפיא פיצוח של עוברים בתנאי שיטה קלה לשימוש המאפשר הדמיה תאים רבים בעת ובעונה אחת על מטוס בודד מוקדי לניתוח כמותי גדול.
באמצעות בדיקת PNA, אות הטלומרים הוגדלה באופן משמעותי בהשוואה לזו המתקבלת עם בדיקת DNA. זה יכול להיות בגלל זיקה מחייבת גבוהה עבור היעד שלה משלימים גודל קטן יותר שלה (3 חוזרים לעומת 4 חוזר). Fluorescently שכותרתו בדיקת PNA גם ישירות נקשרת היעד שלה, מזעור השלבים הבאים. זיקה חזקה מתוחזק בשלבי immunofluorescence הבאים הופכת את הפוסט-הקיבעון מיותר, אשר ניתן למנוע רעש רקע.
עם זאת, מספר מגבלות קיימות בטכניקה זו. האחת היא כי permeabilization צעד פוגע המורפולוגיה מעט במחיר של חדירת בדיקה יעילה. טיפול של בלוטת מיןים ועובר עם מתנול אצטון מעווה מעגלי של גרעינים לעומת קבוצת ביקורת. בניסויים הדורשים מורפולוגיה שמורה להפליא, שיטת permeabilization שונה צריכה להיות ניסיון. נוסף הוא כי האות הטלומרים הוא לכמת ביחידות כלשהן. זאת בעיקר בשל הבדלים בין ניסויים עצמאיים. דנ"א ריבוזומלי עשוי להיחשב בקרה פנימית לנרמל כל דגימה. ניתן למצוא עוד שיטות שימושיות בהתייחס 20.
פרוטוקול FISH הטלומרים פשוט מתואר כאן, מחייב צעדים מינימאליים. צעדים רבים מופחתים לניתוח של כמות גדולה של עוברים. עם זאת, שינוי נוסף יכול להתבצע עבור אות חזקה, כגון טיפול chitinase לחדירה, וניסויים חדשניים אחרים. בשילוב עם שיטת תרבית תאים, הדמיה סופר-רזולוציה עשויה להיות אפשרית. פרוטוקול זה עשוי לעזור כדי לגלות את מנגנון תחזוקת הטלומרים רומן ב C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
